硬骨模型日本青鳉鱼（Oryzias latipes）中的精子收集和计算机辅助精子分析
2022年10月6日
本文介绍了两种从小型模式鱼青鳉鱼（Oryzias latipes）收集精子的快速有效方法，以及使用计算机辅助精子分析（CASA）可靠地评估精子质量的方案。
这种技术能够对小型模式鱼日本马达卡的小米进行取样，并以一致的方式调查其质量。特别是通过腹部按摩收集精子允许对同一条鱼重复采样，因为这种方法不是侵入性的。此外，该技术可应用于马达卡精子冷冻保存。
精子质量是受精成功的重要指标，因此是生态和整体生产生理学研究中分析的重要参数。首先，准备一块柔软的保持海绵，将其切成适合培养皿。在海绵的中间切一条直线，这条直线足够长，可以将鱼的腹侧向上。
麻醉鱼后，用纸巾轻轻擦拭鱼的腹部。将鱼放在潮湿的保持海绵的槽中，腹侧朝上，使其鳃暴露于海绵中的麻醉液中。如果泄殖腔周围的区域潮湿，请用一次性纸巾轻轻擦干腹部下侧。
在解剖显微镜下，将带有吸气管的微量移液管放在鱼的泄殖腔上。现在按摩鱼的腹部，用钝端光滑的镊子轻轻挤压，从尾部到尾部运动。为了回收鱼，在将鱼送回水族箱系统之前，将其从海绵中释放到先前准备好的回收水中。
使用吸气管组件将收集的小米转移到含有预热活化溶液和移液器溶液的管中数次。在分析前，通过轻弹试管轻轻地匀浆稀释的精子。如前所述，对鱼实施安乐死后将其干燥，并将鱼置于解剖显微镜下，其左侧朝上。
使用小解剖剪刀，从泄殖腔背侧剪下皮瓣，然后穿过肋骨到鳃，露出内脏。找到睾丸并用细镊子切割两端的附件。取出睾丸并将其转移到含有预热活化溶液的准备好的管中。
用镊子将睾丸压在管子的侧面几次以释放精子，这可以通过溶液略微混浊的外观来可视化。要开始分析，请打开精子分析软件并选择运动模块。在软件中为所有参数设置配置。
将预热的一次性20微米计数室载玻片放在显微镜下的加热载物台上，设置为27摄氏度。将样品移液到载玻片上的腔室中，直到它充满，但不要过量填充。小心地擦去腔室入口处多余的样品，以防止溶液中细胞的漂移移动。
选择分析以在显微镜下观察样品。确保显微镜聚焦，然后选择再次分析以记录现场的精子。将载玻片移动到框架中样品的新区域，并对三到五个不同的视野重复该过程，避免气泡、细胞团或伪影。
要查看结果，请选择结果，然后双击字段以可视化单个字段或手动检查是否有任何错误标记或未跟踪的精子。如有必要，右键单击单个精子以重新标记运动。在本研究中，使用计算机辅助精子分析来记录各种速度和运动参数。
计算值包括直线度指数、线性指数和摆动。活化溶液的渗透压会影响睾丸解剖精子的运动性。精子在水族箱水中是不可动的，但在HBSS中是可动的，渗透压高和低。
然而，与高渗透压浓度溶液相比，每千克36毫渗透压时运动性显着降低。精子收集方法也影响了精子运动，其中与腹部按摩相比，睾丸解剖方法中的精子运动性明显更强。此外，更高百分比的细胞是渐进的，更多的细胞是中等或快速移动的。
与27摄氏度储存相比，储存在4摄氏度或冰上的精子的百分比运动性和渐进性显着更高。环境和住房条件也略微影响了精子活力。产卵后和产卵前收集的精子在精子活力方面没有显着差异。
一个月没有雌性的雄性表现出很高的运动性，但差异微不足道。对于通过腹部按摩收集精子，需要训练以学习适当的镊子压力和运动，并避免粪便污染。例如，在生态毒理学研究中，这种技术对于研究各种污染物对男性生育能力的影响非常有用，其中青鳉鱼是一种常用的模型。
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概述
本研究提出了两种从小型鱼类模型物种红绿灯鱼（Oryzias latipes）中收集精子的高效技术。讨论的方法聚焦于腹部按摩和睾丸解剖，以及使用计算机辅助精子分析（CASA）评估精子质量的协议。
研究的主要组成部分
研究领域
- 生殖生物学
- 生态毒理学
- 鱼类生理学
背景
- 红绿灯鱼是进行生育研究的常用模型生物。
- 精子质量对成功受精至关重要。
- 非侵入性方法对于重复采样至关重要。
所用方法
- 通过腹部按摩和睾丸解剖收集精子
- 模型生物：红绿灯鱼（Oryzias latipes）
- 计算机辅助精子分析（CASA）
主要结果
- 精子运动性随所用收集方法而显著变化。
- 环境条件影响精子质量，尽管某些因素没有显著影响。
- 通过睾丸解剖相比腹部按摩，实现了较高的运动性水平。
结论
- 该研究为红绿灯鱼的精子收集和质量评估提供了可靠的方法。
- 这些技术可以推进研究污染物对雄性生育影响的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of sperm quality in Japanese medaka enables objective evaluation of male fertility, supporting mechanistic studies in reproductive biology and ecotoxicology. Computer-assisted sperm analysis (CASA) provides standardized, reproducible outputs critical for early discovery and target validation in vertebrate fertility research. These capabilities facilitate predictive confidence and risk-adjusted decision-making in translational and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of environmental, physiological, and genetic factors affecting male fertility.
- Supports functional validation of reproductive targets through objective sperm quality metrics.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating variables impacting motility and progressivity.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven fertility studies.
Screening & Assay Development
- Delivers validated protocols for sperm collection and analysis in small vertebrate models.
- Standardizes motility and progressivity measurements for assay reproducibility.
- Enables scalable, repeatable workflows for compound or environmental screening.
- Supports reliable evaluation of toxicological or pharmacological impacts on reproductive endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sperm quality metrics with disease-relevant and environmental exposure models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of reproductive toxicity or efficacy.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidate interventions or environmental assessments.
- Strengthens predictive value for cross-species translational research in vertebrate fertility.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized sperm quality assessment in small fish models, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Objectively quantifies sperm motility, progressivity, and concentration to clarify reproductive pathways.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for evaluating environmental or compound effects on fertility.
- Analytics: Generates velocity, linearity, and motility indices for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges environmental, physiological, and genetic studies to preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for fertility assessment in diverse small vertebrate models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of sperm analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in fertility and ecotoxicology pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of reproductive and environmental research programs.
Implementation Considerations
- Requires training in non-invasive and dissection-based sperm collection techniques.
- Needs access to computer-assisted sperm analysis instrumentation and software.
- Demands cross-team standardization of sample handling and analysis parameters.
- Adaptable to other small teleost or vertebrate models with protocol optimization.
- Careful technique is necessary to avoid sample contamination and ensure data integrity.
