Name: 人细胞中HSV-1感染后RIPK3和MLKL的ZBP1依赖性磷酸化的免疫荧光荧光放大的酪胺信号扩增 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学习酪胺信号扩增技术检测HSV-1感染后磷酸化RIPK3和MLKL的方法。该方案利用HT-29细胞模型显著提高坏死性凋亡标志物的检测灵敏度，为ZBP1依赖性细胞死亡研究提供可靠工具。

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我们感谢VIB生物成像中心&#160;提供的培训、支持以及仪器平台的使用权限。J.N. 获得了佛兰德研究基金会（FWO）博士奖学金的资助。J.M. 课题组的研究得到了奥德修斯II项目（G0H8618N）、EOS INFLADIS（40007512）、佛兰德研究基金会（FWO）青年研究基金（G031022N）、CRIG青年研究者概念验证基金以及根特大学的资助。P.V. 课题组的研究得到了EOS MODEL-IDI（30826052）、EOS INFLADIS（40007512）、FWO高级研究基金（G.0C76.18N、G.0B71.18N、G.0B96.20N、G.0A9322N）、梅瑟瑟姆计划（BOF16/MET_V/007）、iBOF20/IBF/039 ATLANTIS、抗癌基金会（F/2016/865、F/2020/1505）、CRIG和GIGG合作项目以及VIB的资助。

1. 生物素化酪胺的制备
<ol>
	<li>从生物素-酪胺开始制备生物素化酪胺。配制10 mM储存液时，将3.6 mg生物素-酪胺溶解于1 mL DMSO中。为保持其质量，将溶解后的产物分装后于−20 °C保存。</li>
</ol>
2. 培养 HT-29 细胞的维持
注意：表达 ZBP1 的 HT-29 细胞系通过携带编码人源 ZBP1 基因的慢病毒载体转导而获得27。
<ol>
	<li>将表达 ZBP1 的 HT-29 细胞培养于添加了 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和 10% 胎牛血清的 McCoy's 5A 培养基中（以下简称完全培养基），并在 37 °C、5% 二氧化碳的培养箱中维持培养。建议使用低代次细胞（低于 10 代）。细胞复苏后需在实验开始前至少恢复培养 5 天。</li>
	<li>为使细胞从培养瓶中脱落，先吸去培养基，用 5 mL 预热至 37 °C 的 PBS 洗涤细胞。随后向细胞中加入适量预热至 37 °C 的胰蛋白酶/EDTA 溶液（分别为 0.05% 胰蛋白酶和 0.032% EDTA）（T75 培养瓶加 2 mL，T175 培养瓶加 3 mL）。</li>
	<li>将细胞在 37 °C、5% 二氧化碳的培养箱中孵育最多 10 分钟。之后轻敲培养瓶，并在显微镜下使用 4x–20x 物镜观察细胞是否已从瓶壁脱落。</li>
	<li>若细胞未完全脱落，继续在 37 °C 下孵育 5 分钟。当细胞脱落后，向培养瓶中加入 6 mL 完全培养基以终止酶反应。</li>
	<li>将细胞悬液收集至 15 mL 离心管中。使用&#160;台盼蓝染色法计数细胞并评估其活力；建议稀释比例为 1:5。只有当细胞活力超过 90% 时，方可继续进行实验。</li>
</ol>
3. 启动实验、细胞接种与细胞刺激
<ol>
	<li>在允许高倍显微镜观察的1 cm²表面积培养板中，用完全培养基接种90,000个表达ZBP1的HT-29细胞。每孔终体积为200 µL。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5%二氧化碳条件下孵育过夜。请注意，需额外接种若干孔用于染色对照，具体说明见步骤5.6。</li>
	<li>当细胞融合度达到70%–80%时，向细胞中加入诱导坏死性凋亡的刺激物。此处使用HSV-1 ICP6mutRHIM感染细胞（感染复数[MOI]为5，定义为斑块形成单位[pfu]除以细胞数量；pfu通过Vero细胞上的斑块实验定量），感染时间为6 h、8 h或10 h。</li>
	<li>作为诱导坏死性凋亡的阳性对照，使用含有30 ng/mL TNF、20 µM广谱caspase抑制剂zVAD-fmk和5 µM SMAC模拟物BV6的坏死性凋亡诱导混合物刺激细胞4 h。</li>
	<li>作为p-RIPK3（S227）染色的阴性对照，加入GSK'840（1 µM）以抑制RIPK3激酶活性，防止S227位点的自磷酸化。理想情况下，应在未处理条件以及坏死性凋亡刺激后均加入该抑制剂。抑制剂可与病毒感染同时加入。</li>
	<li>所有刺激处理均使用预热至37 °C的完全培养基配制，每孔终体积为200 µL。</li>
</ol>
4. 细胞固定
<ol>
	<li>吸去培养基，用 200 µL 1× PBS 洗涤细胞。然后向细胞中加入 150 µL 4% 多聚甲醛（已预平衡至室温），于室温孵育 30 分钟。 
	注意：如果使用的细胞容易脱落，可按以下方法优化固定步骤。从孔中吸去 100 µL 培养基，使孔内剩余体积为 100 µL。向细胞中加入 100 µL 4% 多聚甲醛，于室温孵育 5 分钟。随后吸去孔中的培养基/固定液，更换为 150 µL 4% 多聚甲醛，再于室温孵育 20 分钟，以确保细胞完全固定。</li>
	<li>固定完成后，吸去 4% 多聚甲醛，用 200 µL 1× PBS 洗涤细胞 3 次。样品可在过量（&#62;200 µL）的 1× PBS 中于 4 °C 保存过夜，直至后续处理。</li>
</ol>
5. 透化与一抗染色
<ol>
	<li>吸除 PBS，加入 100 µL 通透缓冲液（含 0.5% Triton X-100 的 PBS），室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>移除通透缓冲液，随后用 100 µL 洗涤缓冲液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）洗涤各孔。将成像腔室置于倾斜式实验室摇床上，室温孵育 5 分钟（每分钟 20–30 次摆动）。</li>
	<li>为防止一抗的非特异性结合，加入 100 µL 封闭液，室温孵育 2 小时。或者，可用含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS 代替，室温封闭 1 小时。</li>
	<li>用 100 µL 洗涤缓冲液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）洗涤各孔 3 次，每次室温在倾斜式实验室摇床上孵育 5 分钟。</li>
	<li>吸除洗涤缓冲液后，向成像腔室中加入一抗，4 °C 过夜孵育。每孔加入终体积 100 µL 以覆盖整个孔面。在 4 °C 过夜孵育期间，切勿将成像腔室置于倾斜式实验室摇床上。 
	注：抗 p-MLKL（S358；稀释比例：1:200）和抗 p-RIPK3（S227；稀释比例：1:200）均为兔源抗体，因此不应在同一孔中联合使用。为监测病毒感染情况，可将针对目标病毒蛋白的一抗与 p-MLKL（S358）或 p-RIPK3（S227）联合使用。本实验中，细胞经 HSV-1 感染后，使用 ICP0 抗体进行染色（稀释比例：1:50，宿主物种：小鼠）。</li>
	<li>此时应考虑必要的染色对照。务必设置不加一抗的对照组，以观察 TSA 扩增步骤可能产生的背景信号，从而设定掩膜阈值（见步骤 9）。 
	&#8203;注：若采用共染色方案（例如将 p-MLKL [S358] 或 p-RIPK3 [S227] 与抗病毒蛋白抗体联合使用），也应设置单染对照。单染对照对于校正其他成像通道中可能存在的信号串扰至关重要。</li>
</ol>
6. 酪胺信号放大（TSA）
<ol>
	<li>移除一抗混合液，用 100 µL 洗涤缓冲液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）洗涤孔板 3 次。在倾斜式实验室摇床上室温孵育，每次洗涤步骤 5 分钟。</li>
	<li>移除洗涤缓冲液，加入 100 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，该二抗需识别待扩增的一抗所来源的物种。为扩增 p-RIPK3 (S227) 或 p-MLKL (S358) 信号，加入 100 µL 抗兔-HRP 二抗，在倾斜式实验室摇床上室温孵育 30 分钟。 
	注意：仅扩增 p-MLKL (S358) 或 p-RIPK3 (S227) 信号。病毒蛋白的染色将采用标准的间接染色法进行可视化。</li>
	<li>随后，用 100 µL 洗涤缓冲液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）洗涤孔板 3 次。在倾斜式实验室摇床上室温孵育，每次洗涤步骤 5 分钟。</li>
	<li>接下来的步骤中，向显微孔板中加入生物素化酪胺。利用与二抗偶联的 HRP 基团，酶促反应将在靶标蛋白附近（此处为 p-MLKL [S358] 或 p-RIPK3 [S227]）触发生成酪胺自由基。</li>
	<li>为激活 HRP 的酶活性，需将氧化底物与生物素化酪胺一同加入。为此，向 TSA 缓冲液（0.1 M 硼酸，pH 8.5）中添加 0.03 M H2O2；具体操作为取 5 mL TSA 缓冲液，加入 5 µL 30% H2O2。</li>
	<li>现在，用添加了 H2O2 的 TSA 缓冲液将生物素-酪胺稀释至 1:1,000 至 1:20,000 的比例。 
	注意：生物素-酪胺的稀释倍数需根据每批试剂进行优化。</li>
	<li>移除孔内洗涤缓冲液，每孔加入稀释后的生物素-酪胺，终体积为 100 µL。在倾斜式实验室摇床上室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>接着，用 100 µL 洗涤缓冲液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）洗涤孔板 3 次。在倾斜式实验室摇床上室温孵育，每次洗涤步骤 5 分钟。</li>
</ol>
7. 荧光染料
注意：由于一抗的信号被转化为生物素基团，因此使用与荧光染料偶联的链霉亲和素（荧光染料568，稀释比例：1:500）来检测p-MLKL（S358）和p-RIPK3（S227）。此外，细胞核使用DAPI（5 µg/mL）进行染色。如果染色方案中包含病毒蛋白，请加入针对一抗宿主物种的合适荧光标记二抗。在代表性结果中，使用了小鼠抗ICP0抗体，二抗为与荧光染料633偶联的山羊抗小鼠抗体（稀释比例：1:1,000）。
<ol>
	<li>在洗涤缓冲液（含0.1% Triton X-100的PBS）中配制染色混合液，其中包含上述抗体和染料。吸除洗涤缓冲液，每孔加入100 µL染色混合液，在室温下于倾斜摇床孵育1小时。从该步骤开始，需将成像腔室避光保存。</li>
	<li>随后，用洗涤缓冲液（含0.1% Triton X-100的PBS）洗涤孔板2次，每次在室温下于倾斜摇床孵育5分钟。</li>
	<li>最后，用1×PBS冲洗孔板2次。将样品置于过量（&#62; 200 µL）的1×PBS中保存直至成像。或者，可将样品浸入封片剂中以保存染色效果。此时，成像腔室已准备好用于共聚焦显微镜观察。</li>
</ol>
8. 使用共聚焦显微镜进行成像
<ol>
	<li>成像前至少10分钟开启共聚焦显微镜和激光器。</li>
	<li>为提高灵敏度，请使用浸油物镜。建议使用40倍或63倍的物镜放大倍数。成像前，使用合适的棉球和镜头清洁剂清洁浸油物镜。物镜污染（例如因灰尘所致）可能导致图像质量下降。</li>
	<li>在成像腔室底部加入过量的浸油，并在所选物镜上滴加一滴油。</li>
	<li>将成像腔室放置于显微镜载物台上。利用DAPI染色或明场成像找到焦平面。如有必要，轻微移动成像腔室，以确保浸油均匀分布。</li>
	<li>在显微镜上设置必要的成像通道。具体步骤可能因显微镜型号而异（表1）。 
	注意：设置成像通道时，应将核染色信号的采集安排在最后。405 nm激光可能引起光漂白，从而导致所有通道中的特异性信号减弱。</li>
	<li>为全面分析细胞中p-RIPK3（S227）或p-MLKL（S358）的存在情况，应采集覆盖整个细胞高度的z轴层扫图像。本实验中，z轴层扫由每0.16 µm一层、共40层组成，总扫描范围为6.22 µm。</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>通道</td>
			<td>激光</td>
			<td>分束器</td>
			<td>滤光片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)</td>
			<td rowspan="2">561</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 570-620 + LP645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBS 488/561/633 + SBS SP615</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">病毒基因：ICP0</td>
			<td rowspan="2">633</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + LP605</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBS 488/561/633 + SBS LP570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">细胞核：DAPI</td>
			<td rowspan="2">405</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + BP 495-550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBS 488/561/633</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于细胞可视化的成像通道。
9. 数据分析与定量
<ol>
	<li>将显微图像上传至软件中，使用扩展焦距功能将z轴层叠图像的所有信息可视化为一幅二维图像。</li>
	<li>接下来，编写分析流程以提取以下信息：每幅图像中的细胞数量，以及显示p-RIPK3 (S227)+ 或 p-MLKL (S358)+ 染色的体素总和。体素代表一个三维体积，定义为像素在三维空间中的对应单位。</li>
	<li>为量化每幅图像中的细胞数量，需对细胞核进行分割。为降低分割结果中的噪声，为分割过程设置尺寸限制（&#62;100 µm³）。分割出的细胞核数量即代表图像中的细胞数量。</li>
	<li>为量化p-RIPK3 (S227)+ 或 p-MLKL (S358)+ 体素的数量，需编写基于阈值的分割程序。设定阈值，确保在无一抗（NP）图像中不检测到任何信号。</li>
	<li>进一步利用未处理对照组（mock）的图像调整阈值。为确保对坏死性凋亡刺激引起的信号增加实现灵敏检测，通过设置更高阈值，限制在对照组中p-RIPK3 (S227)+ 或 p-MLKL (S358)+ 体素的检出。始终在多个对照组及坏死性凋亡诱导性病毒感染的图像中检查所编写的分析流程。</li>
	<li>在所有图像集上运行分析，并将体素定量结果与细胞核分割数据导出为.txt文件，以便在电子表格软件中进一步处理。</li>
	<li>创建数据透视表，展示图像名称、细胞核定量结果以及检测到的体素总和。</li>
	<li>接下来，将阳性体素总和除以图像中的细胞计数，得到每个细胞的阳性体素相对值。为可视化倍数变化，将每个细胞中p-RIPK3 (S227)+ 或 p-MLKL (S358)+ 体素的相对值除以未处理对照组（mock）的中位数值。</li>
</ol>

<ol><li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本免疫荧光染色方案描述了使用酪胺信号放大（tyramide signal amplification, TSA）技术来提高对人坏死性凋亡信号通路中难以检测的信号事件的灵敏度，包括RIPK3和MLKL的磷酸化26。引入TSA步骤显著改善了p-RIPK3（S227）和p-MLKL（S358）的检测阈值，并提高了p-MLKL（S358）染色的灵敏度。TSA揭示出在模拟处理（mock-treated）样本中已存在p-RIPK3（S227）信号。在人细胞中，RIPK3在S227位点的自磷酸化是坏死性凋亡激活的前提，因其可促进与MLKL形成稳定的相互作用。该过程在基础状态下即已发生，并在坏死性凋亡诱导前导致稳定的非活性p-RIPK3（S227）/MLKL二聚体的形成2,5,31。类似地，本研究中使用的抗p-RIPK3抗体亦可通过Western印迹在未处理细胞中检测到p-RIPK3（S227）<sup class="x...

受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）是调控坏死性凋亡的关键分子1,2。坏死性凋亡是一种溶细胞性、促炎性的程序性细胞死亡方式，参与抗病毒免疫和自身炎症反应。病毒感染细胞发生坏死性凋亡可迅速终止病毒复制。坏死性凋亡引发的细胞裂解还会释放损伤相关分子模式（DAMPs），从而激活抗病毒免疫应答3,4。坏死性凋亡的启动依赖于RIPK3的活化，该过程由RIP同源相互作用基序（RHIM）介导，与三种上游激活分子之一结合：RIPK1（在肿瘤坏死因子受体1 [TNFR1] 激活时）、含TIR结构域的干扰素β诱导衔接蛋白（TRIF；在Toll样受体3和4激活时）或抗病毒核酸传感器Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）1,2。坏死性凋亡信号通路通过一系列磷酸化事件传递，起始于RIPK3的自磷酸化。人RIPK3在其激酶结构域内丝氨酸（S）227位点的自磷酸化是其与MLKL相互作用的前提条件，也是人RIPK3活化及坏死性凋亡发生的常用生化标志1,5。RIPK3活化后，可磷酸化MLKL激活环上的苏氨酸（T）357和丝氨酸（S）358位点1。这一修饰导致MLKL构象改变，暴露出其N端的四螺旋束结构域。随后，MLKL发生寡聚化并转运至细胞膜，通过将暴露的四螺旋束插入脂双层形成跨膜孔道，最终导致细胞死亡2,6。
ZBP1 是一种抗病毒核酸感受器，可识别左旋 Z 构型的核酸，包括 Z 构型的双链 RNA（Z-RNA）。Z-RNA 的结合发生于 通过 位于ZBP1 N端的两个Zα结构域。在RNA和DNA病毒感染过程中积累的Z-RNA被认为可直接与ZBP1结合。7,8激活的ZBP1通过其中心的RHIM结构域招募RIPK3，并诱导包括坏死性凋亡在内的程序性细胞死亡9,10病毒已采用多种逃逸机制以对抗ZBP1诱导的宿主细胞坏死性凋亡11例如，单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的核糖核苷酸还原酶亚基1，称为ICP6，由 UL39在其N端含有RHIM结构域，可干扰人类细胞中ZBP1介导的RIPK3激活12,13,14,15ZBP1 不仅能够限制病毒复制，小鼠研究还表明，ZBP1 的激活可导致炎症性疾病并促进抗癌免疫反应。16,17,18,19,20,21因此，检测人类细胞中ZBP1诱导的坏死性凋亡过程中信号事件的方案，对于评估ZBP1在这些过程中的作用具有重要价值。
酪胺信号放大（TSA），也称为催化报告分子沉积（CARD），是一种用于提高基于抗体的免疫检测方法检测限和信噪比的技术。在TSA过程中，可使用任何一抗来检测目标抗原。与二抗偶联的辣根过氧化物酶（HRP）在过氧化氢存在下催化生物素化酪胺自由基的局部积累。这些活化的生物素-酪胺自由基随后与邻近的酪氨酸残基反应，形成共价键。可能的酪胺-生物素底物包括目标抗原本身、一抗和二抗以及周围的蛋白质。因此，尽管TSA显著提高了检测灵敏度，但会部分损失空间分辨率。在最后一步中，使用荧光标记的链霉亲和素检测生物素分子。HRP反应在目标抗原上或其附近沉积大量酪胺-生物素分子，从而显著增加链霉亲和素-荧光染料的结合位点，极大地增强检测的灵敏度。图1）。或者，可将酪胺直接与荧光染料偶联，从而无需使用链霉亲和素偶联的荧光染料。蛋白质免疫组织化学以及DNA/RNA 原位 杂交是最早采用TSA来增强信号强度的方法之一22,23最近，TSA 已与细胞内流式细胞术结合使用。24 和质谱法25.
本文介绍一种利用免疫荧光显微镜检测HSV-1感染激活ZBP1后人源RIPK3在丝氨酸227位点的磷酸化（p-RIPK3 [S227]）以及人源MLKL磷酸化（p-MLKL [S358]）的实验方案。我们采用一种对坏死性凋亡敏感的HT-29人结肠直肠腺癌细胞系，该细胞经转导后可稳定表达人源ZBP1。这些细胞被感染表达突变型ICP6蛋白的HSV-1毒株（HSV-1 ICP6mutRHIM），其中病毒RHIM结构域内的四个核心氨基酸（VQCG）被丙氨酸（AAAA）取代，从而使ICP6丧失抑制ZBP1介导的坏死性凋亡的能力13,14,15。为克服目前 commercially available 抗p-RIPK3和抗p-MLKL抗体在免疫染色中信噪比较低的问题26，我们引入了酪胺信号放大（tyramide signal amplification, TSA）步骤（图1），该方法可显著增强人源p-RIPK3（S227）的检测信号，并将人源p-MLKL（S358）的检测灵敏度提高一个数量级。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗兔 HRP</td><td>Agilent Technologies Belgium</td><td>K4002</td><td>Envision+ System-HRP 标记聚合物抗兔抗体</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 DyLight 633</td><td>Thermofisher</td><td>35513</td><td>二抗</td></tr><tr><td>HSV-1 ICP0</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53070</td><td>小鼠抗 ICP0（HSV-1）抗体</td></tr><tr><td>IAV-PR8 小鼠血清</td><td>实验室自制</td><td>xx</td><td>小鼠抗 IAV-PR8 多克隆抗体</td></tr><tr><td>pMLKL</td><td>Abcam</td><td>ab187091</td><td>兔抗 MLKL-磷酸化 S358 抗体</td></tr><tr><td>pRIPK3</td><td>Abcam</td><td>ab209384</td><td>兔抗 RIPK3-磷酸化 S227 抗体</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;荧光染料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D21490</td><td>用于显示细胞核</td></tr><tr><td>与 Alexa Fluor 568 偶联的链霉亲和素</td><td>Thermofisher</td><td>S11226</td><td>用于显示生物素分子</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化合物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>氧化底物，HRP 活性所必需</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>SANBIO</td><td>AR1068</td><td>用于固定/交联细胞</td></tr><tr><td>生物素化酪胺</td><td>R&amp;D Systems</td><td>6241</td><td>用于信号放大，HRP 底物</td></tr><tr><td>BV-6</td><td>Selleckchem</td><td>S7597</td><td>BV6 IAP 抑制剂</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于细胞培养：使细胞脱离</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>8.0 g/L NaCl</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>0.4 g/L EDTA 二钠盐</td></tr><tr><td>EDTA 0.04%</td><td>实验室配制</td><td></td><td>1.1 g/L Na2HPO4</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>0.2 g/L NaH2PO4</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>0.2 g/L KCl</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>0.2 g/L 葡萄糖</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>TICO</td><td>FBS EU XXX</td><td>用于细胞培养，维持细胞生长；批号：90439</td></tr><tr><td>GSK'840</td><td>Aobious</td><td>AOB0917</td><td>RIPK3 激酶抑制剂</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>用于细胞培养，维持细胞生长</td></tr><tr><td>MAXblock</td><td>Active Motif</td><td>15252</td><td>封闭液</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10444402</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>用于细胞培养，维持细胞生长</td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>实验室自制</td><td>-</td><td>信号分子，可与 BV6 和 zVAD 联合触发细胞死亡</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>用于细胞透化</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Merck</td><td>11732</td><td>用于细胞计数，作为活/死细胞标记物，使用浓度为 0.1%</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4424</td><td>用于细胞培养：使细胞脱离</td></tr><tr><td>zVAD</td><td>Bachem</td><td>BACE4026865.0005</td><td>Z-Val-Ala-DL-Asp-氟甲基酮</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-载玻片 8 孔高玻璃底</td><td>iBidi</td><td>80807</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>棉签球-中号</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71001-10</td><td>用于清洁物镜</td></tr><tr><td>Immersol 518 F / 30 &amp;deg;C</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td>用于高倍镜下观察样本</td></tr><tr><td>镜头清洁剂</td><td>ZEISS</td><td>000000-0105-200</td><td>用于清洁物镜</td></tr><tr><td>LSM880 Fast Airyscan 共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td>用于观察样本</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Office</td><td>xx</td><td>用于数据处理</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>Graphpad</td><td>xx</td><td>用于数据分析——统计检验与图表生成</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Volocity</td><td>xx</td><td>用于定量分析</td></tr><tr><td>Zen black</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>用于图像采集与处理</td></tr><tr><td>Zen blue</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>用于图像观察</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;病毒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HSV-1（mutRHIM）F 株</td><td>由&amp;nbsp; Dr. Jiahuai Han 制备</td><td>实验室扩增</td><td>HSV-1 作为坏死性凋亡的诱导剂；UL39/ICP6 的 RHIM 核心结构域发生突变（VQCG&gt;AAAA）</td></tr><tr><td>HSV-1（WT）F 株</td><td>由 Dr. Jiahuai Han 制备</td><td>实验室扩增</td><td>HSV-1（野生型）作为坏死性凋亡诱导的阴性对照（ICP6 抑制）</td></tr><tr><td>IAV PR8</td><td>实验室库存</td><td>实验室扩增</td><td>IAV 作为坏死性凋亡的诱导剂</td></tr></tbody></table>

酪胺信号放大法用于人细胞中hsv-1感染后zbp1依赖性ripk3和mlkl磷酸化的免疫荧光染色

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）及其底物混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）是坏死性凋亡的关键调控因子，坏死性凋亡是一种具有重要抗病毒功能的炎症性细胞死亡形式。RIPK3的自磷酸化可诱导MLKL（坏死性凋亡的成孔效应蛋白）的磷酸化和活化。磷酸化的MLKL在细胞膜上转运并寡聚化，最终导致细胞裂解，这是坏死性凋亡的典型特征。核酸传感器ZBP1在感染RNA病毒和DNA病毒后，通过结合左旋Z型双链RNA（Z-RNA）而被激活。ZBP1的激活可通过诱导受感染宿主细胞发生程序性细胞死亡（包括坏死性凋亡）来限制病毒感染。免疫荧光显微镜技术可在单细胞水平上可视化ZBP1介导的坏死性凋亡下游的不同信号转导步骤。然而，使用目前市售的针对人RIPK3和MLKL的磷酸化特异性抗体进行常规荧光显微镜检测时，其灵敏度不足以实现这些标志物的可重复成像。本文中，我们描述了一种优化的染色方法，用于检测单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染的人HT-29细胞中丝氨酸（S）位点磷酸化的RIPK3（S227）和MLKL（S358）。在免疫荧光染色流程中引入酪胺信号放大（TSA）步骤，可实现对S227位点磷酸化RIPK3的特异性检测。此外，TSA显著提高了S358位点磷酸化MLKL的检测灵敏度。该方法整体上实现了对ZBP1诱导坏死性凋亡过程中这两个关键信号事件的可视化。

在人类细胞中，MLKL 磷酸化以及特别是 RIPK3 磷酸化的免疫荧光检测在技术上具有挑战性26。本文介绍了一种在 ZBP1 激活后检测人源 p-RIPK3 (S227) 和 p-MLKL (S358) 的改进染色方案。该方案包含一个 TSA 步骤，以提高荧光信号的检测限和灵敏度。为验证该方法，我们对 TSA 介导的免疫荧光染色与标准的间接荧光染色法在 p-RIPK3 (S227) 和 p-MLKL (S358) 检测中的效果进行了平行对照比较。
表达人源 ZBP1 的 HT-29 细胞感染 ICP6 RHIM 突变型 HSV-1 毒株（HSV-1 ICP6mutRHIM) 以诱导ZBP1介导的坏死性凋亡及RIPK3磷酸化。HSV-1 ICP6mutRHIM 该毒株在 ICP6 RHIM 区域内携带 VQCG 至 AAAA 的突变，无法阻断 ZBP1 下游的坏死性凋亡信号传导14,15<...

免疫荧光染色过程中使用酪胺信号放大技术，可灵敏地检测 HSV-1 感染后 ZBP1 介导的坏死性凋亡过程中磷酸化的 RIPK3 和 MLKL。

酪胺信号放大法用于人细胞中HSV-1感染后ZBP1依赖性RIPK3和MLKL磷酸化的免疫荧光染色

激酶受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）及其底物混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）是关键的……

对坏死性凋亡诱导过程中两个关键信号事件——磷酸化RIPK3和MLKL的可靠可视化，在技术上一直具有挑战性。本文展示的酪胺信号放大技术可实现对这两种分子的高灵敏度检测。信号放大步骤降低了检测阈值，从而能够稳定且可重复地检测磷酸化RIPK3和MLKL。在1平方厘米表面积的培养板中，使用完全浓度的McCoy's 5A培养基接种90,000个表达ZBP1的HT-29细胞，以便进行高分辨率显微镜观察。每孔终体积为200 µL。将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。当细胞融合度达到70%至80%时，使用200微升预热的完全浓度McCoy's 5A培养基对细胞进行感染，该培养基中含有编码ICP6环突变体的单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus one），感染复数为5。将细胞与病毒共同孵育9小时以诱导坏死性凋亡。作为坏死性凋亡诱导的阳性对照，使用200微升预热的坏死性凋亡诱导剂混合液刺激细胞4小时。作为阴性对照，加入22微升预热至37摄氏度的10微摩尔GSK840，以抑制RIPK3激酶活性。在未处理条件下以及坏死性凋亡刺激后均需加入该抑制剂，以防止丝氨酸227位点的自磷酸化。固定细胞时，移除培养基，并用200微升PBS洗涤细胞。然后吸除 PBS，加入 150 微升在室温下平衡的 4% 多聚甲醛。将细胞在室温下孵育 30 分钟。固定完成后，吸除 4% 多聚甲醛，并用 200 微升 PBS 洗涤细胞三次。样品可在4°C条件下用过量PBS孵育过夜，直至进一步处理。从孔板中移除PBS，加入100 µL通透缓冲液，在室温下于倾斜摇床孵育30分钟。孵育结束后，移除通透缓冲液，并用100 µL洗涤缓冲液洗涤细胞。将成像板置于倾斜实验室摇床上，室温下用洗涤缓冲液孵育五分钟。为防止一抗的非特异性结合，将成像板置于倾斜实验室摇床上，室温下加入100 µL封闭液孵育两小时。随后，用100 µL洗涤缓冲液洗涤孔板三次，每次在倾斜实验室摇床上室温孵育五分钟。洗去洗涤缓冲液后，向成像室中加入 100 微升一抗。务必设置不加一抗的对照组，以观察酪胺信号放大可能产生的背景信号，并用于设定掩膜阈值。将成像室置于 4°C 条件下孵育过夜。移除一抗混合液，用 100 微升洗涤缓冲液在室温下于倾斜摇床孵育 5 分钟，重复洗涤 3 次。移去洗涤缓冲液后，每孔加入 100 微升 HRP 标记的二抗，该二抗应能识别待扩增的一抗物种，在倾斜摇床上孵育 30 分钟。在抗体孵育期间，配制生物素化酪胺混合液。为了激活HRP的酶活性，使用前需在TSA缓冲液中新鲜加入氧化底物。然后用优化的稀释比例将生物素化酪胺稀释于配制好的TSA缓冲液中。在与HRP标记的二抗孵育后，用洗涤缓冲液在倾斜式实验室摇床上孵育五分钟，重复洗涤三次。从孔中移除洗涤缓冲液后，向孔中加入稀释的生物素-酪胺，终体积为100微升。在室温下于倾斜的实验室摇床上孵育反应10分钟，随后用洗涤缓冲液洗涤三次。制备含有二抗、偶联链霉亲和素、核染料和洗涤缓冲液的染色混合液。吸去洗涤缓冲液，加入100微升染色混合液，于室温在倾斜的实验室摇床上孵育1小时。从该步骤开始，始终将成像腔室避光保存。染色后，用洗涤缓冲液连续洗涤两次，再用PBS冲洗两次。将样品置于过量的 PBS 中，于 4 °C 保存，以维持染色效果直至成像。成像腔现已准备好在共聚焦显微镜下进行观察。通过加入酪胺信号放大步骤，可稳健地检测到感染表达 ICP6 rim 突变体的单纯疱疹病毒 1 型细胞中细胞质内丝氨酸 227 位点磷酸化的 RIPK3。2%的激光功率已足以实现灵敏检测。在标准的间接免疫荧光实验中，即使使用较高的激光功率，仍无法检测到磷酸化RIPK3。对三维Z轴层扫图像进行定量分析显示，与对照处理的细胞相比，感染细胞中磷酸化RIPK3阳性的体素数量增加了约20倍。与模拟处理的细胞相比，野生型单纯疱疹病毒1型感染细胞中磷酸化RIPK3染色增强，表明ICP6的Rim结构域无法完全阻断RIPK3在丝氨酸227位点的磷酸化。GSK840可结合RIPK3的激酶结构域，并在ZBP1激活后阻止RIPK3在丝氨酸227位点的磷酸化，从而验证了酪胺信号放大介导的磷酸化RIPK3检测方法的特异性。模拟处理的细胞中，MLKL在丝氨酸358位点的磷酸化呈现微弱且略有斑点状的胞质染色，而在感染细胞中，胞质、细胞核及质膜均检测到强烈的染色信号。标准的间接免疫荧光检测在感染细胞中特异性检测磷酸化MLKL信号时需要40%的激光功率。相比之下，酪胺信号放大技术提高了磷酸化MLKL的检测灵敏度，从而将所需的激光功率降低至6%。3D Z-stack图像定量分析显示，与标准方法相比，使用酪胺信号放大技术时磷酸化MLKL阳性的体素数量增加了约90倍，而标准方法仅增加了7倍，表明酪胺信号放大技术对磷酸化MLKL的检测阈值和灵敏度显著提高。与单纯疱疹病毒1型类似，甲型流感病毒感染可触发ZBP1依赖性的坏死性凋亡。酪胺信号放大技术实现了对磷酸化RIPK3和磷酸化MLKL的稳健检测，表明发生了坏死性凋亡。为准确解读共聚焦染色结果，需包含多种染色对照，包括无一抗对照、单染对照以及阳性对照。通过采用该方案，可利用连续的TSA扩增多个靶标，从而实现在同一细胞内检测磷酸化的RIPK3和MLKL。对坏死性凋亡生物标志物的灵敏检测，有助于当前关于ZBP1在自身炎症或病毒感染中的研究，特别是在尚需确认ZBP1依赖性细胞死亡通路究竟为坏死性凋亡、凋亡还是焦亡的情况下。

tyramide-signal-amplification-for-immunofluorescent-staining-zbp1

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

人细胞中HSV-1感染后RIPK3和MLKL的ZBP1依赖性磷酸化的免疫荧光荧光放大的酪胺信号扩增

偏头痛及其向慢性偏头痛的转化是重大的医疗负担，亟需更有效的治疗方案。我们致力于阐明神经免疫信号如何调节偏头痛的易感性，通过体外建模 体外...

使用扩散性抑制建模发作性与慢性偏头痛的神经免疫信号传导 体外

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。...

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

本视频展示了一种用于监测单纯疱疹病毒-1型感染过程中感染细胞蛋白0（ICP0）转运的方法。ICP0在新合成后会转位至细胞核，随着感染进程的发展，随后转移至细胞质。通过免疫荧光显微镜可揭示并分析该蛋白的亚细胞定位，从而深入了解其在感染各阶段中的转运动态。...

一种用于感染细胞中病毒蛋白定位的免疫荧光技术

我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。...

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

皮肤是人类病原体单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的靶组织之一。为探究HSV-1侵入组织的途径，我们建立了一种 离体...

Ex Vivo 小鼠表皮感染单纯疱疹病毒1型

病毒转录工厂是富含细胞RNA聚合酶II的独立结构，在病毒再激活期间可增强病毒基因的转录。本文介绍一种结合免疫荧光染色与三维细胞核空间成像的方法，用于定位活跃转录的病毒染色质位点。 原位...

利用三维荧光显微镜对病毒转录工厂进行功能成像

ICP0 在 HSV-1 感染过程中会发生从细胞核到细胞质的转位。这一事件的分子机制尚不清楚。本文介绍了使用共聚焦显微镜作为量化 HSV-1 感染中 ICP0 运动的工具，为今后在机制研究中对 ICP0...

通过免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1型蛋白的核质转位进行时间分析

我们介绍一种利用荧光原位杂交（FISH）技术在裂解感染的人类细胞中可视化多种疱疹病毒RNA的实验方案，适用于悬浮或贴壁细胞。该方案包含荧光信号的定量分析，以生成核质比，并可扩展用于通过免疫荧光（IF）同时可视化宿主和病毒蛋白。...

KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）检测

本研究中，我们介绍了基于抑制剂和小干扰RNA的策略，用于干扰单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬流。...

利用siRNA电穿孔技术调控单纯疱疹病毒1型感染的单核细胞来源树突状细胞中的自噬

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

学习酪胺信号扩增技术检测HSV-1感染后磷酸化RIPK3和MLKL的方法。该方案利用HT-29细胞模型显著提高坏死性凋亡标志物的检测灵敏度，为ZBP1依赖性细胞死亡研究提供可靠工具。

酪胺信号放大法用于人细胞中HSV-1感染后ZBP1依赖性RIPK3和MLKL磷酸化的免疫荧光染色

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