Name: 分离小鼠肠系膜流动淋巴液以量化膳食脂质吸收和乳糜微粒分泌的 体内 动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 学习小鼠肠系膜淋巴液分离技术，用于实时量化膳食脂质吸收与乳糜微粒分泌的体内动力学。该方法通过十二指肠营养输注模型，帮助研究者深入理解代谢与免疫相互作用机制。

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我们非常感谢囊性纤维化基金会（资助编号：Pilot and Feasibility Award 1810，授予 ABK）、雷宁基金会（Synergy Award，项目负责人 GJ Randolph，合作研究者 ABK）以及美国国立卫生研究院（资助编号：R01DK118239、R03DK116011，授予 ABK）对本研究工作的支持。

所有外科手术程序均经匹兹堡大学动物照护与使用委员会（Internal Animal Care and Use Committee）批准［方案编号：20047008］，并符合《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）。本研究采用8至14周龄的C57BL6/J雄性小鼠。小鼠购自商业来源（见 材料表）。所有小鼠均饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下， 随意摄取 可自由获取标准饲料和水。
1. 动物准备
<ol>
	<li>根据实验设计，给小鼠喂食或使其禁食。 
	注意：除非担心胃排空速率存在差异，否则无需过夜禁食。</li>
	<li>使用5%异氟烷气体诱导麻醉，并通过尾部和脚趾夹捏确认麻醉效果。一旦小鼠进入麻醉状态，使用2%-3%异氟烷气体维持适当的麻醉深度，并用胶带将其固定在手术平台上。</li>
	<li>将小鼠置于使用循环温水加热的手术平台上以保持体温（参见材料表）。</li>
</ol>
2. 手术与实验设计
<ol>
	<li>手术开始时，先在眼睛上涂抹兽用眼膏，剃除腹部毛发，然后涂抹抗菌手术擦洗剂（参见 材料表) 到手术部位。这可以对切口进行灭菌，并减少正中切口过程中产生空气中的毛发颗粒。</li>
	<li>通过使用无菌器械、无菌巾及其他所需的无菌设备和耗材，保持无菌操作区域。</li>
	<li>注射第一剂卡洛芬（参见 材料表用于镇痛（腹腔注射），剂量为5 mg/kg。</li>
	<li>用镊子夹住皮肤，用小剪刀做腹部正中切口。沿中线向胸骨方向剪开（切勿超过胸骨），向下剪至腹股沟脂肪处。随后，用剪刀单独剪开肌肉层。 
	注意：&#160;使用前对所有设备进行灭菌。&#160;</li>
	<li>使用拉钩将腹膜内脏移开，直至淋巴管可见。</li>
	<li>使用浸有生理盐水的棉签（参见 材料表将肝脏移向身体的右上侧，同时将肠道和胃移向动物的左侧。</li>
	<li>将十二指肠横向向左牵拉，以暴露肠系膜上动脉和肠淋巴管。</li>
	<li>准备一段30-40 cm长的套管导管，方法是将钝针插入套管导管中（参见 材料表）并使用1 mL注射器将少量肝素（1,000 U/L）通过导管冲洗。 
	注意：淋巴液流动依靠重力作用向下流入置于冰上的微量离心收集管中。根据收集用冰桶在手术装置旁的位置，可能需要调整套管导管的长度。</li>
	<li>使用剪刀在套管导管的尖端剪出一个斜面。</li>
	<li>用虹膜剪做一个浅表切口（参见 材料表在淋巴管距其进入小肠处约5 mm的位置。</li>
	<li>用精细镊子夹住套管导管，将管尖斜面朝上轻轻插入导管。 
	注意：切勿将套管插入导管过深，否则在将回缩的器官复位时可能阻碍淋巴液流动。</li>
	<li>淋巴管过于脆弱，无法承受用缝线将导管结扎的操作。取而代之，使用一滴氰基丙烯酸盐胶水（参见 材料表) 将淋巴导管插管粘接到肠系膜淋巴管。</li>
	<li>检查淋巴瘘管插管中是否立即开始流出乳白色淋巴液（若术前采用橄榄油灌胃）或透明淋巴液（若小鼠术前已禁食）。 
	注意：检查淋巴导管是否成功置入且淋巴液是否流通；确认无误后继续进行十二指肠内导管置入。</li>
	<li>使用18 G针头，在幽门括约肌后方的胃幽门区域穿刺一个小孔。</li>
	<li>插入十二指肠灌注管（参见 材料表通过胃部的切口，将导管插入至幽门括约肌下方约1-2 mm处的十二指肠。</li>
	<li>使用5-0丝线进行荷包缝扎固定（参见 材料表用针连接至胃部，并用一滴氰基丙烯酸酯胶密封以防止泄漏。</li>
	<li>以0.3 mL/h的速度开始经十二指肠输注5%葡萄糖-0.9%氯化钠溶液。 
	注意：当使用体重差异较小且体重大约为25 g（约8周龄）的小鼠时，以0.3 mL/h的速率输注葡萄糖/生理盐水是合适的。若小鼠体型显著更大，则必须相应提高输注速率，以校正体重和血容量的变化。</li>
	<li>将器官放回体腔，并分别缝合（5-0）肌肉和皮肤组织。 
	注意：淋巴导管和十二指肠饲管均通过同一处切口引出体外。无需用缝线将两根导管分离，且对导管引出体外的角度无特殊要求。</li>
	<li>手术后但在撤除麻醉剂之前，将小鼠轻轻放入Snuggle固定装置中（参见 材料表以限制运动性。 
	注意：束缚装置可防止小鼠抓握&#160;或转动头部以咬到缝线和管路。&#160;</li>
	<li>然后，将小鼠放入一个透明的聚甲基丙烯酸甲酯盒中，置于旋转器上并进行轻柔摇动，并使用 commercially available 的温控两栖/爬行动物加热垫贴附在 containment box 侧面进行加热。同时，在 containment box 的角落放置装有无菌去离子水的容器以提供湿度（参见 材料表).</li>
	<li>在撤除异氟烷前30分钟，给予小鼠第二次镇痛剂量（Buprenex，0.1 mg/kg，腹腔注射）。</li>
	<li>根据实验需要，以每小时0.3 mL的速度，持续向小鼠十二指肠内输注5%葡萄糖-0.9%氯化钠溶液，持续1小时。 
	注意：5%葡萄糖-0.9%氯化钠溶液需使用药房提供的无菌生理盐水袋（供人用，pH 7.4）和50%葡萄糖无菌瓶（供人用），严格按照无菌操作规范配制。该溶液必须现配现用，若超过生理盐水袋或葡萄糖瓶上标注的有效期，则必须丢弃。</li>
	<li>向小鼠给予下述所列脂质中的一种 表1 作为一种实验性脂质 通过 一个&#160;十二指肠内插管（参见 材料表). 
	注意：对于图中所示的所有数据 图1，SMOFlipid（20% 注射用脂肪乳液，USP，参见 材料表通过十二指肠内输注该溶液。此输注步骤在十二指肠内脂质推注前后均需进行，以补充经淋巴管流失的液体，此为必需操作。此时小鼠已准备好接受实验性脂质剂量的输注。</li>
	<li>注射0.3 mL脂肪乳剂推注液（SMOFlipid 20%脂肪注射用乳剂，USP） 通过 十二指肠内灌注管（参见 材料表).</li>
	<li>在十二指肠内脂质团注输注后，将输注液换回5%葡萄糖-0.9%氯化钠溶液，以0.3 mL/h的速率持续输注至实验结束。</li>
	<li>将淋巴液样品收集至预先称重的微量离心管中，持续60分钟，并将淋巴液置于冰上保存。60分钟后再次称量离心管，以确定每60分钟分泌的淋巴液重量。 
	注意：每只小鼠在给予 0.3 mL 脂质推注后约 6 小时内，预计每小时可收集 50–300 µL 淋巴液。</li>
	<li>淋巴液在脂质输注后可流动长达6小时。在6小时时间点处死小鼠 通过 异氟烷和颈椎脱位。 
	注意：实验全程应有外科医生和/或实验室技术人员在场监测动物状况。观察期间，需注意淋巴引流中是否出现凝块以及任何变化&#160;表明动物行为的指标&#160;疼痛/痛苦。如果在实验过程中淋巴管在任何时间点发生堵塞，实验将立即终止，动物将被实施安乐死。根据IACUC关于存活手术的规定，动物在手术后 technically 可存活长达24小时。然而，随着时间推移，存活率逐渐下降，而6小时是一个可重复的存活时间段，在此期间脂质吸收仍能模拟正常生理状态 体内 生理状态良好，且动物未处于生存挣扎中。&#160;</li>
	<li>安乐死后（步骤 3.1）进行终末组织采集。 
	注意：&#160;最近测试了术后6小时和24小时小鼠在膳食脂质吸收谱上的差异44我们发现，24小时的实验程序会降低动物的存活率&#160;饮食中脂质进入淋巴的迁移过程。基于上述原因，我们强烈推荐采用6小时方案。这种改进的手术设计可减少不必要的动物死亡以及术后动物痛苦的风险，符合美国实验动物照护评估认证协会（AAALAC）所倡导的动物使用“替代、减少、优化”原则 [参考文献 PMID: 21595115]。</li>
</ol>
3. 管腔内容物与黏膜组织的采集
<ol>
	<li>在6小时脂质输注期结束时，通过异氟烷麻醉并行颈椎脱位处死小鼠。使用5-0缝线结扎胃、小肠和盲肠的两端，以防止管腔内容物泄漏。</li>
	<li>采集胃、盲肠和结肠，并分别放入15 mL玻璃管中。将小肠分为三至四个节段，纵向剪开后用2–3 mL冷PBS冲洗组织，收集管腔内容物。</li>
	<li>用弯头镊子在2–3 mL冷PBS中刮取各肠段，分离包含上皮细胞及相关固有层的肠黏膜与肌层。</li>
	<li>将所有组织、管腔及黏膜分离物以及肌层分别放入玻璃管中，每管加入8 mL体积比为2:1的氯仿:甲醇（CHCl3:MeOH）溶液。</li>
	<li>经Folch提取法45处理后，采用液体闪烁计数法和/或甘油三酯检测试剂盒（见材料表）测定放射性活度和/或脂质浓度。</li>
</ol>
4. 薄层色谱法（TLC）
<ol>
	<li>提取管腔和黏膜分离物的总脂质 通过 改良的Folch提取法45.</li>
	<li>在氮气蒸发仪中将提取的脂质于溶剂中干燥，然后用2:1（体积比）的CHCl₃/MeOH重新悬浮3：上样至TLC硅胶板前用甲醇处理（参见 材料表).</li>
	<li>使用石油醚、乙醚和冰醋酸（25:5:1，体积比）的溶剂体系分离脂质。采用碘蒸气显色以显示不同种类的脂质，包括标准品。</li>
	<li>刮取薄层色谱板上对应于单甘油酯/磷脂、二甘油酯、脂肪酸、三甘油酯和胆固醇酯的斑点，分别放入不同的闪烁瓶中，然后加入4 mL闪烁液（参见 材料表用于闪烁计数。</li>
	<li>将数据表示为总脂质剂量的百分比，或表示为每个样本中检测到的总脂质的一个分数。</li>
</ol>
5. 乳糜微粒的分离与表征
<ol>
	<li>将脂质脉冲后6小时的合并淋巴液样本（步骤2.29）转移至超速离心管中，加入0.9% NaCl（300-500 µL）混匀，然后小心地在上层覆盖适当体积的0.87% NaCl（300-500 µL）。
	<ol>
		<li>将样本在4 °C条件下以110,000 × g 超速离心（参见材料表）16小时。收集含有分离乳糜微粒的上层组分，并将其转移至新的微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤测定乳糜微粒中的甘油三酯、胆固醇和载脂蛋白B（apoB）浓度。
	<ol>
		<li>使用甘油三酯和胆固醇检测试剂盒（参见材料表）测定甘油三酯和胆固醇浓度。</li>
		<li>简要步骤：在96孔板中，将2 µL样本与200 µL酶试剂在37 °C孵育5分钟。使用酶标仪在500 nm波长下读取甘油三酯吸光度，在600 nm波长下读取胆固醇吸光度。 
		注：浓度计算时使用了标准品和空白对照。载脂蛋白B（apoB）浓度使用小鼠ApoB ELISA试剂盒（参见材料表）测定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定乳糜微粒颗粒大小。
	<ol>
		<li>使用甘油三酯浓度约为40 mg/dL的新鲜乳糜微粒样本进行透射电子显微镜（TEM）成像。简要步骤：将每份样本5-10 µL滴加至TEM载网，干燥。</li>
		<li>使用透射电子显微镜观察载网并采集图像。使用ImageJ软件（参见材料表）测量脂蛋白颗粒大小并进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

最初的两天淋巴瘘手术由 Bollman 等人25 描述，并由 Patrick Tso 实验室在过去 45 年中持续应用26,27。本文所述方案是对这一经典、金标准方法的有力补充，可用于鉴定、定量并深入理解小肠独特的乳糜分泌物，以及膳食营养素吸收与代谢、肠道激素和肠道免疫的 in vivo 动态过程。
该模型的优点包括：（1）能够在进食及餐后期间持续采集肠系膜淋巴液，而非仅在吸收、消化或分泌过程中的某一时间点进行静态采样；（2）可直接在生理腔室中测定肠道激素和细胞因子，而非在血液中测定，因为在血液中这些物质会被稀释并遭受酶降解17,44；（3）能够在摄入脂质餐后，直接分离、定量并表征小肠分泌的脂蛋白，且由于肠系膜淋巴液中不存在内皮脂酶，可保持乳糜微粒中的甘油三酯浓度及其天然结构46,47；（4）能够直接测量淋巴流速、甘油三酯和胆固醇（或其他经十二指肠灌注化合物）的输出量、乳糜微粒组成以及肠道激素浓度。最后，本方案可在6小时期间内每小时收集相对大量的&#62;50 µL淋巴液。由于通过十二指肠内灌注生理盐水和葡萄糖补充液体，淋巴瘘模型较其他淋巴采样技术显著改进，可获得持续流动而非静态积聚的肠系膜淋巴液。鉴于样本体积是脂质组学、蛋白质组学和代谢组学研究的主要限制因素，这一优势尤为重要。
本文所述的小鼠1天淋巴瘘模型方案相较于原始的淋巴瘘方案具有多项优势：由于术后存活率更高，所需实验动物总数较此前报道的2天淋巴瘘方案26,27有所减少；整体实验时间从2天缩短为1天；此外，小鼠的恢复期也从过夜（&#62;18 h）——此期间可能出现突破性疼痛或术后恢复不良——缩短至更易管理的术后约6小时。
本1天实验方案的一个特点是重点关注人道考虑和终点指标。这些因素必须被置于最高优先级：（1）动物必须接受十二指肠内或静脉补液；（2）必须保持动物体温并尽可能减轻疼痛（根据实验设计及是否需要避免抗炎效应，使用术后布托啡诺和/或卡洛芬）；（3）出血、颤抖、腹泻或任何痛苦迹象均为实施人道终点的明确指征。根据严格的IACUC指南，使用异氟烷麻醉后行颈椎脱位是一种可接受的终点处理方式。手术后动物的单日存活率约为70%（相比之下，原始的2天手术存活率约为40%），但一旦出现痛苦迹象，研究者应毫不犹豫地终止实验。在规划动物使用数量时，应充分考虑这一因素。
在该技术的故障排除方面，淋巴导管的成功放置是该手术过程中的主要瓶颈。在练习手术时，建议在手术前约2小时通过灌胃向小鼠给予0.3 mL橄榄油。这将促使乳糜微粒分泌进入肠系膜淋巴管，使其呈现&#34;乳白色&#34;，从而更易于观察。亚甲蓝也可用于增强可见性，但其效果通常不如乳白色的淋巴管明显。如果在放置淋巴导管并用胶水固定后，肠系膜淋巴液能够顺利通过导管流入收集容器，则可继续进行十二指肠灌注管的放置。有时淋巴液可能不会持续流动，但在将动物置于旋转台上后可能重新开始流动。需特别注意淋巴导管内是否形成血凝块，应通过轻柔按摩将血凝块排出导管，以防止对淋巴管产生反向压力。
除了甘油三酯分泌和淋巴流速外，该技术还可用于测定以下脂质吸收动力学和乳糜微粒特征：
乳糜微粒分泌45,48,49 
在摄入含脂肪的食物后，循环血浆中的甘油三酯会出现短暂升高。由于甘油三酯本质上是疏水性的，必须首先乳化才能溶于血液50。小肠肠上皮细胞执行这一功能，并将膳食来源的甘油三酯包装成乳糜微粒乳剂颗粒51。乳糜微粒的核心包含胆固醇和膳食甘油三酯，外周由磷脂和载脂蛋白（包括apoB-48、apoA-I、apoA-IV和apoC-III）包裹52,53,54,55。其中，apoB-48是关键的结构蛋白，而其他载脂蛋白则在乳糜微粒的代谢及血液清除过程中发挥多种功能。为了确定乳糜微粒的关键特征（包括其甘油三酯和载脂蛋白含量），应采用本文所示的1天淋巴瘘技术。乳糜微粒分泌速率是指灌注的3H-甘油三酯中被分泌至淋巴液的比例，通过每小时收集淋巴样本并用闪烁计数法测定。该方法可与详细的乳糜微粒表征相结合48,49,56,57,58。每小时的淋巴样本可合并或单独保存。将淋巴液转移至超速离心管中，加入0.9% NaCl混合，然后小心地在其上方覆盖300–500 µL的0.87% NaCl溶液。样品在4 °C条件下以110,000 × g离心16小时。收集含有分离乳糜微粒的上层组分，并使用甘油三酯检测试剂盒测定其甘油三酯浓度。简要步骤如下：在96孔板中，取2 µL乳糜微粒（1:10稀释）与200 µL酶试剂在室温下孵育10分钟。使用酶标仪在500 nm波长下读取吸光度，利用标准品和空白对照计算甘油三酯浓度。随后可通过负染色和透射电子显微镜（TEM）测定乳糜微粒的大小14,29。甘油三酯和胆固醇可通过化学检测试剂盒定量，载脂蛋白含量（apoB-48、A-I、C-II、C-III）则可通过ELISA试剂盒或Western blot检测。
确定脂质吸收的主要部位48，59 
通过在灌注3H-甘油三酯或放射性标记混合膳食后6小时，分离十二指肠、空肠和回肠的管腔及上皮细胞区室，并对内容物进行Folch提取，以确定有多少3H-甘油三酯被正常吸收进入上皮细胞膜，或异常滞留在小肠各段的管腔中48。若存在胃肠道动力差异的可能性60，61，62，或涉及胆汁酸（在脂质吸收过程中高度活跃，且自身在回肠被重吸收）的假设63，64，65，66，或怀疑营养物质在错误的解剖位置（如回肠甚至结肠）被吸收67，68，69，70，此类研究尤为重要。
鉴定 3H-甘油三酯进入吸收性上皮细胞的转运机制48 
通过计算肠道腔内3H-甘油三酯水解为3H-游离脂肪酸的比例，以及被黏膜吸收后在分泌为乳糜微粒前重新酯化为细胞内3H-甘油三酯的比例来实现。该方法是吸收/分泌缺陷的有力标志物，因为它可追踪饮食来源的甘油三酯转化为其分解产物并进一步包装为乳糜微粒的全过程。脂肪酸吸收相关分子（CD36、FABPs、ACSLs）、再酯化通路（MGAT、DGAT、MTTP、apoB）以及载脂蛋白（apoC-III、B-48、C-II、A-I、A-IV）的mRNA表达水平可通过RT-PCR进一步定量分析。
该技术的未来应用仅受限于人们对肠-器官相互作用、代谢、免疫、营养吸收、环境饮食污染物或任何其他涉及胃肠道系统的疾病的研究兴趣。许多有说服力的实验和假设可能因难以获取关键的肠系膜淋巴系统而停滞不前，本可视化方案的目标正是使该技术更易于推广和使用。分离乳糜微粒及其最初所处的肠系膜淋巴液，是理解全身代谢的关键环节；小鼠1天淋巴瘘模型是研究这些生理过程的强大模型。

肠系膜淋巴系统的重要生理功能 
自约公元前300年起，肠系膜淋巴系统便以某种形式被描述；当时赫罗菲拉斯（Herophilos）描述了肝门静脉系统以及肠道中的所有&#34;吸收性静脉&#34;1,2,3,4,5。在此最初描述之后的1700多年里，肠道淋巴系统的一个显著特征是在进食后不久肠系膜淋巴中出现乳白色液体3。现已明确，这种含有乳糜微粒的乳白色淋巴液（&#34;乳糜性&#34;淋巴）并不流入门静脉和肝脏，而是经乳糜池进入胸导管，最终在左侧锁骨下静脉处汇入血液循环6。由于这种解剖结构，乳糜性淋巴在进入全身循环之前，会首先流经心脏和肺部。这意味着心脏和肺部会首先接触进入肠系膜淋巴的分泌物，即经历一次&#34;首过&#34;过程7。
肠系膜淋巴管的一个主要功能是将膳食脂质从小肠运输至其他部位8,9,10。从解剖学角度看，乳糜微粒、肠道免疫细胞11,12,13,14、肠道激素15,16,17,18、抗原19,20,21、非乳糜微粒类亲脂性化合物22,23以及过量液体进入位于肠上皮细胞基底膜下方的乳糜管，随后通过淋巴毛细管被输送并浓缩至肠系膜淋巴结。肠系膜淋巴液中可能还含有许多尚未明确的组分，包括代谢物、抗原、环境污染物、营养物质以及信号分子。
肠系膜淋巴液的成分尚未得到系统鉴定，这主要是由于分离肠系膜淋巴液存在困难。获取肠系膜淋巴液一直是一项严峻的挑战，因为淋巴管无色透明，除了在摄入高脂饮食后会因乳糜生成而呈现乳白色外，肠系膜淋巴管内通常含有无色的淋巴液6,8,9,10。
当前用于分离肠淋巴液的常用方法 
除极少数严重胃肠道创伤的特殊情况外，人类无法获取肠系膜淋巴液24。体内淋巴液采集手术复杂且技术要求高。最初的为期两天的淋巴瘘手术由 Bollman 等人描述25，并在过去45年中由 Patrick Tso 实验室不断改进并规范化26,27。淋巴瘘手术使研究人员能够在为期6小时的十二指肠脂质输注期间，从清醒动物体内持续采集流动的淋巴液。
淋巴瘘模型主要用于大鼠，以测量淋巴流速、甘油三酯和胆固醇（或其他经十二指肠灌注的化合物）的输出量、乳糜微粒组成以及肠道激素浓度。该技术在小鼠中的应用相对较少，因为手术存活率和淋巴液量均较差。由于肠系膜淋巴管难以观察，历史上曾采用在较大动物（如小型猪28、绵羊29、猪30、狗31和大鼠17）中插管肠系膜淋巴的方法。使用这些较大动物模型需要大量资源，且无法用于基因敲入或敲除模型的研究。
替代方法&#160;也已采用其他方法。乳糜微粒可在餐后状态下从血液中分离（尽管这些乳糜微粒会被血浆脂蛋白脂酶部分水解）32,33,34,35胸导管也可进行插管，但由此收集的淋巴液含有肠系膜淋巴液与肠道外淋巴引流液的混合成分。26,36. 体外Caco-2 细胞在脂肪酸处理后会分泌一种类似乳糜微粒的颗粒，这些细胞可与相关的淋巴内皮细胞或血管细胞共培养37,38人类和小鼠肠道类器官培养物已被证实能够处理顶端脂质并分泌乳糜微粒39,40,41,42这些模型具有显著优势，能够深入揭示小肠生理学的机制，但无法复制小肠的复杂性、理化梯度或动态的淋巴流动 原位 肠系膜淋巴管
本文介绍的1天小鼠淋巴瘘模型的优势 
与其他分离肠道脂蛋白的方法相比，Tso实验室的淋巴瘘技术传统上被认为是测量膳食营养素进入肠系膜淋巴液吸收情况的金标准技术。这种体内方法能够捕捉膳食脂质吸收过程中的关键生理特征——即化合物在吸收期间动态出现的过程，这需要对接受十二指肠营养物灌注的活体动物持续采集流动的肠系膜淋巴液。该手术技术还能在生理环境腔室中直接测定肠道激素和细胞因子，而非在血液中检测，因为在血液中这些物质会被稀释并遭受酶解降解17,43。
如果实验问题需要了解脂质分泌动力学，或任何疏水性胃肠道化合物或药物的动态吸收与代谢过程，那么该技术不仅适用，而且是唯一能够推断管腔内容物从近端到远端肠道（从胃到结肠）以及从顶端到基底外侧表面（从管腔内容物经肠上皮细胞进入乳糜管和门脉循环）移动过程的方法。由于该技术通过十二指肠内导管向管腔递送营养物质，并且流动的肠系膜淋巴液被分流并收集，整个吸收系统处于实验控制之下，可用于定性评估小肠吸收特征。
首次以可视化形式展示的是对Tso实验室淋巴瘘模型的一项重大改进，该改进（1）将实验时间缩短至1天的手术植入和样本采集周期；（2）提高了小鼠的存活率并改善了动物福利；（3）增强了该方法在小鼠中的可重复性，从而充分发挥小鼠遗传模型的优势。该技术应被视为研究肠道分泌物、脂蛋白或膳食脂质吸收相关所有实验问题的金标准，也是高保真测定脂质吸收动力学和乳糜微粒的最佳技术。

<table><tbody><tr><td>0.9%氯化钠注射液，USP&amp;nbsp; 无菌的</td><td>美国伊利诺伊州莱克福里斯特，Hospira公司</td><td>NDC 0409-4888-06</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>7200184</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C-胆固醇：胆固醇-[4-14C]（0.1 mCi/mL）</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc.，美国密苏里州圣路易斯</td><td>ARC 0857</td><td></td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>Becton Dickinson，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>2 把 Dumont 显微解剖镊</td><td>Fine Science Tools，福斯特城，加利福尼亚州，美国</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>2 把镊子</td><td>ROBOZ 外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡</td><td>RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H-TAG:&amp;nbsp; 三油酸甘油酯 [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1 mCi/mL)</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc.，美国密苏里州圣路易斯市</td><td>ART0199</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H-TG 三油酸甘油酯 [9,10-3H(N)] (&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H-TG</td><td>American Radiolabeled Chemicals, INC. 圣路易斯</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>50%葡萄糖注射液，美国药典 25克/50毫升&amp;nbsp; 无菌的</td><td>Hospira，伊利诺伊州莱克福里斯特，美国</td><td>NDC-0409-6648-16</td><td></td></tr><tr><td>Analtech TLC Uniplates：硅胶基质 Z265500-1PAK</td><td>Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>11-101-0007</td><td></td></tr><tr><td>BD CareFusion ChloraPrep 棉签棒</td><td>Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>14-910-501</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘外科洗手液</td><td>Dynarex 公司，美国纽约州奥兰治堡</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>斜切套管针</td><td>布雷因特里科学公司。&amp;nbsp; 美国马萨诸塞州布雷茵特里</td><td>MRE025</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡注射液 Carpuject 预充式注射器 0.3 mg/mL 10支/盒（Buprenex）</td><td>HenrySchein，沃伦代尔，宾夕法尼亚州，美国</td><td>1278184</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 雄性小鼠</td><td>杰克逊实验室，缅因州巴港</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChloraPrep</td><td>Becton Dickinson，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>260100</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇检测试剂盒</td><td>FujiFilm Healthcare，马萨诸塞州列克星敦，美国</td><td>99902601</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇-[4-14C]</td><td>American Radiolabeled Chemicals, INC. 圣路易斯</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>透明亚克力箱 L43 cm × W26 cm × H21 cm，配备温控加热垫和加湿装置</td><td></td><td></td><td>我们自行设计与改进</td></tr><tr><td>市售的&amp;nbsp; 两栖动物/爬行动物加热垫</td><td>中国深圳兴鸿昌电器有限公司，中国深圳</td><td>XHC-F035D</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>22363156</td><td></td></tr><tr><td>十二指肠灌注管 - canuala</td><td>Braintree Scientific，Braintree，MA，美国</td><td>MRE037</td><td></td></tr><tr><td>确保</td><td>Abbott Nutrition，哥伦布，俄亥俄州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫式手术平台与循环温水泵组合</td><td>Patterson Scientific，沃基肖，威斯康星州，美国</td><td>Gaymar T/Pump Classic</td><td></td></tr><tr><td>Hetarin Sodium 注射液，USP 1,000 单位/毫升，无菌</td><td>Mylan，西弗吉尼亚州摩根敦，美国</td><td>NDC-67457-384-31</td><td></td></tr><tr><td>Image J 软件</td><td>美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达</td><td></td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>ROBOZ 外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Pharma Solutions，密歇根州里弗维尤，美国</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷诱导装置和麻醉装置</td><td>Patterson Scientific，沃基肖，威斯康星州，美国</td><td>小鼠诱导室</td><td></td></tr><tr><td>Krazy glue</td><td>Elmer's 产品公司，哥伦布，俄亥俄州，美国</td><td>KG484</td><td></td></tr><tr><td>Liposyn III 20% 脂质可注射液</td><td>美国伊利诺伊州莱克福里斯特市霍斯比拉公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 6500 多功能闪烁计数器</td><td>Beckman Coulter，Brea，CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型解剖弹簧剪</td><td>ROBOZ 外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>小鼠apoB ELISA试剂盒</td><td>ABCAM 公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>ab230932-1</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特市</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>牵开器</td><td>Kent Scientific 公司，托灵顿，康涅狄格州，美国</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl（卡洛芬）</td><td>美国密歇根州卡拉马祖市，硕腾公司</td><td>4019449</td><td></td></tr><tr><td>旋转台 Barnstead Thermolyne</td><td>实验室地震，Z&amp;uuml;瑞士里奇</td><td>Barnstead Thermolyne</td><td></td></tr><tr><td>SMOFlipid 20% 脂质可注射乳剂，USP</td><td>Fresenius Kabi，美国宾夕法尼亚州沃伦代尔</td><td>NDC-63323-820-01</td><td></td></tr><tr><td>依偎</td><td>Lomir Biomedical Inc.，诺特丹德洛&#039;&amp;Icirc;加拿大，勒佩罗，魁北克省，邮编：J7V 7M4</td><td>MS 02.5PM</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>ROBOZ 外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>缝合线（5-0 丝线，带针）</td><td>DemeTECH，美国佛罗里达州迈阿密莱克斯</td><td>DT-719</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜（JEOL 1400-FLASH 120 kV）</td><td>日本电子株式会社，美国马萨诸塞州皮博迪市</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油三酯检测试剂盒</td><td>Randox Laboratories，英国克鲁姆林</td><td>TR210</td><td></td></tr><tr><td>ULTIMA GOLD XR 闪烁液</td><td>Perkin Elmer，Hebron，KY，美国</td><td>6013119</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机，转子 S100AT4-497</td><td>SORVALL RC M120 GX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肠系膜引流淋巴液的分离与定量 在体 内 膳食脂质吸收与乳糜微粒分泌的动力学

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

肠道脂蛋白，尤其是富含甘油三酯的乳糜微粒，是代谢、炎症和心血管疾病的重要驱动因素。然而，分离肠道脂蛋白极为困难 体内 因为乳糜微粒首先由小肠分泌进入肠系膜淋巴管。含有乳糜微粒的淋巴液随后经胸导管汇入锁骨下静脉，将膳食成分输送至心脏、肺部，并最终进入全身循环。由于乳糜微粒中的甘油三酯一旦进入血液循环，便会立即与脂蛋白脂酶及其他脂蛋白受体相互作用而发生水解，因此无法从血液中分离出原始状态的乳糜微粒。因此，历史上一直采用Bollman等人在大鼠中描述的原始2天淋巴瘘技术，用于在淋巴液进入胸导管静脉前分离新鲜的肠系膜淋巴。过去45年来，Patrick Tso实验室对该技术进行了改进与规范化，使得对这些关键脂蛋白及肠道分泌物的分析成为可能。现对Tso淋巴瘘技术进行更新，并首次以可视化方式呈现。该改良后的方法是一种单日手术技术，可在清醒小鼠中植入十二指肠饲管、插管肠系膜淋巴管，并在进食后收集淋巴液。这些新技术的主要优势包括：能够可重复地从小鼠中收集淋巴液（从而充分利用基因工程小鼠模型的优势）；减少小鼠在植入十二指肠灌注管和淋巴导管过程中的麻醉时间；能够在进食及餐后期间持续采集淋巴样本；能够在激素和细胞因子被血液稀释或酶解前对其进行定量测定；以及能够收集大量淋巴液以用于分离肠道脂蛋白。该技术是直接且定量测量膳食营养吸收、肠道脂蛋白合成及乳糜微粒分泌的有力工具。

图2展示了最近接受本研究所述单日淋巴瘘手术的 n = 17 只野生型（WT）小鼠肠系膜淋巴液中甘油三酯的分泌情况以及平均淋巴流速。如图2A所示，经十二指肠推注 300 µL SMOFLipid 后，淋巴液中的甘油三酯浓度随之升高；甘油三酯浓度峰值出现在推注后约 2–3 小时，并在 6 小时时间点（安乐死前即刻）持续下降。与甘油三酯分泌同步，淋巴流速自 0 时推注开始至实验结束期间逐渐升高（图2B）。
这些结果表明，肠系膜淋巴管和十二指肠插管手术均已成功实施，可作为阳性对照，用于评估其他淋巴成分（如激素、肽类、营养物质）的基准。若在十二指肠内单次给予脂质后，淋巴液中的甘油三酯浓度未发生变化，则提示手术可能对小肠造成了严重损伤，导致脂质吸收能力丧失；或者，在此前未表型鉴定的遗传模型中，这可能表明该小鼠存在具有生理学意义的脂质吸收缺陷。
<img alt="小鼠手术时间线示意图；营养物质推注、淋巴液采集、葡萄糖/生理盐水处理过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：淋巴瘘小鼠模型建议的时间线。 T-4、T-3、T-2：双插管手术约需2–4小时，随后将小鼠置于恢复室中。T-1：小鼠进入恢复期后，开始持续经十二指肠输注5%葡萄糖-0.9%生理盐水。T0：持续的十二指肠内输注从5%葡萄糖-0.9%生理盐水切换为实验性营养物质输注。T0–T6：小鼠持续接受十二指肠内输注5%葡萄糖生理盐水，或替代性地输注其他营养物质。在此期间，每小时收集一次淋巴液。终点：处死小鼠，并可采集组织样本。该图使用BioRender.com绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="野生型小鼠随时间变化的肠系膜淋巴液甘油三酯浓度和流速图；脂质输注" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：肠系膜淋巴液甘油三酯浓度与流速。将野生型小鼠置入十二指肠饲管和肠系膜淋巴管插管。小鼠接受一次300 µL脂质的推注输注。在接下来的6小时内，每小时收集一次淋巴液，并置于冰上保存。（A）通过化学检测法测定每小时淋巴液样本中的甘油三酯含量。（B）推注输注后6小时内，淋巴流速以每小时分泌的淋巴液克数表示。数据点表示均值 ± 标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>脂质递送方法</td>
			<td colspan="6">推荐/操作说明</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合脂质乳剂推注</td>
			<td colspan="6">可通过十二指肠内灌注管给予0.3 mL剂量的(A) Liposyn III 20%可注射脂质或(B) SMOFlipid 20%可注射脂质乳剂（USP）。这些乳化脂质具有无需预先配制、室温下呈液态、无菌，且含有“易消化”的游离脂肪酸、甘油三酯、磷脂和牛磺胆酸钠混合物的优点。对于可能存在胰腺或胆道功能不全的小鼠，这是一种理想的起始灌注方式。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甘油三酯推注</td>
			<td colspan="6">可通过十二指肠内灌注管或经口灌胃给予0.3 mL温和预热的橄榄油（或纯化三油酸甘油酯），作为反映富含不饱和脂肪饮食的中性脂质；猪油（反映高饱和脂肪饮食）或椰子油（反映高中链甘油三酯饮食）也可使用。若实验所用甘油三酯为饱和类型，则必须加热至室温下呈液态后使用。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>混合餐推注</td>
			<td colspan="6">可通过十二指肠内灌注给予0.3 mL“安素”（Ensure），其成分为0.075 g脂肪（21.6%）、0.5 g碳水化合物（64.0%）和0.1125 g蛋白质（14.4%），代表一种低脂混合餐。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放射性标记脂质推注</td>
			<td colspan="6">可通过十二指肠内灌注给予含5.0 µCi 3H标记的甘油三油酸酯和/或1.0 µCi 14C-胆固醇的0.3 mL橄榄油。14C-胆固醇：胆固醇-[4-14C]，比活度为55 Ci/mmol，浓度为0.1 mCi/mL；3H-TG 三油酸甘油酯 [9,10-3H(N)] (3H-TG)，比活度为60 Ci/mmol，浓度为1 mCi/mL。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>持续给药</td>
			<td colspan="6">以0.3 mL/h的速率（而非总量0.3 mL推注）输注上述任一实验性营养配方，可使甘油三酯在淋巴液中持续稳定地输出。这与推注式灌注不同：后者淋巴液中甘油三酯浓度在约2–3小时达到峰值，随后在约6–8小时恢复至基线水平。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：脂质输注表。

本实验方案详细描述了一种用于分离小鼠十二指肠内营养物质灌注后流动的肠淋巴液的外科手术方法。该方法可用于生理条件下测定总肠道脂质吸收以及乳糜微粒的合成与分泌情况，以响应不同实验性营养物质的刺激。

肠道脂蛋白，尤其是富含甘油三酯的乳糜微粒，是代谢、炎症和心血管疾病的主要驱动因素。然而，……

本方案使我们能够直接测量流动的肠系膜淋巴液中的餐后代谢情况。这一方法具有重要意义，因为它可让我们定量确定营养物质从小肠进入淋巴的转运过程，同时还能检测细胞因子、膳食脂质、其他膳食成分以及淋巴细胞。该技术可帮助我们解析膳食脂质进入淋巴液的动态过程以及乳糜微粒的合成与分泌。本文介绍的一天模型具有多项优势。首先，它缩短了实验时间。其次，它可减少动物应激反应，提高动物存活率，并整体上降低实验动物使用数量。今天为我们演示该技术的是高级实验外科医生Nick Dedousis先生和研究科学家Lihong Teng博士。在完成小鼠手术前准备后，用镊子夹住皮肤，并用小剪刀做腹部正中切口。然后，沿腹中线向胸骨方向切开，并向下延伸至腹股沟脂肪处。使用牵开器将腹膜内脏器官移开，直至淋巴导管可见。用生理盐水浸湿的棉签将肝脏推向动物体右上方，将肠道和胃部推向动物左侧。然后将十二指肠横向向左牵拉，暴露肠系膜上动脉和肠淋巴导管。取一段30至40厘米长的导管，插入钝针头进行准备。随后，使用1毫升注射器将少量肝素经导管冲洗，再用剪刀在导管末端剪出斜面。然后，使用虹膜剪刀按照文稿中所述方法进行浅层切口并暴露淋巴管。用一对精细镊子夹住套管，轻轻将套管斜面端插入淋巴管内。由于淋巴管较为脆弱，应使用一滴氰基丙烯酸酯胶水将淋巴套管粘附于肠系膜淋巴管中，而非用缝线结扎导管。现在，使用18号针头在幽门括约肌后方的胃幽门区域穿刺一个小孔，将十二指肠灌注管插入胃内，并使其穿过幽门括约肌进入十二指肠约1至2毫米。然后，用5/0丝线作荷包缝合将导管固定于胃壁，并滴加一滴氰基丙烯酸酯胶水密封，以防渗漏。开始向十二指肠内灌注5%葡萄糖溶液和0.9%生理盐水。将器官放回体腔并缝合腹中线切口。将小鼠轻轻放入保暖固定装置中。通过十二指肠持续给予小鼠生理盐水和葡萄糖输注，持续一小时。检查套管是否有淋巴液流动，并开始挤奶式推动淋巴套管以保持淋巴液持续流出。通过十二指肠内输注管注入0.3毫升脂肪乳剂进行经典的脂质输注。随后，将输注液更换为5%葡萄糖和0.9%生理盐水，以每小时0.3毫升的速度持续输注，直至实验结束。收集淋巴液样品，并将预先称重的微量离心管放置60分钟，期间保持淋巴液置于冰上。第二次称量试管重量，以确定每60分钟分泌的淋巴液重量。取出胃、盲肠和结肠，将每个器官分别放入15毫升玻璃管中。将小肠分为三到四个节段。纵向剪开，用2-3毫升冷PBS冲洗组织以收集管腔内容物。使用弯头镊子在2-3毫升冷PBS中刮取各节段，从而将包含上皮细胞及相关固有层的肠黏膜从肌层分离。将所有组织、管腔和黏膜分离物以及肌层置于玻璃管中。淋巴液中的甘油三酯浓度在十二指肠内注射 300 微升 SMOFlipid 后升高。注射后 2 至 3 小时达到甘油三酯浓度峰值，随后在六小时时间内持续下降。从零时开始进行团注输注直至实验结束，淋巴液流速逐渐增加。本方案的主要目标是减少动物应激，提高存活率，并缩短麻醉时间。为实现这些目标，我们用舒适笼具替代了Bollman固定笼，并增加了湿度、保暖和液体补充。我们的一日型松弛瘘管方案可实现实时、活体测量脂质吸收动态变化，同时可用于研究肠道器官间的相互作用、代谢过程、饮食营养吸收以及免疫表型。

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