一种用于研究膜曲率感应蛋白的纳米棒支撑脂双层系统 体外

这种纳米柱支撑的脂双层系统可用于研究膜曲率在细胞活动过程中调控蛋白质和脂质动态分布中的作用。该技术通过在具有预定义膜曲率的专利纳米柱阵列上形成连续的脂双层，实现了对膜曲率的高亚微米级精度和良好的控制。首先，将纳米芯片放入一个10毫升的烧杯中，使图案面朝上。

小心地向烧杯中加入一毫升98%硫酸，确保酸液完全覆盖芯片的正面和背面。缓慢旋转烧杯，并逐滴加入200微升30%过氧化氢，直至整个烧杯变热。确保硫酸和过氧化氢充分混合，形成Piranha溶液，以去除纳米芯片上的有机分子。

将烧杯放入一个次级玻璃容器中，使纳米芯片在 Piranha 溶液中浸泡过夜，以彻底清除杂质。取出烧杯，小心地用移液器将 Piranha 溶液转移至酸性废液容器中。向烧杯中加入 5 毫升去离子水以稀释残留的酸液，随后将其弃入酸性废液容器。

重复此步骤五次。用镊子夹住芯片，并用去离子水持续冲洗，以彻底去除残留酸。用99.9%氮气吹干芯片，以形成SLB。

将脂质混合物超声处理30分钟。在液氮中冷冻脂质混合物20秒，然后在42摄氏度水浴中解冻2分钟。重复冻融循环30次。

随后，脂质混合物呈现为澄清的液体。将脂质混合物通过微型挤出器，来回挤出20次。从另一侧的注射器中收集小单层囊泡（SUVs），以减少较大颗粒或外来物质的污染，并将其转移至1.5毫升离心管中。

用镊子小心地将清洗后的纳米芯片从去离子水中取出，并用纯度为99.9%的氮气吹干。对纳米芯片进行一小时的空气等离子体处理以完成表面清洁。将纳米芯片组装至PDMS腔室中。

首先将芯片放置在清洁的表面上，图案面朝上。用中间的PDMS轻轻覆盖芯片，并确保整个图案暴露在中间PDMS中央大椭圆形开口的中央区域。再将顶部PDMS覆盖在中间PDMS上，并使其两个小孔位于中间PDMS大椭圆孔的范围内。

然后组装PDMS腔室。用移液枪从顶部PDMS的两个小孔之一将SUV加入PDMS通道中，并在室温下孵育15分钟以形成SLB。从一侧小孔轻轻加入PBS缓冲液至PDMS通道中，同时用棉签从另一侧小孔吸除废液，以洗去未结合的SUV。

然后获取在纳米芯片上形成的SLB。使用100倍油镜设置激光扫描共聚焦显微镜。打开Zen软件，选择能够激发脂质和蛋白质荧光的激发激光功率。

选择采集模式，然后依次点击智能设置（Smart Setup）和德克萨斯红（Texas Red）。使用调焦旋钮调节焦距，找到芯片上的纳米条，直至在脂质通道下纳米条边缘清晰可见。

在添加蛋白质之前，设置扫描参数以获取脂质通道的对照图像。通过在随机的单个纳米条区域对荧光标记的脂双层进行漂白来开展荧光漂白恢复（FRAP）实验。选中“实验区域”和“漂白”复选框。

绘制一个直径为五微米的圆形区域，确保整个纳米棒位于中心，并将其添加至实验区域。输入延时成像参数，选择时间序列。

然后点击持续时间。选择 100 个循环，间隔为两秒。输入漂白参数。

选择执行FRAP的激光复选框，并将功率调整为100%。点击“开始实验”以启动FRAP实验。将蛋白质溶液加载到PDMS通道中，并在室温下孵育五分钟，使蛋白质与SLB结合。重新对焦纳米条，并设置扫描参数，以同时获取脂质和蛋白质通道的图像，用于检测蛋白质的曲率感应。

选择实验区域，并在脂质和蛋白质通道上进行荧光漂白后恢复（FRAP）实验，同时进行时间序列成像以表征曲率感应蛋白的流动性。两者均显示在宽度为300纳米、涂覆有支持性脂双层（SLB）的单个纳米条带末端富集增加。此处SLB含有10%磷脂酰丝氨酸（PS），以通过静电作用增强蛋白质结合。

这三种蛋白质的末端与中心比值均高于脂质，脂质的该比值约为一。在比较IDR FBP17与F-Bar时，IDR FBP17更高的末端与中心比值表明其曲率感知能力强于F-Bar。当曲率直径降至400纳米以下时，所有三种蛋白质均优先富集于纳米棒末端的弯曲膜区域。

在这三个蛋白质结构域中，IDR FBP17 产生的纳米棒信号强度和密度最高，表明其具有最强的曲率感应能力，而 F-Bar 结构域的值最低。通过逐步增加蛋白质浓度可绘制出蛋白质结合曲线，结果显示 IDR FBP17 具有强烈的协同性曲率感应能力。与纳米棒上脂质信号的快速恢复相比，F-Bar 在两分钟内无法恢复，表明其在弯曲膜位点的膜流动性及结合动态性显著降低。

令人意外的是，与F-Bar的行为不同，IDR FBP17信号在同一时间段内表现出明显的恢复，表明IDR FBP17在弯曲膜上聚集具有动态特性。然而，在洗去溶液中未结合的IDR FBP17后，IDR FBP17通道中的相同恢复现象不再如先前观察到的那样出现。在研究弯曲膜与蛋白质相互作用时，SLB的质量至关重要。

因此，在本实验中，FRAP 实验对于验证膜流动性是必要的。该系统将帮助研究人员研究各种影响蛋白质与弯曲膜相互作用的参数，例如曲率感应结构域、脂质组成，以及开展关于弯曲膜的动态研究，如相分离行为。