基于适配体的靶标检测通过 3 级 G-四链体等温指数扩增反应进行
2022年10月6日
本协议演示了使用快速，3阶段，基于适体的指数扩增测定来检测目标。涵盖样品制备、信号放大和显色，以实现该系统，以识别茶碱的存在而不是咖啡因的存在。
该方法提供了一种将结合事件的信号放大成可目视检测的形式的方法，以实现低资源使用，或者可以使用基于吸光度的仪器进行量化。这是一种相对快速的单罐方案，用于确定目标样品中是否存在适配体靶标。如果需要定量，可以将结果与标准校准曲线进行比较。
个人在转移和混合溶液时必须非常精确，因为混合不充分会导致负面结果。此外，确保试剂和溶液在使用前保持冷藏，以尽量减少背景信号。首先通过在PCR管中加入五个单位的T4多核苷酸激酶来激活核酶切割产物。
然后，向每个样品管中加入一微升预先制备的5X核酶缓冲液。为了直观地展示特异性，向每个样品管中加入 1.5 微升两毫摩尔茶碱或两毫摩尔咖啡因作为测试样品，并通过移液 5 到 10 次彻底混合每个样品。接下来，向每个样品管中加入两微升含有靶标特异性适体结构域的 600 纳摩尔 RNA，然后移液以快速混合组分。
现在，将管子放在冷块上以最小化背景信号。准备好所有反应管后，将每个样品在室温下孵育三分钟。孵育结束时，立即将样品管放回冰中。
向每个样品管中加入3.5微升nicase聚合酶混合物并充分混合。然后，向每个样品管中加入31.5微升含有模板核苷酸和反应缓冲液的EXPAR反应混合物，并通过移液混合。制备完所有样品后，使用计时器将制备的样品在 55 摄氏度下孵育五分钟。
孵育后立即将样品管放回冰中。向每个样品管中加入两微升血红素溶液以进行显色并充分混合。然后，向每个样品管中加入 58 微升市售 TMB 溶液，充分混合，并孵育以进行显色。
如手稿中所述，用肉眼定性读取样品或使用吸光度酶标仪定量结果。优化后的构建体可以在30分钟内识别低至500纳摩尔的茶碱。暴露于靶标的样品制备物产生蓝色，而不含靶标的样品保持无色。
在显色30分钟后，根据在A450处测量的信号制备标准曲线。在不进行孵育时，将样品保存在冰上很重要，因为即使是优化的RNA仍然会表现出较低的背景活性水平。
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概述
本方案展示了一种快速、三阶段、基于适配体的指数扩增检测方法，用于检测茶碱等目标物。该方法包括样本制备、信号扩增和显色三个步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分析化学
- 生物技术
背景
- 适配体是能够与特定靶标结合的短单链RNA或DNA分子。
- 信号放大对于检测低丰度靶标至关重要。
- 可视化检测方法在资源有限的环境中具有优势。
- 精确操作试剂对于获得准确结果至关重要。
研究目的
- 建立一种快速检测茶碱以区分咖啡因的方法。
- 提供一种用于信号放大的单管反应体系（one-pot）方案。
- 通过标准曲线实现结果的定量分析。
使用的方法
- 利用T4多核苷酸激酶激活核酶切割产物。
- 结合事件的可视化检测。
- 使用基于吸光度的仪器进行定量分析。
- 仔细混合并冷却试剂，以尽量减少背景信号。
主要结果
- 该方法可用于检测样品中的茶碱。
- 结果可进行目视判读或定量分析。
- 溶液操作的精确性对成功结果至关重要。
- 通过适当的试剂管理可最大限度减少背景信号。
结论
- 基于适配体的检测方法是一种快速且有效的靶标检测手段。
- 该方法可适用于资源有限环境中的多种应用。
- 未来的研究可探索更多靶标及对实验方案的优化。
常见问题
行业重要性概述
基于适体的检测系统结合等温指数扩增技术，可为早期发现工作流程中的靶标验证提供快速、灵敏且可通过视觉判读的结果。该三阶段G-四链体扩增方案支持定性与定量检测，有助于在检测方法开发和筛选关键节点做出可靠决策。该方法可提高对靶标结合及特异性的预测可信度，直接影响项目筛选和下游检测的准备工作。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 利用适配体的特异性，实现对分子识别事件的直接检测。
- 通过可视觉检测的输出信号，支持对靶标结合的功能性验证。
- 促进对靶标结合的快速评估，助力机制层面的风险排除。
- 通过区分密切相关分析物，提高对靶标选择性的信心。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化的单管操作流程，确保实验建立的可重复性。
- 通过吸光度测定提供定量结果，实现对化合物的可靠评估。
- 仅需最少的仪器设备，即可实现样本的快速筛选。
- 支持基于标准曲线的定量分析，便于实验标准化。
转化与临床前研究
- 在适配体设计支持下，可适用于与疾病相关的生物标志物检测。
- 通过可扩展的检测形式，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 通过优化的实验方案降低背景信号，减少假阳性风险。
流程与工作流整合
该适体-EXPAR 系统适用于从早期发现到先导物鉴别的连续过程，为分子识别向定量检测方法开发的过渡提供了桥梁。
- 发现生物学：通过确认靶标的存在性和特异性，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复的定量输出，适用于高通量或资源有限的环境。
- 分析：支持基于吸光度的测量和标准曲线生成，用于比较分析。
- 转化研究：若适配体特异性得到确立，可适用于生物标志物检测。
- 企业级复用：实验方案具有模块化特性，通过替换适配体区域即可适配新靶标。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，并减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过快速、标准化且可扩展的方案简化工作流程。
- 战略价值：实现更快速的“推进/终止”决策，并支持资本高效化的检测方法开发。
- 项目组合影响：提供可靠且定量的检测数据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备适配体设计和核酸操作方面的专业知识。
- 需要具备基本的分子生物学仪器设备以及用于定量的吸光度酶标仪。
- 要求精确的试剂操作和温度控制，以尽量减少背景信号。
- 通过修改适配体结构域，该方案可适用于不同目标分子。
- 必须进行仔细优化，以确保特异性并尽量减少假阳性结果。
