Name: 基于流式细胞术的心肌B细胞定量和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: 学习使用流式细胞术定量分析心肌B细胞的方法，该方法可提高B细胞回收率并减少计数变异性。此优化方案适用于心脏免疫学研究，也可扩展应用于肺、肝等器官的免疫细胞分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由授予 Luigi Adamo 的 NHLBI 资助项目 5K08HLO145108-03 和 1R01HL160716-01 资助。
本研究使用的Aurora流式细胞仪由NIH资助项目S10OD026859提供资金支持。我们感谢约翰斯·霍普金斯大学罗斯流式细胞术核心实验室提供的支持。

本手稿中描述的所有实验均经约翰斯·霍普金斯大学医学院动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行。
1. 准备工作
<ol>
	<li>按照表1所述配制FACS缓冲液。</li>
	<li>确保有足够的CO2 用于安乐死动物。</li>
	<li>准备解剖区域（放置实验台垫，并将胶带和解剖工具放在附近）。</li>
	<li>标记15 mL离心管，每管加入3 mL含钙和镁的HBSS（参见材料表），并将离心管置于冰上（每颗心脏对应一管，另加一管用于对照组/流式细胞术对照）。同时，向小号（35 mm）培养皿中加入HBSS。</li>
	<li>打开温控摇床，设置温度为37 °C，并将离心机预冷至4 °C。</li>
	<li>准备注射泵并将流速设为3 mL/min。用20 mL注射器吸取HBSS，用缓冲液预冲管路，并排除所有气泡。</li>
</ol>
2. 血管内B细胞染色（体内）
<ol>
	<li>称取一只12周龄的雄性C57BL/6J品系小鼠。用100 µL B220抗体稀释液（1:10，溶于PBS）装填一支3/10 cc胰岛素注射器。用铝箔包裹注射器以避光。</li>
	<li>麻醉一只小鼠。
	<ol>
		<li>以400 mg/kg剂量经腹腔注射2% 2,2,2-三溴乙醇，等待10–20分钟。 
		注意：监测小鼠的呼吸和运动。当小鼠停止活动后，通过捏脚趾刺激疼痛反应；若无回缩反射，则表明麻醉充分。</li>
		<li>若在20分钟内未达到充分麻醉，可追加100 mg/kg麻醉剂，并每隔5分钟评估一次小鼠的运动状态、回缩反射和呼吸情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠置于实验台面上，台面垫倾斜一侧，轻轻向下拉背部皮肤，并稍用力将小鼠身体压向台面，使眼球突出。</li>
	<li>通过眶后注射方式注入步骤2.1中稀释的B220抗体。
	<ol>
		<li>将注射器从矢状面呈45°角插入小鼠眼眶，缓慢注入溶液。若感到阻力，应退出注射器并重新进针。等待2分钟。 
		注意：延长孵育时间会影响区分血管内与血管外B细胞的能力，因为注射的抗体会有足够时间扩散至血管外。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据IACUC规定实施小鼠安乐死。
	<ol>
		<li>以0.5 L/min的流速向安乐死舱内通入CO2，或根据舱体大小采用推荐流速。</li>
		<li>将小鼠放入舱内至推荐时间，确认其已停止呼吸。取出后实施颈椎脱位作为辅助安乐死方法。</li>
		<li>小鼠安乐死后，立即进行器官采集和灌注。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 心脏采集
<ol>
	<li>胸部切开。
	<ol>
		<li>用镊子夹住小鼠剑突区域的皮肤，使用剪刀在皮肤上做一个约2 mm的切口，然后用镊子将皮肤剥离，暴露出胸部和腹部的筋膜层（一层有光泽且半透明的组织）。在剑突处剪开筋膜和腹膜，打开腹壁，暴露剑突。用止血钳夹住剑突以固定。</li>
		<li>用剪刀沿两侧锁骨中线水平垂直剪开胸壁，抬起前胸壁以暴露纵隔内容物，并使用止血钳作为重物保持切口开放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心脏灌注与取出。
	<ol>
		<li>用镊子清除心脏周围的所有脂肪组织和胸腺组织。</li>
		<li>用镊子从后方牢固夹住主动脉。将注射器针头（25 G）插入心尖部位，以3 mL/min的速度灌注3 mL的HBSS溶液。 
		注意：密切观察灌注过程，肝脏应逐渐充盈，冠状血管内的血液应被完全清除。&#160;建议使用校准为1 mL/min的注射泵，以维持稳定的灌注流速。</li>
		<li>用剪刀剪断主动脉，取出心脏。将心脏置于培养皿中，用HBSS冲洗以去除残留血液。使用剪刀和镊子去除脂肪、结缔组织和胸腺，并将心脏表面吸干。称量分离后的心脏，记录其质量（单位为毫克）。在室温下用刀片将心脏切成小块（1–2 mm）。 
		注意：成年小鼠心脏的质量通常在0.090–0.210 mg之间。</li>
		<li>称取心肌组织质量，取60 mg切碎的心肌组织放入15 mL离心管中，加入3 mL HBSS用于后续消化。保留剩余的心肌组织，放入标记为&#34;对照参考组织&#34;的离心管中；该样本将用于活死细胞信号及自发荧光的补偿对照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 心脏消化与细胞染色
<ol>
	<li>向含有切碎组织的每个试管中加入酶（见表1）。向试管中加入每毫克组织0.5 µL的DNase 1（60 mg心脏组织使用300单位）、每毫克组织0.5 µL的胶原酶II（60 mg心脏组织使用625单位）以及每毫克组织0.2 µL的透明质酸酶（60 mg心脏组织使用50单位）。</li>
	<li>将消化反应置于摇床中，在300 rpm条件下孵育30分钟。将摇床架调节至约25°倾斜角。</li>
	<li>向每个15 mL反应管中加入7 mL HBSS，并在4 °C条件下以250 × g离心5分钟，加速度和刹车设置为中等或慢速。弃去上清液，将每管沉淀重悬于5 mL ACK裂解缓冲液中以去除红细胞。室温下在ACK裂解缓冲液中孵育5分钟。</li>
	<li>向每管中加入10 mL PBS，混匀，然后通过40 µm滤网过滤至50 mL离心管中。确保所有残渣均留在滤网内。用注射器活塞将滤网上的残渣压碎，直至其完全悬浮于滤网腔内。</li>
	<li>通过滤网继续加入PBS，使每份心脏组织的总体积达到25 mL；此步骤可使悬浮细胞通过滤网。向对照参考组织管中额外加入25 mL PBS，并将总体积分装至不同离心管中（每管25 mL）。将其中一管标记为&#34;未染色&#34;，另一管标记为&#34;活死染色&#34;。在4 °C条件下以250 × g离心5分钟。 
	注意：此时应准备活死染料的稀释液（稀释比例：1:500，溶于1× PBS）。</li>
	<li>弃去上清液，将“未染色”管中的沉淀重悬于100 µL PBS中，其余各管沉淀分别重悬于100 µL活死染料稀释液中。冰上避光孵育30分钟，用铝箔覆盖冰桶以避光。</li>
	<li>向每个样品中加入500 µL FACS缓冲液，并通过40 µm滤网转移至标记好的FACS管中。在4 °C条件下以250 × g离心FACS管5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL FACS缓冲液中。</li>
	<li>除“未染色”和“活死染色”管外，向其余每管中加入50 µL Fc封闭液（见表1）。混匀后孵育5分钟。</li>
	<li>除“未染色”和“活死染色”管外，向其余每管中加入50 µL抗体混合液（见表1），避光孵育30分钟，用铝箔覆盖冰桶以避光。</li>
	<li>向每管中加入2 mL FACS缓冲液，在4 °C条件下以250 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于300–500 µL FACS缓冲液中。</li>
</ol>
5. 流式细胞术
<ol>
	<li>设置仪器控制参数。 
	注意：&#160;本方案中，样本使用配备4激光器的Cytek Aurora流式细胞仪进行分析。也可采用其他合适的流式细胞仪检测目标标志物。&#160;
	<ol>
		<li>打开仪器控制软件（参见 材料表）。在窗口顶部，选择 采集 标签，然后单击 新增 +一个名为 创建新实验 将显示。</li>
		<li>在 文献库栏目， 在该领域 输入以筛选，PE型，PerCP-Cy5.5，BV421，Alexa Fluor 700，以及Zombie Aqua，点击 添加 输入每个后，荧光染料名称应显示在右侧。然后单击 下一步 继续进行到下一步 组 表。</li>
		<li>在 组 点击标签中的试管图标，添加心脏以进行分析。</li>
		<li>点击 + 参考文献 组，将显示一个窗口。在荧光标签列中选择 僵尸 Aqua，在对照类型列中选择 细胞，然后点击 保存.</li>
		<li>点击 下一步 &#62; 标记物 标签；将显示一个表格，其中列出荧光染料的名称。在每列荧光染料的第一行输入相应的细胞标记物名称并输入 输入CD45 标记 PerCP-Cy5.5；CD19 标记 BV421；CD11b 标记 Alexa Fluor 700；B220 标记 PE；活死细胞染色使用 Zombie Aqua。</li>
		<li>点击 下一步 两次前往 采集 标签。在 需要记录的事件 实验组类型为10,000,000，参考组行类型为200,000，点击 保存并打开其他设置应保持默认。 停止时间 至 10,000，且 终止体积 至 3,000。</li>
		<li>在左下角点击 仪器控制设置 电压 FSC-50、SSC-175、SSC-B-175。然后，选择 采集控制. 对于 流速 选项，选择 高 从下拉菜单中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用流式细胞仪获取参考样本，并在软件中进行解混分析。
	<ol>
		<li>涡旋未染色的心管，并将其牢固地放置在样品进样口（SIP）上。确保绿色指示箭头指向正确的样品，然后点击 开始 在 采集控制 在细胞仪软件面板上等待事件被记录。对经活死细胞染色的心脏组织进行相同操作。</li>
		<li>选择 解混 菜单并设置以下控件：
		<ol>
			<li>在库的列中选择 PE、PerCP-Cy5.5、BV421 和 Alexa Fluor 700 对应的复选框。确保同一列中 Zombie Aqua 未被选中。在底部勾选该选项 自体荧光作为一种荧光标记.</li>
			<li>点击 下一步 继续进行到 鉴定阳性/阴性群体 在该选项卡中，将显示FSC-A与SSC-B-A的散点图。点击并拖动多边形的顶点，在FSC-A轴上选择1.0 M至4.0 M之间的区域，在SSC-B-A轴上选择0.2 M至3.0 M之间的区域。</li>
			<li>在右侧的下一个图中，V5-A 将显示在 X 轴上。移动门控以选择最右侧峰的一半作为阳性，左侧区域作为阴性。在标题为“Reference Group - Unstained”的图中，选择一个范围相似的群体。对于该样本，需设置为未染色，无需划分阳性-阴性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取实验样本。
	<ol>
		<li>对于每支含有单个鼠样本的离心管，充分涡旋振荡后将其牢固地放置于SIP上。确保绿色指示箭头对准正确的样本，然后点击 开始 在 采集控制 细胞仪软件的面板，并等待记录事件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>门控策略。
	<ol>
		<li>选择 默认未混合工作表 制备一张FSC-A与SSC-A的散点图 点图工具 在上方。在FSC-A轴上选择高于0.4 M、在SSC-A轴上选择高于0.8 M的事件，使用 多边形选择工具双击此选区，将显示一个新的图表。</li>
		<li>从新创建的图表中，右键单击 X 轴标签 并选择 AF-A；右键单击 Y 轴标签 并选择 活-死染色. 点击 矩形选择工具 在上方并选择10以下的所有事件5 在 活细胞-死细胞轴&#160;对应较低的活-死信号。双击此选区将显示一个新的图表。</li>
		<li>在新图表中，右键单击以选择 PerCP-Cy5.5-A X轴 SSC-A Y轴。使用 矩形选择工具，选择高于10的事件4 在PerCP-Cy5.5-A轴上对应于CD45阳性细胞的位置。双击该选区，将显示一个新的图谱。</li>
		<li>在新图表上右击以选择 FSC-A X轴 FSC-H Y轴。使用 多边形选择工具&#160;选择FSC-A值与SSC-A值趋势一致的事件；通过此操作可去除细胞双联体，所选区域内的细胞群称为CD45+细胞群。双击该选区，即可显示包含CD45+细胞群的新图谱。</li>
		<li>从CD45+细胞群图中，右键单击以选择 BV421 X 轴为 vs. Y 轴为 SSC-A。使用 多边形选择工具，选择右侧的群体 BV421 轴。这是B细胞群体。在此群体中双击两次，以创建两个包含B细胞群体的新图。
		<ol>
			<li>右键单击以设置第一个B细胞图 PE-A 在X轴上 BV421-A 纵轴。右侧的细胞群对应血管内B细胞，左侧的细胞群代表间质B细胞。使用 多边形选择工具 同时选择两者。</li>
			<li>右键单击以设置第二个B细胞图 Alexa Fluor 700-A 在X轴上 SSC-A 纵轴。左侧的群体对应 CD11b- 细胞，右侧的事件（如有）对应 CD11b+ 细胞。</li>
			<li>右键单击每个选项，然后单击 门控特性. 点击 计数 和 % 父代 以显示大小和百分比。记录事件数量及百分比，用于后续数据分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li>
<li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li>
<li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li>
<li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377(2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li>
<li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2%28-%29+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li>
<li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li>
<li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta%281%29-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li>
<li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li>
<li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li>
<li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603(2017).</li>
<li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li>
<li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%28gamma%29+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li>
<li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li>
<li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li>
<li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state+of+knowledge+on+aetiology%2C+diagnosis%2C+management%2C+and+therapy+of+myocarditis%3A+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cardiac+cellular+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis%2C+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015(2019).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%3A+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li>
<li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li>
<li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction%3A+an+experimental+medicine+safety+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li>
<li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4%2B+T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li>
</ol>

Luigi Adamo 是 i-Cordis, LLC 的联合创始人，该公司致力于开发用于治疗心力衰竭的免疫调节分子，尤其关注B细胞调节药物吡非尼酮的衍生物。其余作者声明无利益冲突。

越来越多的证据表明，B细胞在心肌生理以及心肌对损伤的重塑/适应过程中发挥着重要作用7,8,9,10,11,12,13,36。流式细胞术是研究任何组织中免疫细胞群体的极佳工具，对于专注于心脏B细胞的研究而言，几乎已成为必备手段。
关于B细胞与心脏的新兴文献已在一些非常基础的方面报道了相互矛盾的研究结果，例如心脏中B细胞的数量以及心肌损伤后B细胞数量的变化。有研究报道称B细胞是啮齿类动物心脏中最丰富的免疫细胞7...

B淋巴细胞是一类高度特化的免疫细胞，在适应性免疫和固有免疫应答中均发挥重要作用1。B细胞主要有两种群体：数量较少的B1细胞，主要在胚胎期产生；以及占主导地位的B2细胞，在成体生命阶段由骨髓产生1。B细胞在骨髓中成熟后，迁移至初级和次级淋巴器官，并从此在淋巴器官之间持续循环，经由血管和淋巴管进行迁移2。B细胞在其表面表达特异性抗体，这些抗体作为受体发挥作用。当B细胞遇到与其受体结合的抗原时，可触发激活信号。活化的B细胞或迁移至抗原所在组织，或返回骨髓，在骨髓中可进一步分化为产生抗体的浆细胞3,4。
近年来，人们逐渐认识到心脏中存在大量B细胞。在啮齿类动物中的研究表明，B细胞在胚胎发育早期即定植于心脏5，且与心肌相关的B细胞主要为附着于血管内皮的血管内幼稚B2细胞6,7，其中仅含少量B1细胞7。尽管目前仍存在诸多未明确的领域，但现有数据表明，B细胞在正常心脏以及心肌对损伤的适应性反应中均发挥着重要作用。
在未受刺激的小鼠心脏中的研究表明，稳态下心肌B细胞主要位于血管内腔，黏附于血管内皮。&#62;95%的小鼠心脏B细胞被发现位于血管内空间。这些B细胞的基因表达模式与从外周血中分离的循环B细胞不同。对B细胞缺乏动物及其同基因型对照动物的未受累心脏进行分析发现，缺乏B细胞的动物心脏更小，射血分数更高。6所有这些证据表明，B细胞可能调节心肌生长和/或心肌功能，且不仅间质中的B细胞，血管内的B细胞也可能对这些现象负有责任。此外，B细胞还被发现能够调节心肌驻留巨噬细胞的表型。8.
多项研究表明，B细胞在心肌损伤后的适应过程中发挥着重要作用8,9,10,11,12,13。B细胞会通过CXCL13-CXCR5依赖性机制短暂地在受损心脏中聚集11,13。随后，B细胞可通过多种机制促进心脏不良重塑，其中包括通过细胞因子介导的单核细胞募集9,12。此外，B细胞还可产生针对心脏蛋白的抗体，这些抗体可通过多种机制促进心肌损伤的扩展和心脏不良重塑14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25。B细胞还可通过分泌IL-10对受损心脏产生保护作用10。
随着研究B细胞在未受刺激及受损心脏中作用的科研团队日益增多，制定统一的实验方案以准确定量和评估心肌B细胞变得愈发重要，从而避免文献中已开始出现的不一致结果。事实上，目前已有报道显示，B细胞在啮齿类动物心脏中既是数量最多的免疫细胞之一7，又较髓系细胞显著稀少26,27，甚至极为罕见28。同样，多个研究团队报道急性缺血性心肌损伤后心肌B细胞数量增加7,9,13，但也有团队报告损伤心肌中B细胞数量无变化29。关于心脏免疫细胞的研究很少详细描述灌注条件，且在组织消化条件方面尚无共识。由于在啮齿类动物心脏中大部分B细胞位于血管内，而心肌免疫细胞的提取效率高度依赖所采用的消化方法，因此文献中报道的差异可能源于器官灌注和组织消化方法的不同。
本文介绍了一种基于流式细胞术定量小鼠心肌B细胞的详细方法，通过优化灌注和消化条件，最大化B细胞回收率，并能够区分心肌内血管内与血管外B细胞6。本方案是在其他可区分血管内与间质免疫细胞的类似方案基础上进行的改进与优化28,30,31。
在此方案中，我们通过标准化心肌灌注以清除漂浮的B细胞&#160;在血管内空间中保留黏附于微血管内皮的具有生物学意义的B细胞，而不将其清除。此外，基于先前已描述的通过静脉注射抗体以区分血管内与间质免疫细胞的实验方案32，并利用B细胞表达表面标志物B220这一特性33我们展示了如何通过在动物处死和心脏灌注前立即注射B220特异性抗体，以区分心肌内血管内与血管外的B细胞。该方案适用于所有希望在正常及损伤心脏中开展心肌B细胞分析的研究人员。本方案的广泛应用将减少不同研究团队之间的结果不一致性，有助于分析心肌血管内和血管外B细胞群体的变化，从而推动心脏免疫学领域的研究进展。
综上所述，该实验方案提供了一种优化的流程，可通过流式细胞术定量和分析心肌中的B细胞，同时区分位于血管外空间和血管内空间的细胞。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 700 抗小鼠/人 CD11b 抗体</td><td>101222</td><td>BioLegend</td><td>100 &amp;micro;g 200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>(CellTreat 29481) 细胞滤筛，40 &amp;micro;m，蓝色</td><td>QBIAP303</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 无色微量离心管</td><td>1605-0000</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液，USP</td><td>114-055-101</td><td>Quality Biological</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>1.5 mL 无色微量离心管</td><td>1615-5500</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 带刻度 TipOne 滤芯吸头</td><td>11213810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 带刻度 TipOne 滤芯吸头</td><td>11267810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管，插塞密封盖，聚丙烯材质，无 RNase/DNase</td><td>430052</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>单向止流阀，聚碳酸酯材质</td><td>SVPT951</td><td>ECT Manufacturing</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-三溴乙醇</td><td>T48402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 带刻度 TipOne 滤芯吸头</td><td>11208810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>三通止流阀，聚碳酸酯材质</td><td>SVPT953</td><td>ECT Manufacturing</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管，12 x 75 mm 规格</td><td>352054</td><td>Falcon, a Corning Brand</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管，插塞密封盖，聚丙烯材质，无 RNase/DNase</td><td>430290</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液</td><td>118-156-101</td><td>Quality Biological</td><td>渗透压：290 ± 5% mOsm/Kg H2O</td></tr><tr><td>适配器 4x50 mL，用于转子 A-4-63 的 250 mL 矩形吊篮</td><td>5810759005</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管适配器，每个适配器可容纳 9 支管，锥形底，适用于转子型号 A-4-62</td><td>22638289</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>适配器，用于 15 支圆底管（2.6 &amp;ndash; 7 mL），适用于转子 A-4-62 的 250 mL 矩形吊篮</td><td>22638246</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>铝箔，12 英寸 x 75 英尺卷，厚度 0.0007 英寸</td><td>UPC 109153</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td></tr><tr><td>麻醉诱导室 - 小鼠用</td><td>RWD-AICMV-100</td><td>Conduct Science</td><td></td></tr><tr><td>BD 鲁尔滑动针头注射器，附带 25 G × 5/8 英寸针头，无菌，一次性使用，1 mL</td><td>309626</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Brandzig 超细胰岛素注射器，29G，1 cc，1/2&quot;，100 支装</td><td>CMD 2613</td><td>Brandzig</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 抗小鼠 CD19 抗体</td><td>115537</td><td>BioLegend</td><td>50 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>带滤网（35 &amp;micro;m）的流式管盖，适用于 12 x 75 mm 管的双位置设计，无菌</td><td>T9009</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳 USP E CGA 940&amp;nbsp;</td><td>CD USPE</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials 低型烧杯，玻璃材质，500 mL</td><td>UX-34502-46</td><td>Cole-Parmer</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 2</td><td>LS004176</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>黄铜镀铬接头，1/4&quot; 内螺纹 NPT × 1/4&quot; 插管</td><td>Y992611-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora 流式细胞仪</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Diss 1080 接头 1/4 BARB CP</td><td>M-08-12</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>DNase I - 40,000 U</td><td>D4527</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Easypet&amp;nbsp;3 - 电子移液控制器</td><td>4430000018</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>电子天平，AX223/E</td><td>30100606</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R 离心机</td><td>5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 单通道可调移液器</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.1</td><td></td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>GLACIERbrand 三层密度冰盒（IPAN-3100）</td><td>Z740287</td><td>Heathrow Scientific</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) - 含 Ca2+ 和 Mg2+</td><td>14025076</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>H3506</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Kelly 止血钳，直型</td><td>13018-14</td><td>Fine Science Tools</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔滑动注射器，无菌，一次性使用，20 mL</td><td>302831</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>M1 可调减压阀 0-100 PSI/CGA940</td><td>M1-940-PG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>McKesson 中等吸收垫</td><td>4033-CS150</td><td>McKesson</td><td></td></tr><tr><td>Navigator 多功能便携式天平</td><td>NV2201</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1X) 无 Ca2+ 和 Mg2+</td><td>10010023</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>PE 抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体</td><td>103208</td><td>BioLegend</td><td>200 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD45 抗体</td><td>103132</td><td>BioLegend</td><td>100 &amp;micro;g 500 uL</td></tr><tr><td>培养皿，可堆叠，35 mm × 10 mm，无菌聚苯乙烯</td><td>FB0875711YZ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>包装：Diss 1080 螺母/CO2/CO2-02</td><td>M08-1</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>6 瓦高亮度 LED 双蛇形颈照明灯</td><td>LED-6W</td><td>AmScope</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 针头 25 G × 5/8 (0.5 mm × 16 mm)</td><td>305122</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 阻断剂）克隆 2.4G2（RUO）</td><td>553141</td><td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td><td>0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td>The R Foundation</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>9501250000</td><td>Accutec Blades Inc</td><td></td></tr><tr><td>分析级双级调节器，0-25 psi 输出，CGA320 接口，3500 psi 输入</td><td>Y12244A320-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>转子 A-4-62，包含 4 个 250 mL 矩形吊篮</td><td>转子 A-4-62</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯移液管，10 mL，无菌，无热原/内毒素，无细胞毒性，每片独立包装</td><td>86.1254.001</td><td>Sarstedt AG &amp; Co KG</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 标签胶带</td><td>L8394</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>SpectroFlo 3.0.0</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Spex VapLock 鲁尔接头，聚丙烯材质，直型，公鲁尔锁 × 1/8&quot; 软管插管；1 个/每件</td><td>MTLL230-6005</td><td>Spex</td><td></td></tr><tr><td>标准壁实验室软管，S2 规格，Excelon，内径 1/8&quot; × 外径 3/16&quot; × 壁厚 1/32&quot; × 长度 50 英尺</td><td>CG-730-003</td><td>Excelon Laboratory</td><td></td></tr><tr><td>无针聚丙烯/聚乙烯注射器，3 mL</td><td>Z683566</td><td>Millipore Sigma</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>55-1199 (95-240)</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td></tr><tr><td>Thomas 三通道报警计时器 TM10500</td><td>9371W13</td><td>Thomas Scientific</td><td></td></tr><tr><td>试管架，12&amp;nbsp;孔位，其中 6 孔用于 5.0&amp;nbsp;mL 和 15&amp;nbsp;mL 试管，6 孔用于 25&amp;nbsp;mL 和 50&amp;nbsp;mL 试管，聚丙烯材质，带编号孔位，可高压灭菌</td><td>30119835</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>试管架，12&amp;nbsp;孔位，用于 5.0&amp;nbsp;mL 和 15&amp;nbsp;mL 试管，聚丙烯材质，带编号孔位，可高压灭菌</td><td>30119827</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>TYGON R-3603 实验室软管，内径 &amp;times; 外径 1/4 英寸 &amp;times; 3/8 英寸</td><td>T8913 (Millipore Sigma)</td><td>Tygon, Saint-Gobain</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 涡旋振荡器</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>VWR 带导向销解剖镊，弯曲尖端</td><td>89259-946</td><td>Avantor, by VWR</td><td></td></tr><tr><td>VWR 解剖剪，锐利尖端，4&amp;frac12;&quot;</td><td>82027-578</td><td>Avantor, by VWR</td><td></td></tr><tr><td>VWR 恒温轨道摇床，型号 3500I</td><td>12620-946</td><td>Avantor, by VWR</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒</td><td>423102</td><td>BioLegend</td><td></td></tr></tbody></table>

基于流式细胞术的心肌b细胞定量与分析

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

越来越多的证据表明，B淋巴细胞在心肌生理学以及心肌对损伤的适应过程中发挥着重要作用。然而，文献中关于心肌B细胞存在比例的报道存在相互矛盾的数据。有研究报道B细胞是啮齿类动物心脏中最常见的免疫细胞之一，也有研究指出B细胞虽然存在，但其比例明显低于髓系细胞，甚至极为稀少。类似地，多个研究团队描述了急性缺血性心肌损伤后心肌B细胞数量增加的现象，但也有一个团队报告称损伤心肌中的B细胞数量并无变化。建立一种统一且可重复的方法来评估心肌B细胞的比例，对于协调不同研究团队之间的观察结果、推动B细胞与心肌相互作用研究的发展至关重要。根据我们的经验，文献中看似矛盾的观察结果很可能源于以下事实：小鼠心肌中的B细胞主要位于血管内，并与微血管内皮细胞相连。因此，从小鼠心脏中回收的B细胞数量对用于清洗器官的灌注条件以及所采用的消化方法极为敏感。本文介绍了一种针对这两个关键变量进行专门优化的实验方案。该方案能够实现对小鼠心肌B细胞数量进行可重复的、基于流式细胞术的分析，并使研究人员能够区分血管外与血管内的心肌B细胞。

采集完成后，收集所有事件，应根据标准流式细胞术实践进行数据分析。分析的重点将根据每个实验的具体目标而有所不同。本实验旨在定量分析血管内和血管外B细胞，并以每毫克组织中的细胞数量表示。
使用光谱流式细胞仪时，建议首先进行初步设门分析，以去除尺寸不在免疫细胞范围内的碎片，随后去除活死染料阳性信号。这有助于检测到干净的CD45阳性细胞群体，对应于白细胞（图1）。在去除双联体后，在未受伤的 naive 心脏中，预期约有20%的CD45+细胞为CD19+ B细胞（图2A，本代表性实验中为18.1%的B细胞）。在这些细胞中，平均约5.5%位于间质空间，而94.5%位于血管内空间（图2B）。从心脏中发现的全部B细胞群体来看，仅约1.6%的细胞基于表面标志物CD11b被归类为B1细胞（通常认为该标志物足以以较高置信度将小鼠CD19+细胞鉴定为B1细胞1,</sup...

本文报道了一种基于心肌B淋巴细胞在血管内或内皮空间位置，利用流式细胞术对其进行定量和区分的实验方案。

基于流式细胞术的心肌B细胞定量与分析

越来越多的证据表明，B淋巴细胞在心肌生理以及心肌对损伤的适应过程中发挥着重要作用。

文献中关于心肌B细胞 prevalence 的数据存在差异，这可能源于灌注和消化技术的变异性。本方案可实现对心肌B细胞进行可重复的基于流式细胞术的分析。该技术可最大化B细胞的回收率，并减少心脏样本中B细胞及其他细胞群在流式细胞术计数中的变异性。这种优化的消化与分离方法可轻松调整，以扩展抗体组合，用于研究心脏中的不同免疫细胞类型。该方案还可应用于其他器官，如肺或肝，以研究与这些器官相关的B细胞。首先，称量一只12周龄的雄性小鼠。用310-cc胰岛素注射器吸取100微升B220抗体溶液。通过眼后眶注射稀释后的B220抗体，并立即进行器官采集和灌注。处死小鼠后，用镊子夹住小鼠剑突部位的皮肤。用剪刀在皮肤上剪开一个约两毫米的切口，然后用镊子将皮肤剥离，暴露筋膜层。在剑突部位沿筋膜和腹膜剪开。 用止血钳夹住剑突。在两侧锁骨中线水平的胸壁做垂直切口，抬起前胸壁以暴露纵隔内容物。用镊子从后方牢固夹住主动脉。将注射器针头插入心脏心尖部位。以每分钟3 mL的速度灌注3 mL HBSS。剪断主动脉并取出心脏。用HBSS在培养皿中清洗心脏。称量分离后的心脏并记录重量（单位为毫克）。在室温下用刀片将心脏切成小块。心脏组织块的大小应约为1.5毫米。使用天平称量心肌组织的质量，并将60毫克剪碎的心肌组织置于含有3毫升HBSS的15毫升离心管中，冰上放置用于消化。对未接受B220抗体注射的小鼠重复此操作，并将其放入另一标记为“参考对照组织”的离心管中，该管内含有3毫升HBSS。向每支含有剪碎组织的试管中加入酶。每毫克组织加入 DNase I 0.5 微升、collagenase II 每毫克 0.5 微升，以及 hyaluronidase 每毫克 0.2 微升。将消化反应置于摇床中，在 300 转/分钟的条件下孵育 30 分钟。将试管以较小角度（约25度倾斜）放入摇床中。向每个15毫升离心管中加入7毫升HBSS，并在4摄氏度下以250 G离心5分钟。倒去上清液后，用5毫升ACK裂解缓冲液重悬每个沉淀。室温孵育5分钟。每管加入10毫升PBS后混匀，并用40微米滤网过滤至50毫升离心管中。用注射器活塞压碎滤网上的任何残渣，确保所有物质均通过滤网。向滤器中加入 PBS，直至每颗心脏的体积达到 25 毫升后，再向对照组织管中加入额外的 25 毫升 PBS，并将总体积均分至两个不同的离心管中。将其中一根管标记为未染色管，另一根标记为活/死染色管。在 4°C 条件下以 250 ×g 离心 5 分钟后，弃去上清液，将未染色管的沉淀重悬于 100 µL PBS 中，其余每个沉淀分别重悬于 100 µL 活/死染色液中。避光冰上孵育30分钟。每份样品中加入500 µL FACS缓冲液后，通过40 µm滤膜转移至FACS管中。在4°C、250 ×g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL FACS缓冲液中。除未染色管和活/死细胞染色管外，向其余每管中加入 50 µL FC 封闭液，混匀后孵育 5 分钟。除未染色管和活/死细胞染色管外，向其余每管中加入 50 µL 抗体混合液，避光孵育 30 分钟，用铝箔覆盖冰桶。与活/死染色相同，用500微升FACS缓冲液再次洗涤，并重悬于300至500微升FACS缓冲液中。打开仪器控制软件。在窗口顶部，选择采集选项卡，然后点击新建。在文库部分的“输入以筛选”字段中，依次输入 PE、PerCP-Cy5.5、 brilliant violet 421、Alexa Fluor 700 和 Zombie Aqua，每输入一项后选择 fluoro-4 并点击“添加”。然后，点击“下一步”进入“分组”标签页。接着点击带有试管图标的符号，以添加心脏样本用于分析。点击参考组，将显示一个窗口。在荧光标签列中，选择 Zombie Aqua 作为荧光标签，并通过点击每个标签旁的红色垃圾桶图标删除其他标签。然后，在对照类型图标中，选择细胞。然后，点击保存。点击下一步。接着，点击标记选项卡。表格将显示。在每列 fluoro-4 的第一行输入相应的细胞标记，然后按 Enter 键。连续单击“下一步”两次，进入采集选项卡。在实验样本的“待记录事件数”中输入 1000 万，在对照组样本的同一字段中输入 20 万。点击“保存并打开”。在左下角，点击“仪器控制”。将电压设置为FSC 50、SSC 175、SSC-B 175。选择采集控制。在流速选项中，从下拉菜单中选择“High”。将未染色的心管涡旋混匀，并将其牢固地放置在样品进样口上。确保绿色指示箭头指向正确的样品，然后点击“记录”，并等待事件记录完成。对活/死染色的心脏组织进行相同操作。选择“光谱分离”菜单并设置控制参数。勾选“自发荧光”作为荧光标记的复选框。然后，单击“下一步”进入“识别阳性/阴性群体”选项卡。在此选项卡中，将显示前向散射面积对侧向散射面积的图。点击并拖动多边形的顶点，在前向散射面积轴上选择介于100万至400万之间的区域，在侧向散射面积轴上选择介于20万至300万之间的区域。在右侧的下一个图中，V5-A 将显示在 X 轴上。移动门控以选择最右侧峰的一半作为阳性，左侧区域作为阴性。在标题为“Reference Group-Unstained”的图中，选择一个范围相似的细胞群。对于未染色样本，无需选择阳性/阴性。单击实时分离按钮。现在采集实验样本，涡旋混匀管子，并将其牢固地放置在 SIP 上。确保绿色指示箭头指向正确的样本。然后，在流式细胞仪软件的采集控制面板中点击“记录”，并等待事件记录完成。选择“默认未混合工作表”选项卡。使用上方的点图工具创建FCS-A与SSC-A的散点图。使用多边形选择工具，选取FSC-A轴大于0.4百万、SSC-A轴大于0.8百万的事件。通过双击该选区创建一个新的图，在新图中右键单击Y轴标签，选择活/死染料标记。右键单击 X 轴标签，选择自发荧光 A。在活/死细胞轴上选择 10 的 5 次方以下的所有事件，这些即为活细胞。双击此选区。在新图中，选择 PerCP-Cy5.5A 作为 X 轴，SSC-A 作为 Y 轴。选择 PerCP-Cy5.5A 右侧的细胞群，这些即为免疫细胞。双击选中区域。在新生成的图中，选择FSC-A作为X轴，前向散射高度（forward scatter height）作为Y轴。选中那些FSC-A值与SSC-A值相同的事件。这一步用于选择单个细胞并去除双联体。双击此选区，可在CD45阳性单细胞群体中显示新的图谱。在CD45阳性单细胞群体图谱中，选择X轴为brilliant violet 421，Y轴为SSC-A。在明亮的紫罗兰色421轴上选择右侧的细胞群。此为B细胞群。在此细胞群中双击两次，以基于B细胞群创建两个新图。设置第一个B细胞图，X轴为PEA，Y轴为 brilliant violet 421A。右侧的细胞群对应血管间B细胞，左侧的细胞群代表间质B细胞。同时选中这两个群体。设置第二个B细胞图，X轴为Alexa Fluor 700A，Y轴为SSC-A。左侧的细胞群对应CD11b阴性细胞，右侧的事件对应CD11b阳性细胞。右键单击每个区域，然后点击“设门属性”。单击“计数”和“父群”以显示事件数量及父群细胞所占百分比。记录事件数量和百分比，用于后续数据分析。在去除幼稚未损伤心脏中的双联体后，预计约有20%的CD45阳性细胞为CD19阳性B细胞。在这些细胞中，平均有 5.5% 位于间质空间，94.5% 位于血管内空间。根据表面标志物 CD11b 的表达，心脏中全部 B 细胞群体中仅有约 1.6% 属于 B1 细胞，其余 98.4% 均为 B2 细胞。通过流式细胞术分析心肌B细胞时，按照方案正确灌注并剪碎心脏至关重要。对消化后的心脏组织进行充分过滤，对于最大限度回收免疫细胞也十分关键。

flow-cytometry-based-quantification-and-analysis-of-myocardial-b-cells

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

基于流式细胞术的心肌B细胞定量和分析

本文介绍了IP-FCM方法，该方法无需基因工程或大量样本，即可对天然蛋白质-蛋白质相互作用进行灵敏、稳健的生化分析。...

IP-FCM：通过流式细胞术检测的免疫沉淀

本视频展示了一种基于流式细胞术的技术，使用两种荧光染料对人类外周血单个核细胞（PBMCs）中的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、γδ T 细胞、B...

一种用于鉴定外周血单个核细胞中免疫细胞亚群的流式细胞术检测方法

本视频展示了通过珠载脂质双层膜重建合成抗原呈递细胞的方法，及其在评估活化T细胞所产生突触输出中的应用。...

利用珠载脂质双层研究T细胞的突触输出

本文介绍了光谱流式细胞术，这是一种流式细胞术的新方法，利用发射光谱的形状来区分荧光染料。该方法采用一种算法替代补偿，并可将自发荧光作为一个独立参数进行处理。这种新方法使得对从实体器官中分离的细胞进行准确分析成为可能。...

通过光谱流式细胞术分析从实体组织中分离的细胞悬液

在缺乏形态学标准或细胞遗传学信息不明确的情况下，骨髓增生异常综合征（MDS）的诊断较为困难。多参数流式细胞术（MFC）可能有助于优化MDS的诊断流程。为了在临床实践中具有应用价值，MFC分析必须基于具备足够特异性和敏感性的参数，且不同操作者之间的数据应具有可重复性。...

基于数据库指导的流式细胞术评估骨髓髓系细胞成熟度

本方案介绍了一种简单高效的方法，用于在稳态或炎症状态下从小鼠心肌中分离、鉴定和定量免疫细胞。该方案结合了酶消化和机械消化，以制备单细胞悬液，并可进一步通过流式细胞术进行分析。...

心脏血管外免疫细胞的分离与鉴定

本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。...

基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

本文介绍了一种处理从小鼠或人新鲜骨髓（BM）中分离的中性粒细胞谱系细胞的实验方案，用于高维质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术，CyTOF）分析。...

中性粒细胞谱系细胞的全骨髓样本制备用于质谱流式分析

本文介绍了一种通过流式细胞术对小鼠腹膜、脾脏和骨髓组织中免疫B细胞区室异质性的简单分析方法。该方案可适用于并扩展至其他小鼠组织。...

小鼠B细胞发育的流式细胞术表征

从分离的植入物中提取细胞，并通过流式细胞术对其进行表征，可显著促进对植入物免疫应答模式的理解。本文描述了一种从分离的植入物中精确分离细胞并进行染色以用于流式细胞分析的方法。...

高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

学习使用流式细胞术定量分析心肌B细胞的方法，该方法可提高B细胞回收率并减少计数变异性。此优化方案适用于心脏免疫学研究，也可扩展应用于肺、肝等器官的免疫细胞分析。

基于流式细胞术的心肌B细胞定量与分析

探索更多视频