基于流式细胞术的心肌B细胞定量与分析

文献中关于心肌B细胞 prevalence 的数据存在差异，这可能源于灌注和消化技术的变异性。本方案可实现对心肌B细胞进行可重复的基于流式细胞术的分析。

该技术可最大化B细胞的回收率，并减少心脏样本中B细胞及其他细胞群在流式细胞术计数中的变异性。这种优化的消化与分离方法可轻松调整，以扩展抗体组合，用于研究心脏中的不同免疫细胞类型。该方案还可应用于其他器官，如肺或肝，以研究与这些器官相关的B细胞。

首先，称量一只12周龄的雄性小鼠。用310-cc胰岛素注射器吸取100微升B220抗体溶液。通过眼后眶注射稀释后的B220抗体，并立即进行器官采集和灌注。

处死小鼠后，用镊子夹住小鼠剑突部位的皮肤。用剪刀在皮肤上剪开一个约两毫米的切口，然后用镊子将皮肤剥离，暴露筋膜层。在剑突部位沿筋膜和腹膜剪开。

用止血钳夹住剑突。在两侧锁骨中线水平的胸壁做垂直切口，抬起前胸壁以暴露纵隔内容物。用镊子从后方牢固夹住主动脉。

将注射器针头插入心脏心尖部位。以每分钟3 mL的速度灌注3 mL HBSS。剪断主动脉并取出心脏。

用HBSS在培养皿中清洗心脏。称量分离后的心脏并记录重量（单位为毫克）。在室温下用刀片将心脏切成小块。

心脏组织块的大小应约为1.5毫米。使用天平称量心肌组织的质量，并将60毫克剪碎的心肌组织置于含有3毫升HBSS的15毫升离心管中，冰上放置用于消化。对未接受B220抗体注射的小鼠重复此操作，并将其放入另一标记为“参考对照组织”的离心管中，该管内含有3毫升HBSS。

向每支含有剪碎组织的试管中加入酶。每毫克组织加入 DNase I 0.5 微升、collagenase II 每毫克 0.5 微升，以及 hyaluronidase 每毫克 0.2 微升。将消化反应置于摇床中，在 300 转/分钟的条件下孵育 30 分钟。

将试管以较小角度（约25度倾斜）放入摇床中。向每个15毫升离心管中加入7毫升HBSS，并在4摄氏度下以250 G离心5分钟。倒去上清液后，用5毫升ACK裂解缓冲液重悬每个沉淀。

室温孵育5分钟。每管加入10毫升PBS后混匀，并用40微米滤网过滤至50毫升离心管中。用注射器活塞压碎滤网上的任何残渣，确保所有物质均通过滤网。

向滤器中加入 PBS，直至每颗心脏的体积达到 25 毫升后，再向对照组织管中加入额外的 25 毫升 PBS，并将总体积均分至两个不同的离心管中。将其中一根管标记为未染色管，另一根标记为活/死染色管。在 4°C 条件下以 250 ×g 离心 5 分钟后，弃去上清液，将未染色管的沉淀重悬于 100 µL PBS 中，其余每个沉淀分别重悬于 100 µL 活/死染色液中。

避光冰上孵育30分钟。每份样品中加入500 µL FACS缓冲液后，通过40 µm滤膜转移至FACS管中。在4°C、250 ×g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL FACS缓冲液中。

除未染色管和活/死细胞染色管外，向其余每管中加入 50 µL FC 封闭液，混匀后孵育 5 分钟。除未染色管和活/死细胞染色管外，向其余每管中加入 50 µL 抗体混合液，避光孵育 30 分钟，用铝箔覆盖冰桶。

与活/死染色相同，用500微升FACS缓冲液再次洗涤，并重悬于300至500微升FACS缓冲液中。打开仪器控制软件。在窗口顶部，选择采集选项卡，然后点击新建。

在文库部分的“输入以筛选”字段中，依次输入 PE、PerCP-Cy5.5、 brilliant violet 421、Alexa Fluor 700 和 Zombie Aqua，每输入一项后选择 fluoro-4 并点击“添加”。然后，点击“下一步”进入“分组”标签页。接着点击带有试管图标的符号，以添加心脏样本用于分析。

点击参考组，将显示一个窗口。在荧光标签列中，选择 Zombie Aqua 作为荧光标签，并通过点击每个标签旁的红色垃圾桶图标删除其他标签。然后，在对照类型图标中，选择细胞。

然后，点击保存。点击下一步。接着，点击标记选项卡。

表格将显示。在每列 fluoro-4 的第一行输入相应的细胞标记，然后按 Enter 键。连续单击“下一步”两次，进入采集选项卡。

在实验样本的“待记录事件数”中输入 1000 万，在对照组样本的同一字段中输入 20 万。点击“保存并打开”。在左下角，点击“仪器控制”。

将电压设置为FSC 50、SSC 175、SSC-B 175。选择采集控制。在流速选项中，从下拉菜单中选择“High”。

将未染色的心管涡旋混匀，并将其牢固地放置在样品进样口上。确保绿色指示箭头指向正确的样品，然后点击“记录”，并等待事件记录完成。

对活/死染色的心脏组织进行相同操作。选择“光谱分离”菜单并设置控制参数。勾选“自发荧光”作为荧光标记的复选框。

然后，单击“下一步”进入“识别阳性/阴性群体”选项卡。在此选项卡中，将显示前向散射面积对侧向散射面积的图。点击并拖动多边形的顶点，在前向散射面积轴上选择介于100万至400万之间的区域，在侧向散射面积轴上选择介于20万至300万之间的区域。

在右侧的下一个图中，V5-A 将显示在 X 轴上。移动门控以选择最右侧峰的一半作为阳性，左侧区域作为阴性。在标题为“Reference Group-Unstained”的图中，选择一个范围相似的细胞群。

对于未染色样本，无需选择阳性/阴性。单击实时分离按钮。现在采集实验样本，涡旋混匀管子，并将其牢固地放置在 SIP 上。

确保绿色指示箭头指向正确的样本。然后，在流式细胞仪软件的采集控制面板中点击“记录”，并等待事件记录完成。选择“默认未混合工作表”选项卡。

使用上方的点图工具创建FCS-A与SSC-A的散点图。使用多边形选择工具，选取FSC-A轴大于0.4百万、SSC-A轴大于0.8百万的事件。通过双击该选区创建一个新的图，在新图中右键单击Y轴标签，选择活/死染料标记。

右键单击 X 轴标签，选择自发荧光 A。在活/死细胞轴上选择 10 的 5 次方以下的所有事件，这些即为活细胞。双击此选区。

在新图中，选择 PerCP-Cy5.5A 作为 X 轴，SSC-A 作为 Y 轴。选择 PerCP-Cy5.5A 右侧的细胞群，这些即为免疫细胞。

双击选中区域。在新生成的图中，选择FSC-A作为X轴，前向散射高度（forward scatter height）作为Y轴。选中那些FSC-A值与SSC-A值相同的事件。

这一步用于选择单个细胞并去除双联体。双击此选区，可在CD45阳性单细胞群体中显示新的图谱。在CD45阳性单细胞群体图谱中，选择X轴为brilliant violet 421，Y轴为SSC-A。

在明亮的紫罗兰色421轴上选择右侧的细胞群。此为B细胞群。在此细胞群中双击两次，以基于B细胞群创建两个新图。

设置第一个B细胞图，X轴为PEA，Y轴为 brilliant violet 421A。右侧的细胞群对应血管间B细胞，左侧的细胞群代表间质B细胞。同时选中这两个群体。

设置第二个B细胞图，X轴为Alexa Fluor 700A，Y轴为SSC-A。左侧的细胞群对应CD11b阴性细胞，右侧的事件对应CD11b阳性细胞。右键单击每个区域，然后点击“设门属性”。

单击“计数”和“父群”以显示事件数量及父群细胞所占百分比。记录事件数量和百分比，用于后续数据分析。在去除幼稚未损伤心脏中的双联体后，预计约有20%的CD45阳性细胞为CD19阳性B细胞。

在这些细胞中，平均有 5.5% 位于间质空间，94.5% 位于血管内空间。根据表面标志物 CD11b 的表达，心脏中全部 B 细胞群体中仅有约 1.6% 属于 B1 细胞，其余 98.4% 均为 B2 细胞。

通过流式细胞术分析心肌B细胞时，按照方案正确灌注并剪碎心脏至关重要。对消化后的心脏组织进行充分过滤，对于最大限度回收免疫细胞也十分关键。