Name: 滑液分析以识别骨关节炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学习滑液分析技术以诊断骨关节炎和痛风，通过偏振光显微镜识别尿酸钙晶体。该方法简单可靠，帮助临床医生快速评估关节炎症程度并制定治疗方案。

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作者谨向 Leonardo Punzi 教授在滑液分析领域的宝贵指导以及帕多瓦大学医院的支持表示感谢。

本方案符合帕多瓦大学医院伦理委员会的指导原则。滑膜液（SF）是在患者初次就诊或因关节炎发作而接受治疗性关节穿刺时，经患者知情同意后从膝关节采集的。该操作的禁忌症包括：凝血功能障碍、使用抗凝药物、关节区域皮肤病变、皮炎或蜂窝织炎。所有滑膜液样本均已去标识化。
1. 滑膜液制备
<ol>
	<li>转移关节穿刺术中采集的肿胀关节滑液样本15 加入含有抗凝剂（首选EDTA；参见 材料表）以及另一管不含添加剂的（图1).</li>
	<li>在疑似感染的情况下，无菌操作将部分关节液样本（约 1 mL）转移至培养瓶中，用于微生物学检测。 
	注意：感染可通过临床特征（严重肿胀、疼痛、发热、功能障碍，有时伴有发热）和关节液（SF）的肉眼外观（浑浊、颜色改变）怀疑。在此情况下，医生会开具微生物学分析医嘱，由微生物学实验室进行检测。</li>
	<li>样本采集后应立即进行SF分析（步骤2-5）。</li>
</ol>
2. 宏观检查
注意：滑膜液样本的宏观评估包括主观、定性及半定量评估。目前尚无参考标准量表，且不使用对照样本。
<ol>
	<li>记录关节滑液（SF）的体积，单位为毫升。描述样本的颜色，颜色范围可从淡黄色至深黄色。记录是否存在血液。</li>
	<li>通过背光观察样本，并判断透过液体管能否清晰阅读印刷文字，以此评估样本的透明度（图 2A）。</li>
	<li>使用一次性移液管滴加样本，评估其黏稠度。若液滴形成长丝，表明黏稠度良好；若呈滴状下落，则表明黏稠度较差（图 2B）。</li>
	<li>通过观察液体管内样本及其背光下的状态，评估是否存在颗粒状物质，包括组织碎片或纤维蛋白。</li>
</ol>
3. 显微镜检查
注意：滑膜液（SF）显微镜检查包括细胞学检查，如白细胞（WBC）总数及分类计数，以及晶体搜寻。
<ol>
	<li>按照以下步骤确定总细胞数。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数器（见材料表）测定EDTA管中收集的滑膜液（SF）中的白细胞总数。</li>
		<li>使用Malassez-Potain移液管（标记0.5；见材料表）从EDTA管中吸取0.5 µL的滑膜液（补充图1）。使用同一移液管吸取9.5 µL的0.1%亚甲蓝溶液（标记11）。最终稀释倍数为20倍。</li>
		<li>轻轻翻转混匀移液管，弃去最初几滴，将滑膜液与亚甲蓝溶液混合液注入计数室中。</li>
		<li>计数九个方格中的连续两个方格内的细胞数，并将所得数值乘以100（简化公式；补充图2）。以每立方毫米中的白细胞数表示结果。 
		注：简化公式：白细胞数（N/mm3）= 连续两个方格中计数的细胞数 × 100。</li>
		<li>根据先前发表的研究报告16,17，依据白细胞总数对滑膜液进行分类（表1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行白细胞分类计数。
	<ol>
		<li>使用活体染色或传统染色法13,18测定多形核（PMN）细胞、单核细胞和淋巴细胞的百分比。</li>
		<li>进行活体染色时，将一滴少量滑膜液置于预先涂有甲酚紫和亚甲蓝的即用型载玻片中央（补充图3；见材料表）。</li>
		<li>加盖盖玻片，并滴加一滴显微镜浸油。</li>
		<li>制备空气干燥的滑膜液涂片用于传统染色（不适用于常规分析）。在洁净载玻片一端滴加一小滴滑膜液，使用另一张载玻片或盖玻片向前推移涂布均匀。让涂片自然风干。</li>
		<li>按照标准的May-Grünwald-Giemsa染色程序18对样本进行染色。</li>
		<li>在油镜下（1,000倍）观察玻片。</li>
		<li>连续计数100个细胞，并区分多形核细胞、单核细胞和淋巴细胞（图3，补充图4）。</li>
		<li>以百分比形式表示每类细胞的总数。 
		&#8203;注：为获得准确结果，细胞学检查应在滑膜液采集后立即进行，或在关节穿刺后24–48小时内（妥善储存于4 °C条件下）完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 晶体检测
<ol>
	<li>使用配备附加偏振滤光片和红色补偿器的偏光显微镜检测病理性晶体的存在19（参见材料表）。</li>
	<li>进行载玻片制备以检测晶体。
	<ol>
		<li>用浸有乙醇的光学纸或软纸小心清洁玻璃载玻片。在载玻片上滴加少量滑膜液（SF）。</li>
		<li>盖上盖玻片，并将载玻片置于显微镜下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鉴定晶体。
	<ol>
		<li>在显微镜下使用低倍物镜对焦载玻片。用40倍物镜在明场下仔细检查载玻片，观察细胞内外。</li>
		<li>根据晶体的大小和形状（例如菱形、针状、杆状）进行鉴定。</li>
		<li>将偏振滤光片插入光源与标本之间。旋转偏振器，使其光轴与分析器（位于物镜上方）垂直，以形成暗背景。</li>
		<li>一旦识别出双折射晶体，将补偿器插入偏振器与标本之间，并将其沿晶体光轴方向平行或垂直移动。</li>
		<li>观察晶体所呈现的颜色（表2）。 
		注：尿酸钠（MSU）晶体呈针状，在暗场中具有强双折射性，当其轴与补偿器平行时呈黄色/橙色；当其轴与补偿器垂直时则呈蓝色（负性）（表2；图4）。焦磷酸钙（CPP）晶体呈杆状或菱形，偏振光下双折射性较弱，当其轴与补偿器平行时呈蓝色，垂直时呈黄色（正性）（表2；图5）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 茜素红染色
<ol>
	<li>配制2%的茜素红S溶液（pH 4.1–4.3），用0.22 µm滤膜过滤，并避光保存。
	<ol>
		<li>制片时，在洁净的载玻片上将一滴滑膜液（SF）与等体积的茜素红S溶液（1:1）混合，盖上盖玻片，在400倍显微镜下观察。</li>
		<li>在显微镜下识别晶体。 
		注意：当在透射光下可见明亮、深红色、圆形且具有同心层状结构的沉淀物时，结果为阳性。在偏振光下，这些晶体呈现强双折射性20&#160;（图6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均声明无利益冲突。

在骨关节炎中，滑液分析通过以下简单步骤帮助定义疾病特征：总白细胞计数和分类白细胞计数，以及检测晶体（包括焦磷酸钙和碱性磷酸钙）。此外，尿酸钠晶体的检出可能提示重要的共病情况。
尽管成本较低且操作简单，但由于操作人员经验不足——尤其是晶体鉴定方面——可能会影响检测的敏感性和结果的可靠性。操作人员的培训和经验对于区分焦磷酸钙（CPP）和单水尿酸钠（MSU）晶体的形态及其双折射特性，并将晶体形态与其双折射程度相对应至关重要。一些研究报道了不同实验室之间在晶体鉴定上存在差异；因此，对实验室技术人员进行培训对于获得可靠且一致的结果至关重要14。晶体鉴定还可能受到对双折射颗粒误判的影响，这些颗粒可能被误认为致病性晶体。这些颗粒可能来源于外部（如灰尘或纤维），也可能存在于关节腔内（如皮质类固醇或脂质）。对载玻片进行彻底清洁可解决前者问题，而后者则只能通过培训和经验来克服14。
SF 分析的另一项局限性涉及使用茜素红染色来鉴定碱性钙盐（BCP）。如...

骨关节炎（OA）是一种复杂且多因素的慢性关节疾病，在15岁及以上人群中全球汇总患病率估计为16%，在40岁及以上人群中则为23%1。由于人口老龄化以及肥胖和代谢综合征等危险因素的增加，OA的发病率预计将进一步上升2。
骨关节炎（OA）的主要问题包括早期诊断困难，以及目前可用的治疗手段仅限于疼痛管理和症状缓解性慢作用药物（SYSADOAs），例如氨基葡萄糖。OA的诊断依赖于临床症状和影像学检查结果。然而，这两种评估方法之间缺乏相关性，可能导致OA诊断和治疗启动延迟数年2。OA的特征是退行性过程和低度炎症，这些可通过滑膜液（SF）分析进行有效研究。via 滑膜液分析。滑膜液是一种富含透明质酸的黏稠血浆渗出液，可润滑关节腔，为软骨提供营养和氧气，并清除代谢废物。滑膜液还具有减震功能，可在关节承受压力和张力时起到保护作用3。
滑膜液分析是一种简单且可靠的检测方法，在对出现肌肉骨骼症状和关节积液的患者进行初次评估时，必须始终执行该检查3。美国风湿病学会、英国风湿病学会及其他机构发布的指南均建议，将滑膜液分析作为风湿性疾病诊断检测的一部分，尤其在评估急性单关节炎时必须开展4,5。通过滑膜液分析获得的白细胞总数及分类计数，能够反映关节内病理过程的现状，从而判断炎症程度。在偏振光显微镜下识别致病性晶体，如单钠尿酸盐（MSU）和焦磷酸钙（CPP）晶体，对于晶体性关节炎（例如痛风和假性痛风）的诊断与治疗至关重要。此外，若发现微生物，则提示可能存在感染性关节炎的诊断。
钙盐结晶在骨关节炎（OA）患者的样本中较为常见6。据报道，在OA患者的滑液（SF）样本中，约有22%存在碱性磷酸钙（BCP）结晶，23%存在焦磷酸钙（CPP）结晶6。尽管其具体作用尚不明确，但这些结晶已被认为与更严重的OA表型相关7，并被视为疾病病理过程本身的伴随现象。在接受膝关节置换术的OA患者组织样本中，钙盐结晶的检出率高达100%8。此外，已有研究假设钙盐结晶可能通过其促炎效应参与OA的发病机制，这一效应已在多项研究中得到证实9，并至少部分由NLRP3炎症小体介导10。
最近，钙盐结晶在骨关节炎（OA）的早期和晚期阶段均有发现6，表明其在诊断不同临床亚型的OA以及药物治疗中可能发挥关键作用。
滑液分析的总体目标有两个：一是确定滑液的炎症程度，二是通过识别特定晶体或微生物来诊断晶体性或感染性关节炎。由于骨关节炎通常表现为非炎症性特征，中性粒细胞比例极低或完全缺失，滑液分析在诊断骨关节炎时尤为有用，是一种简单且可靠的工具。
相较于其他技术的优势 
滑膜液（SF）分析包含一系列简单操作，如总白细胞计数、白细胞分类计数以及结晶体检测。由经验丰富的实验室技术人员进行的手工细胞计数3,11 仍是滑膜液及其他体液细胞学分析的金标准。然而，由于该方法耗时较长，且存在观察者间和观察者内变异，自动化细胞计数仪已逐渐在大型常规临床实验室中取代手工计数，其中血液和尿液分析仪已被改造用于滑膜液分析11,12。尽管如此，手工计数在某些特定情况下仍具优势：（1）在门诊环境中，可及时获得总白细胞及分类计数结果；（2）可识别自动化计数仪无法辨认的细胞类型，例如吞噬性单核细胞（Reiter细胞）或非造血细胞（如滑膜细胞）；（3）当样本量过少，无法由仪器处理时；（4）便于建立本地实验室登记系统，便于研究使用。手工计数的另一优势在于活体染色技术，该方法可在玻片制备后立即快速区分细胞类型。相比之下，传统的染色方法（如Wright染色和May-Grünwald-Giemsa染色）需要将滑膜液涂片空气干燥，并耗费一定时间完成染色13。尽管这些染色方法不适用于时间敏感的常规分析，但它们能更清晰地显示样本中的各类细胞成分，包括红细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、多形核白细胞、淋巴细胞和血小板。
最后，通过基于偏振光显微镜的简单技术对晶体进行常规滑膜液分析，可快速获得结果14。其他方法（如扫描电镜和电子显微镜）虽然能够提供更准确和更敏感的结果，但由于成本高昂，且样品制备与分析过程耗时，难以在日常临床实践中应用。

<table><tbody><tr><td>茜素红 S</td><td>Merck</td><td>A5533</td><td>用于 BCP 结晶检测</td></tr><tr><td>Burker 计数板</td><td>Merck</td><td>BR718905</td><td>用于白细胞总数计数</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Merck</td><td>C7931</td><td>用于显微镜检查&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA 采血管</td><td>BD</td><td>368861</td><td>用于滑膜液采集&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>载玻片&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>S8902</td><td>用于结晶检测</td></tr><tr><td>λ滤光片（补偿器）</td><td>任意&amp;nbsp;</td><td>请参考显微镜厂商说明</td><td>用于结晶鉴定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Malassez-Potain 血细胞计数器</td><td>Artiglass</td><td>54830000</td><td>用于滑膜液稀释</td></tr><tr><td>亚甲蓝溶液</td><td>Merck</td><td>3978</td><td>用于白细胞总数计数</td></tr><tr><td>偏光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica、Nikon 或其他厂商</td><td>根据型号和厂商而定</td><td>用于完整的滑膜液分析</td></tr><tr><td>偏振镜片</td><td>任意&amp;nbsp;</td><td>请参考显微镜厂商说明</td><td>用于结晶鉴定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Testsimplet&amp;nbsp;</td><td>Waldeck</td><td>14386</td><td>活体染色用于细胞分类</td></tr></tbody></table>

关节液分析用于识别骨关节炎

Synovial Fluid Analysis to Identify Osteoarthritis

关节液（SF）分析在骨关节炎（OA）的诊断中具有重要意义。宏观和微观特征，包括白细胞（WBC）总数及分类计数，有助于界定关节液的非炎症性特征，这是OA的典型标志。在OA患者中，关节液样本中的白细胞计数通常不超过每微升2000个细胞，且中性粒细胞等炎症细胞的比例极低或缺如。钙盐结晶在OA患者的关节液中较为常见。尽管其在OA发病机制中的作用尚不明确，但已发现其与轻度炎症过程及更严重的疾病进展相关。近期研究发现，钙盐结晶可出现在OA的早期和晚期阶段，提示其可能在诊断OA不同临床亚型及指导药物治疗方面发挥重要作用。总体而言，OA中关节液分析的目标有两个：一是确定关节液的非炎症程度，二是明确是否存在钙盐结晶。

受骨关节炎（OA）影响的大关节常出现肿胀，并产生大量滑膜液（SF），可通过关节穿刺术引流via arthrocentesis15。关节穿刺术后应立即评估滑膜液的宏观特征，主要包括量、颜色、透明度和黏稠度17。尽管这些特征特异性较低，但可提供有关炎症程度的初步信息。滑膜液的颜色取决于其细胞含量以及细胞外基质大分子的降解程度。来自OA患者的滑膜液呈淡黄色，这种色调通常与非炎性样本相关，而深黄色则提示炎性渗出物（图2）。若样本中含有少量血液（例如由于毛细血管破裂所致），则可能呈现微橙色。血性渗出物需谨慎评估，因其可能提示潜在的关节积血。透明度是OA患者滑膜液的一个显著特征。事实上，非炎性滑膜液中细胞、碎片、透明质酸和纤维蛋白片段含量较少，因此通常清澈透明，与炎性滑膜液的浑浊外观形成对比（图2）。
黏度是反映炎症的良好指标，因为它与基质大分子（主要是透明质酸）...

通过透射光、偏振光和补偿光显微镜对滑膜液进行分析，可利用简单的步骤评估样本的炎症性或非炎症性特征。该方法在骨关节炎中尤为有用，可用于检测钙盐结晶，并识别出更严重的骨关节炎亚型。

关节液（SF）分析在骨关节炎（OA）的诊断中具有重要意义。其宏观与微观特征，包括白细胞总数及分类计数……

关节液分析可在初步评估肌肉骨骼症状和关节积液患者时，揭示炎症程度以及是否存在致病性晶体。该技术的主要优势在于其简便性和可靠性。通过几个步骤，临床医生即可获得有关患者疾病的重要诊断信息。特异性晶体的鉴定对于诊断和治疗至关重要。尿酸盐晶体提示痛风，而焦磷酸钙及其他钙盐晶体则提示钙相关性关节病或更严重的骨关节炎。首先，取自患者肿胀关节穿刺术中收集的滑膜液样本。标注样本的体积（以毫升为单位），并分别转移至含有抗凝剂EDTA的试管和另一支不含任何添加剂的试管中。对于疑似感染的情况，需无菌操作将数毫升滑膜液样本转移至培养瓶中，用于微生物学检测。为进行样本的肉眼观察，取一支含有样本的试管，判断样本的颜色，其颜色范围可从浅黄色至深黄色不等。记录是否存在血液。通过在背光下观察样本，并通过确定透过装有样本的试管阅读印刷页面的难易程度，来判断样本的透明度等级。然后，通过将样本从一次性移液管中滴下，评估其黏稠度。虽然细长液丝的出现表明黏度较高，而液滴的形成则提示黏度较低。通过将试管置于有背景光的条件下观察，检查样品中是否存在任何颗粒物质，包括组织碎片或纤维蛋白。为了测定白细胞总数，使用马氏-波坦吸管从含有EDTA的试管中吸取0.5微升样品。使用同一支移液器吸取9.5 µL的0.1%亚甲蓝溶液。通过轻轻颠倒移液器将样品与亚甲蓝溶液混合。在将混合液倒入血细胞计数板的计数室之前，弃去最初几滴。 现在计数九个方格中任意两个相邻方格内的细胞数，并将所得数值乘以100。以每立方毫米的白细胞数表示总白细胞计数。使用不含任何添加剂的试管中的滑膜液样本，测定滑膜液样本的白细胞分类计数。为了使用活体染色法测定细胞分类计数，取一片预先涂有结晶紫和亚甲蓝的即用型载玻片，在载玻片中央滴加一小滴样本。接着，用盖玻片覆盖样本液滴，并在盖玻片上滴加一滴显微镜镜油。若采用传统染色法估算细胞分类计数，首先在洁净载玻片的一端滴加一小滴样本。现在使用另一张载玻片或盖玻片，向前推动将液滴沿载玻片均匀铺开。让涂片在空气中自然干燥。将含有空气干燥涂片的载玻片置于1,000倍油镜下进行镜检。通过连续计数100个细胞，区分嗜多形核细胞、单核细胞和淋巴细胞，以估算细胞分类计数。用浸有乙醇的光学级或软纸擦拭玻璃载玻片进行清洁。取少量未与任何添加剂混合的样品滴加于玻璃载玻片上，盖上盖玻片，然后将载玻片置于显微镜下观察。使用低倍物镜在显微镜下对玻片进行聚焦，并用40倍物镜在明场下仔细观察。在细胞内外寻找晶体，根据其大小和形状（可能为菱形、针状或杆状）进行识别。然后将偏振滤光片插入光源与标本之间。为了获得暗背景，旋转偏振器，使其光轴与检偏器垂直。一旦确定了双折射晶体，将补偿器插入偏振器与样品之间，并沿晶体光轴方向平行或垂直移动。观察晶体所呈现的颜色。进行茜素红染色时，取一滴滑膜液样本与等体积预先配制的茜素红溶液在洁净的载玻片上混合。盖上盖玻片后，在显微镜下以400倍放大倍数观察以识别晶体。滑膜液样本的宏观特征可提示炎症程度。呈淡黄色且透明度较高的样本通常与非炎症性状况（如骨关节炎）相关。相反，颜色深黄且外观浑浊的样本则提示存在细胞、碎片、透明质酸及纤维蛋白片段，这些成分与炎性渗出液相关。在骨关节炎患者的滑膜液样本中观察到的白细胞主要为单核细胞及其他单核细胞类细胞，如滑膜细胞。在滑膜液样本中检测到焦磷酸钙晶体，表明炎症性细胞因子水平相对较高。此外，茜素红染色阳性揭示了样本中存在碱性磷酸钙晶体。在普通光线下仔细检查载玻片以寻找晶体时，这一点非常重要。请注意，焦磷酸盐晶体通常双折射较弱，在偏振光下可能被遗漏。滑膜液中钙盐晶体的存在及其与更严重疾病形式的关联，已促使研究人员探索骨关节炎发病机制及进展过程中的新途径。

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