Name: 激光诱导动作电位样测量微电极阵列上的心肌细胞，以提高安全药理学的预测性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学习激光穿孔结合微电极阵列技术记录心肌细胞动作电位的方法。该技术可精确描述动作电位形态，提高致心律失常潜能的分类敏感性，为心脏安全药理学研究提供更可靠的评估手段。

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作者感谢 Foresee Biosystems 在研究期间出借 IntraCell 系统。同时感谢 Hae In Chang 提供的技术支持。本工作获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划资助，资助协议号为 964518（ToxFree）；欧盟“地平线欧洲”欧洲创新理事会计划项目 SiMulTox（资助协议号 101057769）；以及巴登-符腾堡州经济、劳工和旅游部的资助。

1. 诱导性多能干细胞来源的心肌细胞制备
注意：iCell 心肌细胞2（称为诱导性多能干细胞 [iPSCs] 来源的心肌细胞）根据供应商提供的方案进行制备。该方案将在下一部分中简要概述。
<ol>
	<li>将铺板和维持培养基在4℃解冻 &#176;使用前于 C 培养 24 小时。</li>
	<li>按每毫升无菌水中溶解1毫克无菌纤连蛋白的浓度配制纤连蛋白包被液。将该原液分装后冻存（例如，25 &#181;将分装的贮存液用无菌的杜尔贝科平衡盐溶液（dPBS）按1:20稀释。</li>
	<li>在超净工作台内，于无菌条件下，将已预先高压灭菌的微电极阵列（MEA）的电极区域逐滴加入纤连蛋白进行包被 &#181;L移液管。为此，滴加5 &#181;将纤连蛋白包被溶液 L 加至电极区域，观察电极表面液滴的形成。注意勿触碰敏感的电极。 
	注意：为保持无菌条件，在将MEA芯片从超净工作台中取出前，应先将其转移至无菌培养皿中。</li>
	<li>将包被的 MEA 在 37 ℃ 下孵育 1 小时 &#176;在培养箱中为佳。</li>
	<li>将含有心肌细胞的冻存管在约37℃水浴中解冻 &#176;C 下 2 分钟，直至仅剩少量冰晶。将细胞溶液轻柔转移至 50 mL 离心管中。</li>
	<li>向空冻存管中加入1 mL铺板培养基。在90秒时间内将溶液逐滴转移至50 mL离心管中，以减少渗透压冲击。轻柔地向离心管中再加入8 mL铺板培养基。</li>
	<li>使用10 mL移液器小心混匀细胞悬液。采用自动荧光流式细胞术计算活细胞总数。细胞数量应接近生产商提供的数据表中所列数值。</li>
	<li>将细胞悬液在200 x g下离心3分钟 g 在室温下，使用连接至抽吸系统的玻璃移液管吸除上清液。调整细胞数量至每微升6,000至15,000个活细胞&#181;L. 
	注：细胞数量通常在上述范围内，但可能因供应商不同而有所差异。</li>
	<li>移除在步骤1.3中施加到MEA电极区域的包被溶液，使用10 &#181;在细胞接种前立即用L移液管进行操作。去除后应立即接种细胞，以避免包被干燥。为此，将细胞以滴加方式在4 &#181;L 6孔MEA和1孔MEA均以与包被相同的方式加入电极区域。</li>
	<li>将细胞置于37 ℃培养箱中孵育1小时，使其贴壁。 &#176;C 和 5% CO2 在将约37℃加热的无菌铺板培养基加入孔板之前 &#176;C 在 200 &#181;6孔MEA使用L，单孔MEA使用1 mL，在层流罩下操作。</li>
	<li>在铺板后48小时，在层流罩内进行完全换液。操作时，使用连接至抽吸系统的玻璃移液管吸除铺板培养基，然后加入200 &#181;37℃预热的无菌维持培养基 L &#176;加入 C 至孔中。</li>
	<li>每隔一天进行一次完全换液。</li>
	<li>解冻细胞后5-8天开始进行细胞检测。实验开始前2小时进行完全培养基更换。</li>
</ol>
2. 微电极阵列记录
注意：用于将场电位信号转换为激光诱导动作电位（liAP）的设备包含一台直立显微镜和一个1064 nm激光器。
<ol>
	<li>将MEA系统放置在设备上，使MEA芯片支架居中对准物镜孔。调整MEA装置的位置，确保物镜正对MEA系统上的孔洞，以便激光聚焦于电极。</li>
	<li>在记录前15分钟，将培养有细胞的MEA芯片从培养箱转移至MEA装置中，使细胞有时间恢复因机械扰动造成的影响。</li>
	<li>使用异丙醇和棉签小心清洁接触垫和插针，以降低噪声水平。将MEA芯片小心放入MEA装置中。对于6孔MEA，将芯片的标识置于左上角底部；对于单孔MEA，则将参考电极置于左侧。</li>
	<li>将MEA系统集成的加热装置设置为38 °C。在MEA芯片上方放置一个小室，持续用加湿的碳氧混合气体（5% CO2 和 95% O2）灌流细胞，以模拟培养箱环境并防止液体蒸发。</li>
	<li>关闭设备盖子。集成的安全开关仅在盖子完全覆盖MEA芯片时才允许激光激活。使用MEA配置程序设置MEA系统的滤波器参数：高通滤波设为0.1 Hz或更低，低通滤波设为3,500 Hz。</li>
	<li>使用MC_Rack软件（记录软件）或其他替代软件进行记录。根据需要调整输入范围，确保信号不会使放大器饱和，并设置采样率（例如20 kHz）。使用软件的长期显示功能检查记录情况。</li>
</ol>
3. 激光诱导细胞穿孔
<ol>
	<li>将MEA芯片插入MEA设备并设置好软件后，使用FB Alps软件（初始化软件）初始化激光机械系统。</li>
	<li>首先，点击初始化按钮。初始化结束后，虚拟激光点将分别位于6孔MEA的D孔或单孔MEA的左下角。</li>
	<li>通过按住Ctrl键并单击鼠标，将虚拟激光点移动至D5电极的中心，并调整焦距。通过按住Ctrl键并滚动鼠标滚轮来调节焦距。</li>
	<li>按下设置P1按钮。虚拟激光点将自动移至F孔。重复上述过程，将激光点移至F5电极，然后选择设置P2。</li>
	<li>完成此步骤后，激光点将移至B孔。对B5电极重复相同操作，并在软件中按下设置P3。此时系统已完成校准。</li>
	<li>根据细胞需求调整激光功率和处理时间。此处使用&#160;40%的功率和25%的处理时间。</li>
	<li>要启用激光，请点击激光关闭按钮，该按钮将变为激光开启状态。切换至记录软件，选择文件名，然后点击窗口顶部的红色记录按钮，接着点击播放按钮以开始记录测量数据。</li>
	<li>在使用激光打开细胞之前，先记录60秒的基线。然后切换回初始化软件。</li>
	<li>在右侧的虚拟图上，通过按住Ctrl键并单击鼠标来停用不需要激光作用的电极。在软件窗口右侧的阵列表示图中激活感兴趣的电极，以选择目标电极。</li>
	<li>要启动激光，请使用Alt键加鼠标单击，并选择该孔的中心电极。系统将自动对该孔中每个电极上的细胞进行打孔。对每个孔重复此操作。激光将自动打开所选孔中所有先前已激活的电极。</li>
</ol>
4. 药物处理与应用
<ol>
	<li>在测量当天新鲜配制所有用于药物测试的物质。确保在培养基中的终浓度为所需浓度的10倍，以便在孔中进行1:10稀释。</li>
	<li>先将硝苯地平（Nifedipine）、E4031和多非利特（Dofetilide）以DMSO溶解至毫摩尔浓度，再用培养基稀释至目标浓度的10倍。切勿使孔中DMSO的终浓度超过0.1%。</li>
	<li>记录60秒的基础活动。按照方案第3步所述启动激光诱导穿孔，使场电位（FP）转变为激光诱导动作电位（liAP）形态。</li>
	<li>以每孔单一浓度方式加入所有药物。分别从6孔微电极阵列（MEA）的每孔中移除20 µL培养基，或从单孔MEA中移除100 µL。根据MEA类型，向孔中加入20 µL或100 µL待测药物的储备液，并轻轻吹打混匀2–3次。每种药物及其浓度至少重复三次，以确保统计学意义。</li>
	<li>让化合物孵育5分钟（300秒）。在此期间，liAP形态可能重新转变为FP形态。再次进行激光诱导穿孔，并额外记录60秒内化合物对liAP的可能影响。</li>
</ol>
5. 数据导出
<ol>
	<li>在记录软件中回放记录，选择相关电极。使用 MC_DataTool 将 MC_Rack 文件转换为 ASCII .txt 文件。</li>
	<li>点击 文件 &#62; 打开 MCD &#62; 选择一个 MC_Rack 文件。然后点击 txt 按钮（蓝色文字）。</li>
	<li>选择一个电极。所选电极将显示在右侧列表中。</li>
	<li>点击 浏览 以选择文件夹并更改新 .txt 文件的名称。点击 保存。</li>
	<li>取消已导出电极的选择，然后选择下一个要导出的电极。对所有感兴趣的电极重复此操作。</li>
</ol>
6. 数据处理与统计分析
<ol>
	<li>将转换后的二进制轨迹导入 R19。使用包含以下软件包的自定义脚本对数据进行可视化/分析：dplyr、tidyr 和 ggplot220,21,22。</li>
</ol>

<ol><li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li>
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<li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hERG+potassium+channel+assays+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Role of hERG potassium channel assays in drug development.</a> Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).</li>
<li>Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Scholarpedia%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia.</a> Scholarpedia. 3 (7), 1665(2008).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种创新方法展示了一种研究的新途径 体外 心脏活性药理工具化合物作用期间对心肌动作电位的药理学调控
传统的MEA记录可获得场电位（FP）记录，该电位是心肌动作电位（AP）的导数14。这种间接记录方式将去极化和复极化的时间过程混合在一起，从而消除了AP的关键特征。此外，尽管动作电位的跨膜电压变化通常可达约100 mV，但整体FP幅度相对较低，峰值幅度介于数百微伏（µV）至个位数毫伏（mV）之间。由于记录原理的限制，复极化相的信号较小；在许多情况下，该相仅能勉强检测到，且形态常不清晰，导致难以确定FP的终点。通过打开细胞膜，我们得以进入细胞内电压环境，从而揭示心肌动作电位的时间进程。与FP记录相比，该记录方法具有多项优势：首先，信号幅度更显著，提供了更优的信噪比；其次，波形更有利于复极化过程的识别；第三，复极化相的形态特征（如信号弛豫的陡度）可提供关于受试化合物作用机制的深入信息；最后，该方法在检测关键药物不良效应方面具有更高的灵敏度，这一点在图6的记录示例中得到证实：在细胞内动作电位（liAP）中可观察到早后除极（EADs），而在FP中则无法检测到。
目前，获取细胞内AP的途径有两种。第一种是通过电穿孔实现26,27此处施加短暂而强烈的电压脉冲 通过 记录电极可以打开细胞膜28第二种可能是膜的开放 通过 利用一种名为表面等离子体共振的物理现象，通过激光脉冲实现，如本实验所示。与电穿孔相比，其优势之一是能够更频繁地产生连续性孔隙。由于激光光斑高度聚焦（1–3 µm），该效应仅局限于目标电极区域。有趣的是，激光诱导动作电位（liAP）的启动并未改变培养合胞体中的信号传导。这表明，尽管细胞完整性受到损伤，心肌细胞似乎并未发生去极化。 通过 膜上的孔洞
该方法存在一定的局限性。与电穿孔类似，在大多数情况下，细胞膜的开放不会持续整个实验过程。在实验前，需要针对目标细胞类型独立确定实现稳定膜开放所需的激光脉冲最小功率和持续时间参数。我们发现（未展示）不同细胞类型的参数差异显著（在本研究中包括多种hiPS来源及原代心肌细胞）。这可避免在化合物测试实验中对细胞造成不必要的应激，从而获得更可靠且可重复的数据。调整z轴以确保细胞和电极清晰聚焦至关重要。若显微图像失焦，会导致激光焦点位于非最佳层面，可能无法成功打开细胞膜。即使参数已优化，liAP效应仍是瞬时的，其幅度会随时间衰减。此外，每次liAP诱导时进入细胞内空间的通路存在差异，不仅在同一电极连续开放之间存在差异，也存在于不同电极之间。这导致liAP幅度具有较高变异性，其原因目前尚未完全明确。可能的解释包括机械因素，例如激光焦点漂移或细胞膜开放位置的亚细胞定位不同。这使得当前阶段对测试化合物作用幅度的分析变得复杂。此外，通过MEA系统记录电活动时，需进行高通滤波以补偿不可避免的基线漂移。尽管本研究所用系统的滤波设置已设为0.1 Hz（该系统可设置的最低滤波值），在动作电位平台期仍可观察到滤波效应，导致电压偏转在平台期内缓慢趋向基线。这对于本身动作电位持续时间较长的细胞系尤为不利，例如本研究所用的iPSC来源iCell心肌细胞2，其在对照条件下即可产生超过700 ms的动作电位&#62;。采用更低滤波设置的系统可能更有利于保持动作电位的形态，并更准确地反映复极化相的时间进程。

心跳的电活动源于多种心脏离子通道和转运体之间复杂且精确时序的相互作用，以及电信号在心肌中精确调控的传导过程1。这些高度协调机制的改变（例如，通过药物作用）可能对心脏功能造成严重后果（即，危及生命的心律失常）2,3。心律失常是指改变心脏正常节律的异常心跳，可能带来危及生命的后果。其成因可能是心脏兴奋波的起始受损，或心脏兴奋传导异常4，进而导致心脏泵血功能障碍。
许多高活性的候选药物由于具有（潜在）致心律失常风险，在早期药物研发阶段就必须被排除。2,3 这些药物会调节关键的心脏离子通道（例如人源性醚-à-go-go 相关基因通道 [hERG]），而这些通道负责正常心脏动作电位的形成、终止以及后续的信号传导。5
制药公司通常采用膜片钳测量技术或微电极阵列（MEA）来研究候选药物可能引发的心脏毒性脱靶效应。膜片钳记录能够解析物质对心肌离子通道的影响，并以高时空分辨率分析跨细胞的心肌动作电位6,7。然而，该技术的缺点包括手动膜片钳通量较低，且由于该方法依赖于悬浮细胞，自动化应用受到限制。此外，由于该方法具有侵入性，无法用于研究慢性效应。最后，通常只能同时研究单个细胞而非完整的心肌合胞体，因此无法获取有关信号传导的信息。
电压敏感性染料在无创研究心肌动作电位及药物诱导的心律失常方面具有重要价值8。它们可用于研究单个细胞以及合胞体的电活动。该方法的缺点在于染料本身或在光照过程中产生的反应产物可能具有细胞毒性。这类染料适用于急性实验，但难以用于长期研究9,10,11。作为替代手段，电压敏感性蛋白近年来在可用性和灵敏度方面取得了显著进展，但需要对目标细胞进行遗传修饰，且在时间分辨率上仍不及电生理技术12。
来自最新CiPA倡议的信息13 指出多电极阵列（MEAs）作为一种替代性电生理方法，被广泛应用于心脏安全性筛选，因其是研究心脏功能和安全药理学的一种强大且成熟可靠的工具。心肌细胞直接培养在芯片表面形成合胞体，从而以非侵入方式记录细胞外场电位（FPs）。 通过 基底集成微电极。该记录原理支持持续数天的高通量筛选，使其适用于药物研发中对慢性效应的研究。所获得的场电位（FP）波形是细胞内动作电位（AP）的衍生物14搏动频率、动作电位初始部分的振幅以及动作电位持续时间等参数易于获取15. 其他关键标准，例如动作电位时程延长与动作电位三角形化的区分（这是致心律失常的重要标志）16,17由于该技术的交流滤波效应，这些信号无法被检测到。此外，其他微小的致心律失常事件（如早期后除极和延迟后除极，分别简称 EAD 和 DAD）也常因其振幅较小而容易被忽视。
本文介绍了一种通过打开心肌细胞膜以获取细胞内膜电位的方法。IntraCell 设备（下文简称细胞内记录设备）可利用高度聚焦的纳秒激光束，对培养在多电极阵列（MEA）电极上方的心肌细胞进行多次细胞膜穿孔。 通过 一种特定的物理现象（表面等离子体共振）18因此，记录信号从常规场电位（FP）转变为类似细胞内动作电位的波形（激光诱导动作电位，liAP）。该方案展示了如何通过此方法获取仅通过分析FP难以捕捉的波形动力学特征。该技术因此成为传统细胞内膜片钳与微电极阵列（MEA）记录之间的重要桥梁，是对现有心脏安全评价方法的有力拓展。

<table><tbody><tr><td>1孔MEA芯片</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td>890301</td><td></td></tr><tr><td>6孔MEA芯片</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td>7600069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck KGaA</td><td>20-139&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td>药物溶剂</td></tr><tr><td>Dofetilide</td><td>ALOMONE LABS&lt;br/&gt; ISRAEL HEADQUARTERS</td><td>D-100</td><td>药物测量</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>12037539</td><td>包被</td></tr><tr><td>E4031</td><td>ALOMONE LABS&lt;br/&gt; ISRAEL HEADQUARTERS</td><td>E-500</td><td>药物测量</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>FB Alps版本0.5.005</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Merck KGaA</td><td>11051407001</td><td>包被</td></tr><tr><td>iCell心肌细胞</td><td>FUJIFILM Cellular&lt;br/&gt; Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>IntraCell</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>CN09.1</td><td>用于MEA电极接触点的清洁</td></tr><tr><td>维持培养基</td><td>FUJIFILM Cellular&lt;br/&gt; Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>#M1003</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>MC_Data Tool</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td></td><td>数据导出</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td></td><td>MEA记录</td></tr><tr><td>MEA 2100 - 2x60 - 系统</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td>890485</td><td>用于MEA记录</td></tr><tr><td>硝苯地平</td><td>Merck KGaA</td><td>N7634&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td>药物测量</td></tr><tr><td>铺板培养基</td><td>FUJIFILM Cellular&lt;br/&gt; Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>M1001</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>VWR International, LLC</td><td>1304-1</td><td>MEA清洗</td></tr></tbody></table>

基于微电极阵列的激光诱导心肌细胞动作电位样检测以提高安全药理学预测性

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

危及生命的药物诱发性心脏心律失常通常先出现心脏动作电位（AP）延长，并常伴有微小的致心律失常性膜电位波动。动作电位复极化阶段的形态和时程对于心律失常是否发生具有决定性作用。
微电极阵列（MEA）可通过细胞外场电位（FP）便捷地检测心脏毒性化合物的作用。via 尽管该技术在科研和心脏安全药理学中是一种强大且成熟的方法，但由于细胞外记录原理及其导致的固有交流电（AC）滤波效应，FP波形无法用于推断原始动作电位（AP）的形态。
本文描述了一种新型装置，该装置利用高度聚焦的纳秒激光束，在多个培养时间点重复打开培养于MEA电极上方的心肌细胞膜。激光打孔可将电生理信号从场电位（FP）转变为类似细胞内动作电位的信号（激光诱导动作电位，liAP），从而实现跨膜电压偏转的记录。这种细胞内访问能力使得动作电位形态的描述更加精确，并且相较于常规MEA记录，能够更准确、更敏感地分类致心律失常电位。该系统是对现有电生理方法的革命性扩展，兼具基于MEA记录的所有优势（操作简便，可进行急性与慢性实验、信号传播分析等），可实现对心脏毒性效应的精确评估。

用于记录培养心肌细胞电活动的记录系统由一个标准的多电极阵列（MEA）系统组成，该系统配备有加热器和连接至计算机的碳氧混合气体（carbogen）腔室。该系统放置在细胞内记录装置上方，而细胞内记录装置又安装在一个小型防震装置之上（图 1A-B）。
iPSC来源的 心肌细胞2 解冻后2-3天内开始自发搏动（天 体外，DIV）后可在显微镜下观察到搏动。自 DIV 4 起，搏动频率趋于规律，且在多数 MEA 芯片孔内的电极上可记录到细胞去极化成分峰-峰振幅为 1 至 5 mV 的细胞外场电位（FP）。在超过 95% 的检测孔中均可检测到电活动。自 DIV 7 起，细胞脱落的概率增加，导致这些孔无法继续使用。
用于控制激光诱导细胞膜开放的软件可调节激光的功率和处理时间，从而仅在待检测的电极上介导细胞膜开放（图1C），而同一孔中的其他电极则不受影响。若设置过于保守，则不会改变动作电位波形（FP）；而设置过高则可能导致心肌细胞受损，表现为剧烈但短暂的搏动或信号丢失。当参数调整至细胞耐受良好的40%功率和25%处理时间时，触发激光脉冲会引起记录波形的多种变化（见图1D中的典型记录示例）。在此条件下，肉眼未观察到电极材料发生宏观改变。记录信号的振幅显著增加至原来的4.1 ± 0.41倍（n = 20，范围1.34–8.83），该数据来自随机选取的记录子集分析，最终振幅介于7至22 mV之间。此外，波形由典型的FP形态转变为更接近细胞内记录的动作电位（AP）形态：原始FP表现为起始段快速、双相且短暂的电压偏转，随后是回到基线的平台期以及指示FP结束的小幅偏转；而新波形则表现为快速上升、延长的去极化平台期，以及伴有基线下过冲的复极化阶段（图1E）。我们将此类电压偏转定义为激光诱导动作电位（liAP）。大多数情况下，这种转变是短暂的，并在至少5分钟内部分或完全恢复。在诱导liAP后，心脏合胞体内的信号传导保持不变（图2），表明其余合胞体未受到激光脉冲可能造成的损伤影响。
与细胞内记录的动作电位（AP）的相似性使得能够提取局部内源性动作电位（liAP）的某些参数，而这些参数在场电位（FP）中无法获得（参见示例参数，如图3A），其中最显著的是在特定时间点（例如20%、50%和90%）测量liAP持续时间（图3B），类似于常用于描述动作电位的APD20/50/90指标。
接下来，我们检测了激光打孔的心肌细胞对常用心脏活性药理学工具化合物的反应。示例性实验方案设计见图3C。由于光致穿孔（liAP）的转化效应并不总是在整个实验过程中持续存在，因此化合物施加采用每孔单一浓度的方式，而非累积给药，以缩短总记录时间。然而，在施加测试化合物之前，有必要重新打开细胞或开启另一个电极区域。
加入特异性的L型Ca2+通道阻断剂硝苯地平（Nifedipine）23,24后，liAP的平台期以浓度依赖的方式减弱，从而缩短了整个liAP（图4A、B）。这种缩短程度与未进行电极操作的心肌细胞动作电位（FP）分析结果相当（图4C），表明该记录方法相较于传统的FP记录并无不良影响。
E4031 抑制相关的 Kv1.11 (hERG) 钾离子通道的复极化过程25，并在较高浓度下导致心肌细胞出现心律失常行为。与来自场电位（FP）记录的分析结果相似，E4031 以浓度依赖性方式延长了liAP持续时间（图5）。此外，在浓度为 0.01 µM 及以上时，liAP末尾可见小的正向电压偏转。随着浓度升高，这些偏转更加明显，提示出现短暂的新生去极化现象，而这一特征在FP记录中几乎不可见（见图5B-C，上部（FP）与下部（liAP）轨迹对比）。该现象被称为早期后去极化（EAD）。在最高浓度 0.1 µM 时，这些EAD随时间发展为异位搏动，即提前出现的动作电位（图5C）。EAD和异位搏动均为促心律失常活性的关键指标。在图5D所示示例的末尾，电活动最终导致心律失常性搏动。FP与liAP记录之间的浓度-反应关系也表现出一致性（图5E）。然而，由于测试化合物在较高浓度下使FP的复极化成分变弱，FP数据表现出更大的变异性。iPSC来源的心肌细胞在对照条件下倾向于产生非生理性延长的动作电位（AP持续时间 &#62; 700 ms），这似乎是其固有特性2。所用MEA系统具有内在的 0.1 Hz 交流滤波，导致liAP波形部分被滤除，但并未掩盖关于基础动作电位起始与终止的定性信息。
结果表明，与FP记录相比，liAPs可在较低浓度下检测到致心律失常性电压偏转的首次出现。如图所示 图6 在给予浓度为的 Dofetilide 期间记录的电活动 3 &#181;M记录来自同一孔。尽管FP和liAP的持续时间均约为2秒，但FP波形平缓，呈现规律的复极化偏转；而在liAP结束时，不同幅度的早后除极（EADs）变得明显可见。这种相关安全性药理敏感性的增加进一步支持了以下发现：由表面等离子体共振诱导的liAP能够更准确地评估复极化阶段，从而有助于深入了解所研究测试化合物的作用机制。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg" /> 
图1：细胞内记录装置及典型记录结果。（A）装置示意图。（B）记录系统的俯视图，MEA记录放大器处于打开状态。（C）初始化软件界面，右侧为虚拟MEA图谱。1：防震台，2：细胞内记录&#160;系统，3：激光防护盖，4：加湿碳氧混合气培养室，5：MEA加热系统，6：MEA接口板，7：置于记录放大器内的单孔MEA芯片。（D）诱导光诱导动作电位（liAPs）前后同一电极的记录示例。上方：约6分钟的记录，虚线框标出下方放大显示的区域。（E）场电位（FP，上方）和光诱导动作电位（liAP，下方）的放大图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg" /> 
图2：liAP诱导后信号传播模式保持保守。 合胞体内部兴奋波信号传播的伪彩色编码。蓝色表示早期时间点（从-4 ms开始）；红色表示晚期时间点（+3 ms），以参考电极E54记录的信号为基准，颜色条如图所示。信号从电极阵列的右上方向左下方传播。（A）liAP诱导前；（B）liAP诱导后1分钟；（C）liAP诱导后4分钟。Flash符号表示在电极64处的激光诱导位点。注意整体传播方向无明显变化。黑色矩形表示无效数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg" /> 
图3：FP/liAP 参数定义与记录方案。（A）可从经典 FP 中提取的参数。（B）可从 liAP 中获得的额外参数。（C）药物测量的时间线。从左至右：60 秒对照记录、liAP 诱导、60 秒 liAP 记录、药物施加、300 秒药物灌注时间、liAP 再次诱导、60 秒 liAP 记录。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg" /> 
图4：硝苯地平以浓度依赖性方式缩短心肌细胞动作电位时程（liAP）。（A）上图：对照条件下（蓝色）和0.3 µM硝苯地平作用下（红色）的荧光动作电位（FP）记录轨迹。为便于观察，轨迹在y轴方向进行了偏移显示。下图：同一多电极阵列（MEA）记录获得的liAP轨迹，显示liAP时程缩短并伴有搏动频率增加。（B）对照（蓝色）及不同浓度硝苯地平（红色）作用下单个liAP的叠加图。a：0.01 µM，b：0.1 µM，c：0.3 µM。注意随着浓度升高，liAP时程逐渐缩短。（C）由FP（黑色）和liAP（红色）记录获得的信号宽度的浓度-反应关系。数据来自n = 3次独立实验，并以对照组为基准进行归一化处理。误差线表示均值的标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg" /> 
图5E4031 可诱导（促）心律失常行为。 (A) FP（顶部）和liAP（底部）在对照条件下的结果。 (B-C) 应用 E4031 后在不同时间点记录 FPs 和 liAPs0.1 &#181;M). 80 秒后，延迟后除极（EADs）首次出现在 liAP 末期（B；红色箭头所示）。在测试化合物存在下，320 秒后 EADs 转变为异位搏动（C）。D) 530 秒后，心脏合胞体进入心动过速状态。轨迹来自 liAP 记录。 (EFP（黑色）和 liAP（红色）宽度的浓度-反应关系。数据来自 n = 4 次实验，已归一化至对照组。误差线表示平均值的标准误。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg" /> 
图6：与场电位相比，局部动作电位对致心律失常事件的检测更为敏感。 （A）在施加3 µM 多非利特期间，同一孔中的场电位记录；（B）局部动作电位记录。在部分局部动作电位末期可检测到早期后除极（EADs），但在场电位记录中则无法发现。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

激光穿孔与微电极阵列（MEA）相结合，可实现对培养的原代心肌细胞及干细胞来源心肌细胞的动作电位样信号记录。相较于标准记录方法，该技术提供的波形形态可更深入揭示受试化合物的作用机制，将膜片钳与MEA检测结果相联系，有望进一步优化未来的心脏安全性研究。

危及生命药物诱发的心律失常通常以心肌动作电位（AP）延长为先兆，常伴有微小的……

该方法能够在传统MEA上记录类似细胞内动作电位的信号，从而更准确地描述动作电位的形态，并更敏感地分类致心律失常电位。与典型场电位记录相比，类似细胞内的实际电位形态可更深入揭示底层离子通道激活的精确机制。当该方法应用于通过干细胞技术获得的临床患者来源心肌细胞时，可有助于病因诊断以及心律失常等心脏疾病的个性化治疗。我们的技术人员Karin Gebhardt将演示心肌细胞的培养过程。首先，在超净台内使用10微升移液器将纤连蛋白逐滴加到先前已高压灭菌的MEA电极区域上进行包被。为减少渗透压冲击，将铺板溶液在90秒内逐滴加入含有解冻心肌细胞的50毫升离心管中。然后轻柔地向管中加入8毫升铺板培养基，并小心混匀细胞悬液。使用10毫升移液管去除上清液，注意不要丢弃沉淀，并将细胞数量调整至最终浓度。在细胞接种前，使用10微升移液管从MEA电极区域移除已施加的包被溶液。为避免包被干燥，应立即进行细胞接种，将4微升细胞悬液逐滴加至电极区域，此操作适用于六孔MEA和单孔MEA。随后，将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育1小时，使其贴壁。 在超净工作台内，分别为六孔MEA和单孔MEA加入200微升和1毫升预热至37摄氏度的无菌包被培养基。进行MEA记录时，将MEA系统放置在设备上方，使MEA芯片支架居中对准物镜孔。然后调整MEA装置的位置，使激光聚焦于电极上，确保物镜正对MEA系统上的孔洞。为使细胞从机械扰动中恢复，在记录前15分钟将培养有细胞的MEA芯片从培养箱转移至MEA记录系统。接着，使用异丙醇棉签小心清洁电极接触垫和针脚，以降低噪声水平。将MEA芯片小心放入MEA记录系统中，并正确放置六孔MEA芯片（使序列号朝向右侧）或单孔MEA芯片（使参考电极位于左侧）。现在，将MEA系统集成加热设置为38摄氏度。关闭设备盖子，因为集成的安全开关仅在盖子闭合于MEA芯片上方时才允许激光激活。使用MEA配置程序，将MEA系统的高通和低通滤波器分别设置为0.1赫兹或更低以及3,500赫兹。使用MC机架软件或任何其他替代软件进行记录。根据实验调整输入范围，确保信号不会使放大器和采样率饱和。使用软件的长期显示功能来检查记录。将MEA芯片插入MEA设备后，通过FB ALP软件设置并初始化激光机械装置。然后，点击初始化按钮。初始化结束后，六孔MEA的虚拟激光点将位于D孔，单孔MEA的虚拟激光点将位于左下角。然后按住控制键并单击鼠标，将虚拟激光点移至D5电极的中央，并通过按住控制键并滚动鼠标滚轮来调整焦距。或者，也可使用自动对焦功能。按下按钮集 P1，虚拟激光点将自动移至 F 孔中。此时系统已完成校准。根据实验要求调整激光功率和处理时间。要启动激光，请点击激光关闭按钮，该按钮将显示为激光开启，然后切换到记录软件。选择一个文件名，然后点击窗口顶部的红色录制按钮，接着点击播放按钮以开始记录测量数据。在使用激光打开细胞之前，先记录60秒的基线。然后切换回初始化软件，在软件窗口右侧的虚拟图上，将需要通过激光排除的电极取消激活。启动激光时，使用 Alt 键加鼠标点击，并选择该孔的中心电极。这将自动触发激光打开该孔中每个电极上的细胞。对每个孔重复此操作，以打开该选定孔中所有先前已激活的电极。首先将尼非地平（Nifedipine E-40 31）和多非利特（Dofetilide）以毫摩尔浓度溶于二甲基亚砜（DMSO）中，然后用完全培养基稀释至目标浓度的 10 倍。孔中DMSO的终浓度绝不可超过0.1%。记录60秒的基础活性。启动激光诱导穿孔，操作方法如前所述，使FPS转化为liAPs。每孔仅加入单一浓度的药物。分别从六孔和单孔MEA中移除每孔20微升和100微升的培养基。向孔中加入20微升或100微升待检测的药物储备液。根据MEA类型，轻轻吹打两到三次。让化合物冲洗300秒。在此期间，liAP波形可能转变为FP波形。再次诱导激光诱导的穿孔，并在 liAP 上额外记录 60 秒内可能出现的化合物诱导的缺陷。加入硝苯地平以浓度依赖的方式缩短了 liAP 的平台期，从而缩短了整个 liAP。这种缩短程度与未经过操作的电极所记录的心肌细胞场电位相当。E-40 31 抑制了相关 KV1.11 钾通道的复极化过程，并在较高浓度下导致心肌细胞出现心律失常行为。此外，E-40 31 以浓度依赖的方式延长了 liAP 持续时间。在 liAP 末期，于 0.1 微摩尔浓度下观察到微小的正向电压偏转，且随着浓度升高该偏转更加明显，提示出现了一种称为早后除极（EADs）的短暂性新除极现象。在最高浓度0.1微摩尔时，这些早后除极随时间推移发展为异位搏动，即提前出现的动作电位。早后除极和异位搏动是致心律失常活性的关键指标。最终，电活动导致心律不齐的搏动。浓度-反应关系与动作电位（FP）和局部动作电位（liAP）记录结果相关。此外，在存在多非利特（dofetilide）的情况下，同一孔中的FP和liAP持续时间均约为两秒，FP波形呈现出规律的复极化偏转。在liAP中，EAD是可检测到的。每次进行膜片钳记录前调整焦距非常重要，因为失焦的显微镜图像可能影响细胞的封接形成。此外，动作电位应在光遗传操作后立即采集，用于后续分析。与标准MEA相比，该技术在检测既往心律失常效应方面更为敏感，能够更精确地检测化合物的不良效应。

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