Name: 小细胞外囊泡高通量分离纯化的流式细胞术分选参数优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 了解流式细胞术分选参数优化方法，用于高通量分离纯化50至200纳米的小细胞外囊泡。该方法通过优化激光功率、流体压力和散射参数，实现细胞外囊泡的快速、特异性分离，为神经科学和细胞生物学研究提供可靠的实验基础。

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本工作得到了浙江中医药大学科研基金（2020ZG29）、浙江省基本公益研究计划项目（LGF19H150006，LTGY23B070001）、浙江省教育厅科研项目（Y202147028）以及浙江大学实验室部门实验技术项目（SJS201712，SYB202130）的资助。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>制备添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。将人胰腺癌细胞PANC-1以1 × 106 个细胞/mL的密度接种于75 cm2 培养瓶中，在37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
	<li>在显微镜下观察，当细胞密度达到75%–80%时进行传代。吸除培养基，用3–5 mL磷酸盐缓冲液（PBS；0.01 M，pH 7.2–7.4）冲洗2次。</li>
	<li>弃去液体，加入1–2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，观察细胞在显微镜下变圆并从瓶壁脱落。加入新鲜培养基终止消化，吹打混匀后按1:2至1:4的传代比例（推荐）将细胞悬液分装至新的75 cm2 培养瓶中，每瓶加入15 mL培养基。 
	&#8203;注意：所有操作均需在生物安全柜中进行，以避免细胞污染。</li>
</ol>
2. 培养基收集
<ol>
	<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。收集细胞上清液（90 mL）至两个 50 mL 离心管中，并在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的无菌管中，并在 4 °C 下依次以 2,000 x g 离心 20 分钟、10,000 x g 离心 30 分钟和 12,000 x g 离心 70 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 10 mL PBS 轻柔吹打重悬沉淀进行洗涤。再次在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 70 分钟，然后将沉淀重悬于 10 mL PBS 缓冲液中，得到细胞外囊泡（EV）混合物。</li>
	<li>进行纳米颗粒追踪分析（NTA）以定量并测定 EV 混合物的粒径。NTA 分析操作请参照仪器操作手册及参考文献21。</li>
</ol>
3. 细胞分选
<ol>
	<li>执行流式细胞分选仪的标准启动程序。按下启动按钮开启仪器。在激光控制面板上点击激光功率按钮。在智能取样器子菜单中按下更换储液罐按钮，以对流路系统加压。 
	注意：启动前请确保废液罐为空，鞘液罐已加满。</li>
	<li>使用经超声清洗的50 µm气雾式喷嘴，并将其安装至喷嘴组件上。在压力控制台将鞘液流压力调节为80 psi，样品流压力调节为80.3 psi。</li>
	<li>按下启动鞘液流按钮，开始鞘液流运行。在智能取样器子菜单中点击去气泡按钮，自动去气泡10分钟，然后关闭该功能。 
	注意：在细胞分选过程中，不同尺寸的气雾喷嘴需要不同的鞘液压力以维持液流稳定性。本方法中使用50 µm喷嘴，只有当鞘液压力大于或等于80 psi时，才能产生稳定的侧向液流。样品流与鞘液流之间的压力差决定了分选的上样速度。在本方法设定条件下（样品流与鞘液流压力差为0.3–0.6 psi），液流相对稳定，且上样速度可使分选效率从压力差小于0.3–0.6 psi时的50%提升至80%。</li>
	<li>对液流进行校准并确定激光焦点位置。打开照明室光源，通过小孔观察液流。调节上下、左右及前后微调旋钮，使液流居中对准小孔并聚焦清晰。</li>
	<li>选择激光与液流交汇选项卡。根据提示连续按下绿色箭头按钮，完成激光交汇点与喷嘴对准的校准过程。</li>
	<li>进入精细激光对准界面。选择640-722/44 (H)通道作为X轴参数，405-448/59 (H)通道作为Y轴参数。按下触发参数选择器，选择488 nm激光的SSC参数。打开所有激光快门。 
	注意：所选X轴和Y轴参数取决于系统的激光配置。若系统无640 nm或405 nm激光，可选择其他参数。为获得最佳效果，应选择在小孔条带上空间分离度最大的激光（不包括355 nm激光）。</li>
	<li>将彩虹荧光微球用双蒸水稀释，取一滴加入1 mL双蒸水中，终浓度为每毫升1 × 106个微球。打开样品室门，放入装有已制备彩虹荧光微球的离心管。</li>
	<li>按下启动样品按钮。调节上下微调旋钮以优化荧光强度，使每个信号尽可能强。在触摸屏控制面板上按下启动质控（QC）按钮，自动执行质控程序。</li>
	<li>执行液滴延迟校准。进入分选设置界面，选择液滴延迟按钮。按下IntelliSort初始化按钮。仪器将自动调节液滴振荡频率和振幅，使液滴延迟值达到25 ± 5，并能清晰观察到液滴断裂点。按下维持按钮。</li>
	<li>选择离心管作为分选输出类型。在分选室中放置一个15 mL离心管架。打开极板电压，并将电压设置为约4000 V。</li>
	<li>通过选择液流设置按钮开启测试图案。调节充电相位滑块和偏转滑块，确保液流图像与收集管对齐。选择勾选标记按钮确认设置。</li>
	<li>登录计算机上的Summit工作站。从文件主菜单中创建新实验方案。在Summit软件控制面板中选择直方图选项卡，创建一个散点图。</li>
	<li>在工作区中右键点击新散点图的坐标轴，选择FSC作为X轴参数，SSC作为Y轴参数。将FSC和SSC以对数形式显示。</li>
	<li>选择采集选项卡，并定位到采集参数面板。在启用参数子菜单中启用所有信号。选择FSC作为触发参数，并将阈值设为0.01。将FSC和SSC的电压和增益分别调节至250和0.6，以确保FSC与SSC散点图中的事件和细胞群能够清晰分离。 
	&#8203;注意：阈值设置相当于设定流式细胞术可检测的粒子大小。阈值越大，可检测的粒子越大，而较小的粒子将被阈值过滤而无法检测。本方法中阈值设为0.01，因此所有大于电子噪声的粒子均可被检测。</li>
</ol>
4. sEV 的分离
<ol>
	<li>将荧光聚苯乙烯微球稀释为100 nm、200 nm和300 nm的悬浮液。取1 µL微球加入1 mL双蒸水中。</li>
	<li>依次加载微球悬浮液。在Summit软件的采集菜单下选择开始，记录20,000个事件。 
	注意：事件数量可根据需要调整。建议不少于5,000个事件，以满足统计学显著性要求。</li>
	<li>在FSC与SSC散点图上右键单击，创建矩形区域，并拖动调整电子噪声区域和100 nm微球群体的位置与大小。右键单击相应区域，分别将其重命名为R7和R4。重复上述步骤，依次用矩形框选200 nm和300 nm微球，并分别重命名为R5和R6。</li>
	<li>最后，基于电子噪声及定义为R8的200 nm颗粒位置，确定50–200 nm的分选区域。 
	注意：50 nm的检测下限设定在流式分选仪流动池电子噪声略上方。因此，噪声区域与200 nm微球群体之间的区域可定义为50–200 nm范围。</li>
	<li>在分选逻辑与统计面板中编辑分选决策。双击左侧（L1）流道的空白字段，选择名为R8的区域以建立分选逻辑。选择纯度模式中的中止模式，并为L1流道设置1滴的液滴包络。</li>
	<li>加载来自步骤2.3的500 µL EV混合样品。在Summit软件的采集菜单下点击开始按钮以获取数据，随后在分选菜单中点击开始，将50–200 nm的sEV收集至15 mL离心管中。 
	注意：所有操作均需在无菌环境中进行，以最大限度减少污染。</li>
	<li>通过透射电子显微镜（TEM）观察sEV的存在，并使用纳米颗粒追踪分析（NTA）验证sEV的粒径。进一步通过蛋白质印迹（WB）分析检测CD9、CD63和CD81标志物的表达18。</li>
</ol>

<ol><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
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<li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li>
<li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+exosomal+isolation+methods%3A+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).</li>
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<li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li>
<li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li>
<li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li>
<li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li>
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<li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案概述了一种利用流式细胞分选仪分离和纯化粒径为50-200 nm的小细胞外囊泡（sEV）的优化方法，并通过纳米颗粒追踪分析（NTA）对该方法进行了验证。该方法解决了获取粒径均一、纯度高的sEV的技术瓶颈，避免了包裹在较大尺寸细胞外囊泡中的无关生物分子的干扰22。流式细胞术可实现快速、高通量分析，每秒可捕获100,000个颗粒，并每秒做出70,000次分选决策17，显著缩短了处理时间，同时反映了sEV颗粒的异质性。此外，基于流式细胞术的本方案可根据研究者对特定尺寸EV亚群的兴趣进行定制。在保持上述仪器参数（如气雾喷嘴、鞘液压力、样本流压力和触发阈值参数）不变的前提下，可通过设置不同的设门范围来识别和分离目标群体。
该方法的技术难点在于分离不同尺寸范围的群体，尤其是将其与背景噪声区分开来。我们确定了一组关键的分选参数。首先，喷嘴尺寸会影响分选速率。为了提高分选后获得的小细胞外囊泡（sEV）的浓度，本方法采用50 µm的喷嘴，并需要80 psi的鞘液压力以稳定侧流。鞘液压力越高，液滴频率增...

细胞会释放不同大小的细胞外囊泡（EVs），这些囊泡含有信号分子和膜内含物，在细胞间通讯中具有重要作用1。不同大小的EVs具有不同的生物学功能，其中50–200 nm的小细胞外囊泡（sEV）能够将RNA、DNA和蛋白质精确地分布到特定的细胞外位置。sEV还有助于决定其分泌机制，不仅参与调控免疫监视、干细胞维持、血液凝固和组织修复等正常生理过程，也涉及肿瘤进展和转移等多种疾病的病理机制2,3。有效分离和分析sEV对于发现生物标志物以及设计未来的药物干预策略至关重要。
随着对sEV临床应用的持续研究，sEV的分离方法面临着更高的要求。由于sEV在大小、来源和内容物方面具有异质性，且其理化和生化特性与其他EV相似，目前尚无标准的sEV分离方法4,5。目前，超速离心法、尺寸排阻色谱法（SEC）、聚合物沉淀法和免疫亲和捕获法是最常见的sEV分离方法6。尽管超速离心法耗时较长，所得sEV纯度较低，粒径分布范围宽（40–500 nm），且长时间离心会对sEV造成显著的机械损伤7,8,9，它仍是科研中sEV分离的金标准。聚合物沉淀法通常使用聚乙二醇（PEG），但会伴随细胞外蛋白聚集体的共沉淀和聚合物污染，导致后续功能分析所需的纯度无法接受10,11。基于免疫亲和捕获的方法需要使用成本高昂且特异性各异的抗体，同时存在处理体积小、得率低等问题12,13,14。粒径是评估分离sEV纯度的主要指标之一。尽管实现sEV的高纯度仍难以企及，但SEC可有效去除大量培养基成分，且通过SEC方法提取的sEV颗粒主要集中在50–200 nm范围内15。现有技术存在若干缺点，包括但不限于耗时长、纯度低、得率低、重复性差、样本通量低以及可能对sEV造成损伤，这些限制使其难以适用于临床应用16。因此，在多种科研与临床场景中，亟需一种快速、低成本且能按尺寸特异性分离sEV的方法，适用于多种生物流体。
在流式细胞术中，单个颗粒以高通量、多参数的方式进行分析，并可分选出特定亚群17。由于细胞外囊泡（EVs）具有高度异质性，理想的分析方法应为单颗粒水平的流式检测，该方法已借鉴细胞分析的范式，利用光散射和荧光标记来识别与生理特性相关的特征及蛋白质组分18,19,20。然而，传统流式细胞术在检测小细胞外囊泡（sEV）时面临挑战，主要因其体积微小且表面生物标志物丰度较低。通过优化检测参数，无论采用前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）还是荧光阈值触发参数，均可提高流式细胞术的灵敏度，以更好地区分背景噪声与sEV信号19。
通过本方案，使用荧光微球作为标准品优化了高分辨率流式细胞分选参数。通过选择合适的喷嘴尺寸、鞘液压力、阈值触发参数以及控制散射光强度的电压，我们能够从复杂的混合物中分离出特定的sEV亚群。

<table><tbody><tr><td>离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>SUER</td><td>SUER050QY</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞分选仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>Moflo Astrios EQ</td><td></td></tr><tr><td>人胰腺癌细胞 PANC-1</td><td>NA</td><td>NA</td><td>PANC-1 细胞由浙江大学生命科学学院杨卫军教授提供</td></tr><tr><td>激光粒度与Zeta电位分析仪&amp;nbsp;</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS 90</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>C20012500BT</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯荧光微球</td><td>Beckman Coulter</td><td>6602336</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Gibco</td><td>1713949</td><td></td></tr><tr><td>超彩虹荧光颗粒</td><td>Beckman Coulter</td><td>B28479</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima-L80XP</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW32TI</td><td></td></tr></tbody></table>

优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

所有细胞类型均可释放小型细胞外囊泡（sEV），其内携带蛋白质、DNA 和 RNA。这些信号分子可作为细胞生理与病理状态的指示标志。然而，目前尚无标准化的 sEV 分离方法，这限制了后续生物标志物的鉴定及药物干预研究。本文提供了一种利用流式细胞分选仪分离和纯化 50–200 nm sEV 的详细实验方案。实验中选用 50 µm 喷嘴及 80 psi 鞘液压力，以获得良好的分选速率和稳定的侧向液流。采用标准尺寸的聚苯乙烯微球对 100、200 和 300 nm 颗粒群体进行定位。通过进一步优化电压、增益以及前向散射光（FSC）触发阈值，可将 sEV 信号与背景噪声有效分离。这些优化条件构成了一套关键的分选参数，使研究者仅通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）即可获得具有代表性的 sEV 群体。基于流式细胞术的分离方法不仅可实现高通量分析，还可根据生物标志物的表达情况对 sEV 进行同步分类或蛋白质组学分析，从而为多种下游研究应用提供了可能。

实验方案的流程图如图1所示。本方法中，采用标准尺寸的聚苯乙烯微球作为粒径分布的参考标准。在特定的仪器参数条件下，通过FSC与SSC散点图的对数形式，可将颗粒信号与背景噪声明显区分开。门控策略如图2所示。R4、R5和R6分别代表100 nm、200 nm和300 nm微球的位置。R7为低于50 nm的电子噪声检测限，R8为50–200 nm颗粒的位置范围。
经超速离心后，源自PANC-1细胞的EVs混合物的粒径分布范围较宽，为40–400 nm（图3）。为分离和纯化50–200 nm的sEV，根据标准微球的位置进行流式细胞分选，以获得特定粒径的sEV（图4）。通过NTA对分离质量进行验证，结果显示分选后sEV的粒径范围在50–200 nm之间（如图5所示）。进一步通过TEM观察到sEV的存...

本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。

小型细胞外囊泡（sEV）可由所有细胞类型释放，携带蛋白质、DNA和RNA。信号分子可作为...

本方案通过优化流式细胞分选参数，为小型细胞外囊泡提供了一种快速且基于粒径特异性的分选方法。这些优化提供了一组关键的分选参数设置，使研究者仅通过前向散射光与侧向散射光即可获得具有代表性的小型细胞外囊泡群体。首先，执行流式细胞分选仪的标准开机程序。按下启动按钮打开设备，然后点击激光控制面板上的激光电源按钮。在智能采样器子菜单中按下更换储液罐按钮，以对流体系统加压。使用经超声清洗的50微米喷嘴和气流喷嘴，并将其安装至喷嘴组件下方。在压力控制台上，将鞘液流的压强调节至80 SI，样品流的压强调节至80.3 SI。按下启动鞘流按钮，以开始鞘液流的流动。在Smart Sampler子菜单中点击去气泡按钮，自动去除气泡10分钟后关闭该功能。为对准液流并确定激光光斑位置，打开照明室光源，通过针孔观察液流。调节上下、左右以及前后微调旋钮，使液流在针孔处居中并对液流进行聚焦。打开所有激光快门，选择激光与液流交汇选项卡，然后根据提示持续按压绿色箭头按钮，完成激光交汇与喷嘴对准校准过程。进入精细激光校准界面。将 640 纳米激光器和 772 栏 44 带通通道设置为 x 轴参数，将 405 纳米激光器和 448 栏 59 带通通道设置为 y 轴参数。按下触发参数选择器，并选择 488 纳米激光器的前向散射参数。接下来，将一滴彩虹荧光微粒加入 1 毫升双蒸水中，稀释至终浓度为每毫升 1 × 10⁶ 个微粒。打开样品室门，装载一支已制备好的彩虹荧光微粒管。按下开始进样按钮，并调节上下微调旋钮以优化荧光强度，使每个信号尽可能强。按下触摸屏控制面板上的“开始质控”或“QC”按钮，以自动执行质控程序。然后按下 IntelliSort 初始化按钮。仪器将自动调节液滴振荡的频率和振幅，以获得约 25 的液滴延迟，并能清晰地观察到液滴断裂点。接下来，按下延迟液滴按钮和保持按钮。选择离心管作为分选输出类型。将一个15毫升离心管架放入分选室中。打开极板电压，并将极板电压设置为约 4,000 伏特。接着，通过选择流设置按钮来开启测试图案。调节充电相位滑块和偏转滑块，以确保液流的图像与收集管对齐。然后选择对号按钮。登录计算机上的 Summit 工作站。通过文件主菜单创建新协议。然后，在 Summit 软件控制面板中选择直方图选项卡，创建一个点图。将前向散射设为横轴参数，侧向散射设为纵轴参数。接着，在工作区中右键点击新点图的坐标轴，将前向散射和侧向散射以对数形式显示。选择采集选项卡并找到采集参数面板。在启用参数的子菜单中启用所有信号。选择前向散射作为触发参数，并将阈值设置为 0.01。将前向散射和侧向散射的电压和增益分别调整为250和0.6，以确保前向散射与侧向散射图中的事件和细胞群能够分离。将荧光聚苯乙烯微球加入1毫升双蒸水中，稀释成100、200和300纳米的悬浮液（每种悬浮液加入1微升微球）。然后依次加载微球悬浮液。在Summit软件的采集菜单下选择“开始”，记录20,000个事件，记录完成后点击“停止”。右键单击前向散射与侧向散射点图以创建矩形，拖动以调整大小。通过右键单击电子噪声区域和100纳米微球群体区域，将其分别重新命名为R7和R4，并重新定位这些区域。重复上述步骤，依次用矩形框选200和300纳米的微球，并将其分别重命名为R5和R6。最后，根据电子噪声及200纳米颗粒的位置确定50至200纳米的分选区域，并将其定义为R8。在分选逻辑与统计面板中，通过双击左侧空白区域或L1流的空白字段，选择名为R8的区域以编辑分选逻辑。为L1流选择纯度优先的中止模式，并选择大于一个液滴的液滴包络。加入500微升预先制备的细胞外囊泡（EVs）混合液样品。在Summit软件的采集菜单下点击“开始”按钮以获取数据，然后点击“停止”。接着，在分选菜单中点击“开始”，将50至200纳米大小的小细胞外囊泡（sEV）收集到一个15毫升离心管中。通过流式细胞术分析标准尺寸的聚苯乙烯微球，以在前向散射与侧向散射图中确定50至200纳米粒径范围，结果显示可区分的颗粒信号。R4、R5和R6分别代表100、200和300纳米颗粒的位置。R7为电子噪声，表示50纳米颗粒的检测限，R8表示50至200纳米颗粒的位置范围。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）检测，经超速离心后从胰腺细胞来源的细胞外囊泡（EVs）混合物的粒径分布范围较宽，为40至400纳米。采用流式细胞分选技术对R8区域内的50至200纳米小细胞外囊泡（sEV）进行分离与纯化。通过NTA验证分离质量，结果显示分选后sEV的粒径范围为50至200纳米。通过透射电子显微镜（TEM）进一步观察到sEV的存在，并通过蛋白质印迹分析证实所分离的sEV含有CD6、CD63和CD81标志物。该方法可实现小细胞外囊泡的分离，并支持对小细胞外囊泡基因表达进行分类或初步分析，从而为多种下游研究应用提供了可能。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

小细胞外囊泡高通量分离纯化的流式细胞术分选参数优化

本视频展示了基于密度梯度超速离心的纯化方法，用于分离适合进行表征研究的细胞外囊泡亚群。...

细胞外囊泡亚群的纯化：利用密度梯度超速离心法纯化细胞外囊泡亚群的技术

在本视频中，我们介绍一种基于流式细胞术从人外周血B细胞中分选初始B细胞、记忆B细胞以及浆母细胞/浆细胞亚群的实验方案。通过荧光标记抗体与B细胞表面表达的CD19、CD27和CD38受体结合，可区分不同的B细胞亚群，随后进行细胞分选。...

基于流式细胞术的循环B细胞亚群分选

使用流式细胞术（FCM）检测细胞外囊泡（EVs）的方法有多种。在确定最合适的检测方法时，应考虑多个方面。本文介绍了两种检测EVs的方案，分别采用单颗粒检测法或基于微球的方法。...

使用流式细胞术分析细胞外囊泡的技术

本方案描述了一种可重复的方法，专为使用细胞培养上清液检测小细胞外囊泡（EV）表面表位而设计。该方法利用与识别表面抗原CD9、CD63和CD81的抗体偶联的磁珠，对EV进行特异性免疫沉淀。本方法已针对后续的流式细胞术分析进行了优化。...

细胞条件培养基中外泌体的流式细胞术分析

本方案通过结合细胞外囊泡（EV）沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获技术，高效且高得率地将细胞外囊泡与病毒颗粒分离，从而实现简化的操作流程并降低起始样本体积需求，最终获得可重复的细胞外囊泡制备物，适用于所有细胞外囊泡相关研究。...

高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

本方案表明，可利用尺寸排阻色谱法从细胞培养条件培养基中有效分离出细胞外囊泡。...

利用尺寸排阻色谱法从细胞条件培养基中分离细胞外囊泡

细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。...

利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

本方案详细描述了间充质基质细胞释放的细胞外囊泡（EVs）的分选方法。特别是，重点介绍了仪器设置以及分选条件的优化。目标是在保持细胞外囊泡特性的同时对其进行分选。...

设定外泌体分离的成功分选条件

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

表征生物体液中的细胞外囊泡

本文介绍了一种用于制备、纯化和使用酶包封外膜囊泡（OMV）的实验方案，该囊泡可提高酶的稳定性，适用于多种不同应用。...

定向蛋白质包装至外膜囊泡中 大肠杆菌设计、生产与纯化

了解流式细胞术分选参数优化方法，用于高通量分离纯化50至200纳米的小细胞外囊泡。该方法通过优化激光功率、流体压力和散射参数，实现细胞外囊泡的快速、特异性分离，为神经科学和细胞生物学研究提供可靠的实验基础。

优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化

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