Name: 通过焦磷酸测序对线粒体基因组中的单核苷酸多态性进行基因分型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 了解焦磷酸测序技术对线粒体DNA单核苷酸多态性进行基因分型的方法。该技术可准确测定异质性水平，为线粒体疾病的诊断提供经济可靠的分子生物学工具。

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我们感谢米兰基金会IRCCS Carlo Besta神经研究所的Silvia Marchet和Constanza Lamperti，她们制备并提供了本方案中用作示例的m.3243A&#34;Carlo Besta&#34;、Fondazione IRCCS、Milan）用于制备和提供本方案中作为示例使用的m.3243A&#62;G细胞融合细胞。我们还要感谢剑桥大学MRC线粒体生物学研究组（MRC-MBU）成员在本研究过程中提供的有益讨论。本工作得到了英国医学研究理事会核心资助（MC_UU_00015/4和MC_UU_00028/3）的支持。P.A.N. 和 P.S.-P. 分别获得了Lily基金会和Champ基金会的额外资助。

已提供知情同意，用于使用人类3243A&#62;G 细胞杂交线及永生化的 m.5024C&#62;本研究中使用的T MEFs。由于患者细胞并非在剑桥大学采集，因此本案例无需伦理批准。然而，使用人类成纤维细胞可能需要伦理审批。在为焦磷酸测序准备样本DNA时，强烈建议遵循PCR设置的最佳实践。若未严格分离PCR前与PCR后操作区域，使用相同引物频繁扩增可能导致扩增子污染，并对后续基因分型引入偏差。本文所述流程使用了单一制造商的特定设备，详细信息见于 材料表PCR引物设计可根据需要手动完成；但建议使用现有的软件进行（参见 材料表).
1. 焦磷酸测序引物设计与检测方法选择
<ol>
	<li>使用软件获取引物候选序列
	<ol>
		<li>获取待基因分型物种的线粒体DNA序列文件，并确定SNP的位置。确保所使用的参考序列对所研究的突变采用适当的碱基编号，以便于准确识别SNP的位置。</li>
		<li>复制 SNP 位点上下游各 1,000 个碱基对，将截短后的序列粘贴至用于焦磷酸测序引物设计的软件中（参见 材料表).</li>
		<li>在软件中，通过高亮标记多态性碱基，右键点击并选择，将待分析的SNP碱基设为焦磷酸测序实验的目标位点 设定目标区域.</li>
		<li>按压 播放 单击界面右上角的图标以启动引物选择。</li>
		<li>等待软件自动设计引物三联组：其中两对引物用于模板DNA的预扩增，第三对引物用于焦磷酸测序仪中的合成测序。通过右键点击并选择，保留所有引物组合 复制所有引物组.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从生成的引物列表中选择最佳引物组合
	<ol>
		<li>根据软件输出结果，保留质量评分最高的引物组合，软件会按照质量评分从高到低的顺序提供引物组合。如果可能， 省略引物组 与一个 评分低于80.</li>
		<li>对于保留的引物组，识别并 复制所产生的扩增子 由扩增引物进行扩增。</li>
		<li>使用 NCBI Blast 的在线提交门户，将扩增子与待分型生物体的完整基因组进行比对&#160;https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。在提交过程中，从下拉菜单中选择以下选项：
		<ol>
			<li>选择 数据库 | 基因组与转录组数据库</li>
			<li>选择 人类 或 小鼠 根据所分析的SNP，在下拉菜单中选择。</li>
			<li>选择 优化为 | 部分相似序列（Blastn）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>（可选）若对小鼠或人类以外的生物进行基因分型，在提交时请选择以下选项：
		<ol>
			<li>选择 数据库 | 标准数据库</li>
			<li>选择 RefSeq 代表性基因组 在下拉菜单中</li>
			<li>选择 优化为 | 部分相似序列（Blastn）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在可能的情况下，应去除与线粒体DNA扩增子具有完全同源性的扩增子，特别是当引物结合区域完全同源时（见讨论部分）。 
		注意：BLAST 比对工具将返回与预扩增片段具有显著同源性的任何序列。这有助于检测引言中所述的核线粒体 DNA 片段（NUMTs），若不加以考虑，这些片段会与线粒体 DNA 共同扩增，从而引入偏差。</li>
		<li>订购获得的寡核苷酸 通过 该流程中，确保在合成引物时将5'端生物素修饰添加到正确的扩增引物上，从而使测序引物能够与生物素标记的链互补。 
		&#8203;注意：测序引物的选择比扩增引物更灵活，建议测序引物的3'端与可变位点之间至少间隔一个碱基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 预扩增 PCR 优化
<ol>
	<li>使用适当的方法提取总基因组DNA，以制备DNA样本。 
	注意：具体方法主要取决于待基因分型的细胞数量及其来源。若使用含有蛋白酶K的裂解缓冲液从单个细胞中提取DNA，则需将样本在95 °C下变性10分钟，以避免在后续PCR过程中干扰DNA聚合酶活性。</li>
	<li>PCR体系配置与热循环仪设置
	<ol>
		<li>选用一种高保真DNA聚合酶进行PCR反应。为四次反应配制总混合液（Master Mix）。由于焦磷酸测序仅需10 µL的PCR产物，因此建议每管PCR反应体系为25 µL（以便必要时进行技术重复）。以约10 ng基因组DNA为起始模板，正向和反向引物浓度均为1 µM，进行40个PCR循环。</li>
		<li>根据所用聚合酶的厂商说明书设定延伸时间，并结合所选预扩增引物的长度进行调整。</li>
		<li>使用具有可调退火温度功能的热循环仪。由于退火温度可能因引物序列、聚合酶缓冲液中的盐浓度及其他因素而异，因此在热循环程序中设置四个不同的退火温度。 
		注意：代表性结果中的示例实验采用了以下温度：55 °C、60 °C、65 °C和70 °C。</li>
		<li>将总混合液均分至四个200 µL的PCR管中，并在热循环仪中分别以选定的四个退火温度进行40个循环的扩增反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预扩增产物的电泳检测
	<ol>
		<li>在PCR反应进行的同时，配制含SYBR Safe或溴化乙锭作为染色剂的2%（w/v）琼脂糖凝胶（使用1x TBE缓冲液）。 
		注意：由于扩增片段通常较短，一般在100至500个碱基对之间，因此建议使用较高浓度的凝胶以提高分辨率。</li>
		<li>完成步骤2.2中的PCR反应后，取10 µL反应产物与适量DNA上样缓冲液混合，在2%琼脂糖凝胶上以7 V/cm的电压电泳约45分钟。</li>
		<li>在紫外透射仪上观察所得DNA条带。 
		&#8203;注意：预扩增步骤所选的热循环条件应产生一条大小正确且清晰单一的条带。较低的退火温度偶尔会导致非特异性扩增，从而对后续焦磷酸测序结果引入偏差。</li>
		<li>选择能够产生正确大小且条带清晰的最低退火温度，用于后续的扩增反应。</li>
		<li>（可选）切下大小符合预期的条带，使用所选的凝胶回收试剂盒进行纯化，并通过Sanger测序分析，以确认样本的大致异质性水平作为参考。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 仪器设置与运行
注意：一旦上一步中的 PCR 程序已优化，下一步则需使用正确的核苷酸序列对焦磷酸测序仪进行编程，以分析特定的单核苷酸多态性（SNP）。此过程需要输入测序引物 3' 端下游紧接的 10 个碱基，具体步骤如下所述。
<ol>
	<li>检测配置
	<ol>
		<li>打开焦磷酸测序仪配套的运行软件，在界面左上角选择新建检测。</li>
		<li>选择等位基因定量检测模板。</li>
		<li>在相应的输入框中输入待分析序列，即在测序引物下游直接掺入的核苷酸序列，该序列应位于目标SNP的上游。对于可变位点，用斜杠分隔两种可能的碱基（例如，A/T）。</li>
		<li>点击生成加样顺序，由软件自动确定合成测序反应中核苷酸的加样顺序。</li>
		<li>保存并为该检测命名。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>试剂准备与储存
	<ol>
		<li>将订购的测序引物用焦磷酸测序试剂盒中提供的退火缓冲液稀释至4 µM。 
		注：测序引物可先用水稀释至100 µM作为储备液，再根据需要进一步用退火缓冲液稀释至4 µM。</li>
		<li>酶和底物的准备与处理
		<ol>
			<li>首次开箱时，按照生产商的建议将冻干的酶和底物重新溶解。不使用时，储存于−20 °C。</li>
			<li>再次使用时，将酶和底物小瓶从−20 °C解冻。 
			注：试剂盒中的其他所有试剂均可在4 °C冷藏保存。稀释后的测序引物也可保存在4 °C。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将所需量的每种试剂置于冰上。</li>
		<li>将其他所需组分，即链霉亲和素包被的磁珠、吸收条和焦磷酸测序盘，保存在4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行实验 
	注：首次设计检测时，必须使用已知异质性的PCR产物进行校准，以确保该检测能够准确区分异质性水平。研究人员可使用已知异质性水平的PCR产物混合物作为标准品。也可通过引言和讨论中提到的其他方法（特别是NGS）对样本进行验证。
	<ol>
		<li>将待分析的DNA稀释至5 ng/µL。特别是在首次运行时，务必包含已知异质性水平的样本作为参考，和/或野生型样本。</li>
		<li>使用第1节和第2节中确定的扩增引物和参数，对5 µL稀释后的DNA进行25 µL体系的预测序PCR。每个样本需进行技术重复PCR。 
		注：预扩增PCR产物可在进行测序前短期保存于4 °C，或长期保存于−20 °C。</li>
		<li>运行文件设置
		<ol>
			<li>在焦磷酸测序仪软件界面左上角选择新建运行。</li>
			<li>焦磷酸测序仪可同时对48个独立的预扩增反应进行测序，测序盘上的每个空方格代表一个测序孔。通过右键单击方格并选择加载检测，加载第3.1节中配置的检测。如有需要，可使用不同的测序引物同时运行最多四种不同的检测。</li>
			<li>将引物加样模式设置为自动，以便为本次运行中使用的每种测序引物自动分配一个注射室。</li>
			<li>除非在一张测序盘上运行四种不同类型的检测，否则将运行模式设置为标准。</li>
			<li>确保运行模板文件中的检测数量与正在扩增的PCR反应数量一致。 
			注：若运行超过48个样本，需设置额外的运行文件。</li>
			<li>将运行文件保存至U盘。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>焦磷酸测序仪的引液
		<ol>
			<li>按下设备主触摸屏上的清洗按钮，并根据屏幕提示使用高纯度水清洗所有注射器。将吸收条插入仪器时，确保其两端位于&#34;9点钟&#34;位置（即正对中心左侧）。</li>
			<li>插入已在步骤3.3.3中设置好运行的U盘，并加载步骤3.3.3中定义的运行文件。 
			注：运行文件必须保存在U盘根目录下，不能位于任何文件夹内，否则仪器无法读取。</li>
			<li>根据设备提示，将所需试剂加载并引液至对应的注射器中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>样本盘准备与检测启动
		<ol>
			<li>让链霉亲和素包被的磁珠恢复至室温。 
			注：这些磁珠可用于捕获预扩增PCR步骤中的生物素化链。需从试剂盒外单独购买。</li>
			<li>将3 µL磁珠加入步骤3.3.3中运行文件定义的各孔中。</li>
			<li>将每个待测序的PCR反应液10 µL加入对应的样本孔中，并上下吹打以使样本与磁珠充分混合。尽量避免产生气泡。</li>
			<li>观察已引液的焦磷酸测序仪，待提示可将测序盘装入仪器时，先松开固定板的螺母，再将加载好的样本板与测序盘腔内的金属定位销对齐。</li>
			<li>待样本板牢固旋紧在板腔内后，通过触摸屏界面上的启动按钮开始测序运行。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 结果获取
<ol>
	<li>运行完成后，从仪器上拔下U盘，并将其重新插入运行焦磷酸测序软件的计算机。在执行以下步骤的同时，如果当天是最后一次运行，请根据提示对焦磷酸测序仪进行清洁。</li>
	<li>等待新生成的运行文件出现在U盘中，然后双击运行结果文件。该操作将自动分析每个孔在核苷酸掺入过程中产生的荧光素酶信号，并定量在3.1节实验配置中定义的目标线粒体等位基因。</li>
	<li>根据软件显示的以下颜色评分判断读长质量：蓝色表示运行结果理想，黄色表示存在警告，红色表示运行失败。如需保存结果，请在顶部窗口选择报告 | 完整报告，以生成包含本次运行中各孔焦磷酸图谱和结果的.pdf文件。或者，也可在报告 选项卡下以其他格式下载结果。</li>
</ol>

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</ol>

M.M. 是 Pretzel Therapeutics, Inc. 的联合创始人、股东及科学咨询委员会成员。P.S.-P. 和 P.A.N. 为 Pretzel Therapeutics, Inc. 提供咨询服务。

该实验方案成功的关键在于避免污染，尤其是在起始材料用量较少的情况下。建议在样品制备过程中尽可能使用紫外灯罩和带滤芯的移液器吸头，并将扩增前和扩增后操作区域分开。每次实验均应包含空白对照以及已知异质性水平的样品（如野生型DNA），作为基准用于检测技术或生物学偏差。
该检测方法存在一个值得注意的技术偏差，即掺入腺嘌呤类似物时会产生增强的发光信号。当在可变位置使用腺嘌呤时，通常会产生残余的荧光峰（例如，图2C）。因此，建议在可能的情况下，对相反链进行焦磷酸测序检测（此时将掺入胸腺嘧啶），以避免在可变位置掺入腺嘌呤类似物。然而，对于A&gt;T或T&gt;A突变，这一做法无法实现。尽管如此，如代表性结果所示，在检测设计中，引物的恰当选择可能更为重要。在代表性结果的第一部分中，针对m.3243A&gt;G突变的检测2是基于可变位置的A/G比值进行测序，而检测1则测量T/C比值。尽管检测2易受腺嘌呤掺入偏差的影响，但与摩尔标准品比较后显示，其结果更为准确，这一点通过简单的线性回归分析得以证实（...

线粒体基因组以小型（16.5 kb）环状分子（mtDNA）的形式存在，位于线粒体内层称为基质的最内层腔室中，编码线粒体呼吸链的13个亚基，以及其翻译所必需的tRNA和rRNA 原位 由线粒体核糖体1该基因组仅编码线粒体功能所需全部蛋白质的大约1%，其余蛋白质均由细胞核DNA（nDNA）编码。通常认为，线粒体起源于一种α-变形菌祖先与原始真核细胞之间的内共生融合事件。一旦这一假想的共生关系建立，线粒体的遗传信息便在数亿年间逐步转移至细胞核，这解释了与现代蓝细菌基因组相比，线粒体DNA（mtDNA）为何具有上述的高度紧凑性。2这种基因转移现象最有力的证据是核DNA中存在大量与线粒体DNA序列高度同源的长片段。这些核线粒体序列（NUMTs）在基因分型过程中常导致误判，因此在对线粒体DNA进行基因分型时，必须采取特定预防措施以避免受到核基因组的干扰。3 (图1A).
线粒体DNA（mtDNA）的另一个显著特征是其拷贝数因细胞类型而异，每个细胞中的拷贝数可从几十到数千不等4。由于这种多拷贝特性，单个细胞内mtDNA可容纳多种基因型，从而导致等位基因呈连续分布，这与核基因在考虑染色体纯合性或杂合性时所表现出的离散等位基因形成对比。线粒体等位基因的这种异质性被称为线粒体异质性（mitochondrial heteroplasmy），通常以某一特定突变在细胞总mtDNA中所占的百分比来表示其存在水平。与异质性相对的是均质性（homoplasmy），后者指一个细胞中仅存在一种类型的mtDNA。
检测线粒体异质性在定量携带致病性变异的线粒体DNA（mtDNA）分子比例时具有重要意义。此类变异表现为单核苷酸多态性（SNPs）、小片段插入缺失（indels）或大规模缺失5。大多数人类个体均存在致病性变异的异质性，但并不表现出任何临床表型；临床症状通常仅在致病性线粒体DNA的异质性水平达到一定阈值时才会显现，这一现象称为阈值效应6。尽管与致病性相关的具体阈值高度依赖于致病突变的类型及其发生的组织，但通常在异质性水平超过60%时出现7。
在多个研究领域中，线粒体基因分型十分常见。在医学领域，检测或定量线粒体DNA（mtDNA）突变可作为线粒体疾病的诊断标准，其中许多疾病起源于mtDNA的异常5除了对人类致病性突变的研究外，随着线粒体靶向的DddA衍生胞嘧啶碱基编辑器（DdCBEs）实现的线粒体碱基编辑技术的近期发展，携带线粒体DNA致病性单核苷酸多态性（SNPs）的动物模型的出现频率可能会增加8 基于TALE的脱氨酶（TALEDs）用于腺嘌呤碱基编辑9该方法将有助于深入理解线粒体基因型异常与由此引发的功能障碍之间的相互作用。目前，科学界还在持续开展针对线粒体基因组重塑的研究，旨在未来将其发展为人类线粒体疾病的治疗策略 通过 一种称为异质性偏移的方法。该研究领域主要涉及将突变特异性的核酸酶靶向至线粒体基质，从而优先降解致病性线粒体DNA，进而实现表型的挽救10,11,12,13任何涉及线粒体基因型重塑的实验都需要一种可靠的定量方法来评估异质性水平的变化。
用于对线粒体DNA（mtDNA）进行基因分型的方法多种多样，这些方法因突变的性质而异。在定量mtDNA中的单核苷酸多态性（SNPs）方面，新一代测序（NGS）技术更为精确；然而，对于线粒体异质性的常规定量而言，这些方法的成本仍然过高，特别是当样本数量较少时。Sanger测序也可用于检测SNPs；但该方法不具备定量能力，通常难以检测到低水平的异质性，或在估计高水平异质性时可能不准确。焦磷酸测序作为一种样品前处理简单、可快速定量任意mtDNA样本异质性的检测方法，被认为是介于上述两种方法之间的一种理想折中方案。该方法已被众多研究人员在多种情境下常规用于线粒体SNP的定量，包括法医学分析14,15、临床诊断16以及单细胞mtDNA的基因分型17。
该检测首先对线粒体DNA（mtDNA）中SNP侧翼区域进行一轮PCR预扩增，随后利用预扩增产物的一条链进行合成测序（sequencing-by-synthesis）分析。在预扩增步骤中使用的两条引物之一必须在5'端进行生物素标记，以便焦磷酸测序仪能够捕获单链DNA作为测序反应的模板。然后，第三条测序引物退火至保留的生物素化链上，使脱氧核苷酸按预定顺序依次加入反应室，启动新生DNA链的合成。焦磷酸测序仪通过发光信号记录每种碱基的掺入量，从而在DNA合成过程中实现突变型与野生型线粒体等位基因的相对定量（图1B）。发光信号由荧光素酶催化产生，该酶在ATP存在时发光；而ATP由ATP硫酸化酶在每次核苷酸掺入事件中，利用所释放的焦磷酸从头合成（de novo）。这两个反应可概括如下：
1. PPi（来自核苷酸掺入）+ APS → ATP + 硫酸盐（ATP硫酸化酶）
2. ATP + 荧光素 + O2 → AMP + PPi + 氧化荧光素 + CO2 + 光（荧光素酶）
在第二步反应中，如何通过焦磷酸测序仪检测腺嘌呤碱基，同时避免ATP与荧光素酶发生交叉反应，是一项挑战。然而，该问题可通过使用一种用于DNA合成的腺嘌呤类似物dATPαS来解决。尽管dATPαS并非荧光素酶的完美底物，但其产生的发光信号强度仍明显强于其他三种核苷酸，焦磷酸测序仪可对该信号进行数字化校正，并将其设定为0.9的校正因子。由于这种固有的信号差异性，建议避免将腺嘌呤设置在SNP位点进行测序（详见讨论部分的进一步说明）。
以下方案详细介绍了通过焦磷酸测序评估线粒体DNA异质性的方法，并概述了在设计扩增引物时为避免对线粒体DNA中的SNP进行基因分型时产生生物学或技术偏差所必需的注意事项。该过程包括对引物组合进行数字化筛选与选择、优化预扩增PCR，最后进行测序并完善检测方法。文中展示了两个实际应用示例：首先，优化最常见的人类致病性变异m.3243A&#62;G18的检测；其次，对经剑桥大学Minczuk实验室开发的技术诱导发生异质性偏移的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行基因分型10,11,12,19,20,21,22。

<table><tbody><tr><td>KOD Hot Start DNA聚合酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71086</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark 引物设计&amp;nbsp;2.0</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyromark Q48 吸光条&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>974912</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q48 Advanced CpG 试剂（4 x 48）</td><td>QIAGEN</td><td>974022</td><td></td></tr><tr><td>Pyromark Q48 Autoprep&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>9002470</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q48 羧酸酯酶试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>9024321</td><td></td></tr><tr><td>Pyromark Q48 磁盘</td><td>QIAGEN</td><td>974901</td><td></td></tr><tr><td>Pyromark Q48 磁珠&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>974203</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q48 软件许可（1）</td><td>QIAGEN</td><td>9024325</td><td></td></tr></tbody></table>

通过焦磷酸测序对线粒体基因组中的单核苷酸多态性进行基因分型

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

线粒体基因组（mtDNA）的突变与母系遗传的遗传性疾病相关。然而，近年来人们对mtDNA多态性的兴趣日益增加，这得益于新近发展的通过mtDNA诱变构建模型的能力，以及对线粒体遗传异常与常见年龄相关疾病（如癌症、糖尿病和痴呆）之间关联的深入认识。焦磷酸测序是一种基于合成的测序技术，目前在线粒体研究领域被广泛用于常规基因分型实验。与大规模并行测序方法相比，该技术成本相对较低且易于实施，因此在线粒体遗传学领域具有重要价值，能够快速定量异质性，并具有更高的灵活性。尽管该方法具有实用性，但将其用于mtDNA基因分型时，必须遵循特定的指导原则，以避免来自生物学或技术层面的某些偏差。本实验方案详细阐述了设计和实施焦磷酸测序分析所必需的步骤与注意事项，适用于异质性水平的测定。

本部分展示了针对人类致病性线粒体DNA突变的焦磷酸测序检测方法的优化示例，以及对经线粒体锌指核酸酶（mtZFNs）处理的异质性（m.5024C&gt;T）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行基因分型所获得的测序数据。通过优化适用于人类细胞的检测方法并比较两种不同的检测方案，说明了如何选择最准确的检测方法；而在第二个示例中，对基因修饰的MEF细胞进行基因分型，则展示了在基因治疗干预后检测异质性水平变化的应用实例。
人类 m.3243A&gt;G 突变 
本示例说明了线粒体DNA常见致病性变异 m.3243A&gt;G 的基因分型方法。常见的 m.3243A&gt;G 突变是多种临床疾病的致病基础，尤其是线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和卒中样发作（MELAS）、母系遗传性耳聋和糖尿病（MIDD），以及进行性眼外肌麻痹（PEO）23。通过重新编程所掺入核苷酸的序列（如本方案第3.1.3节所述），该检测方法也可用于对较为罕见的 m.3243A&gt;T 变异进行基因分型24<...

焦磷酸测序分析可实现对异质性细胞或组织中线粒体DNA单核苷酸多态性的稳健且快速的基因分型。

线粒体基因组（mtDNA）的突变已被证实与母系遗传的遗传性疾病相关。然而，人们对mtDNA多态性的研究兴趣……

焦磷酸测序是一种基于合成的测序技术，可用于对线粒体DNA中的单核苷酸多态性进行基因分型。与其他测序方法相比，该方法具有操作简便和成本效益高的优势。通过测定线粒体DNA中致病性变异的异质性水平，该技术可便捷地用于某些线粒体疾病的诊断。首先，获取待基因分型物种的线粒体DNA序列文件，并确定单核苷酸多态性（SNP）的位置。确保所使用的参考序列对所研究的突变采用正确的碱基编号，以便于准确识别SNP位点。复制SNP位点上下游各1,000个碱基对的序列，将截短后的序列粘贴至焦磷酸测序引物设计软件中。高亮显示多态性碱基，右键单击该碱基，然后选择“设置目标区域”，以将待分析的SNP碱基设定为焦磷酸测序实验的目标区域。点击界面右上角的播放图标，启动引物筛选程序，等待软件自动设计引物三联组：其中两条用于模板DNA的预扩增，第三条用于在焦磷酸测序仪中进行合成测序。右键单击并选择“复制所有引物组合”，以保存全部引物组合。打开焦磷酸测序仪配套的运行软件，选择“新建检测”，然后选择等位基因定量检测模板。在相应输入框中输入待分析序列，即直接位于测序引物下游的核苷酸序列。对于可变位点，用斜杠分隔表示两种可能的碱基。按下“生成分配指令”，让软件自动确定在合成测序反应中核苷酸分配的合适顺序。保存并为该检测提供一个名称。接下来，将待分析的DNA稀释至每微升5纳克，以启动运行。在第一次运行时，务必包含已知异质性的样本作为参考以及野生型样本。然后使用扩增引物和参数对5微升稀释后的DNA进行25微升反应体系的预测序PCR。要运行文件设置，请在焦磷酸测序仪软件中选择“New Run”。焦测序仪可同时对48个独立的预扩增反应进行测序，焦测序盘上的每个空方格代表一个测序孔。通过右键单击方格并选择“加载检测”来加载检测项目。如有需要，可使用不同的测序引物对最多四个独立的检测项目进行测序。将引物分配模式设置为自动，以便为运行中使用的所有测序引物自动分配注射室。除非在一张测序盘上同时运行四种不同类型的检测，则将运行模式设为标准模式。确保运行模板文件中的检测数量与正在扩增的PCR反应数量一致。然后将运行文件保存到U盘。为启动焦磷酸测序仪，按下设备主触摸屏上的清洗按钮，并根据屏幕提示使用高纯度水清洗所有注射器。将吸收条插入仪器时，确保其两端在9点钟位置对接。插入U盘后，按下“Sequence”按钮以加载先前准备好的运行文件。根据设备上的提示，将所需试剂加载并预灌注到仪器对应的注射器中。向孔中加入3微升微珠，然后将每份需要测序的PCR反应产物各10微升加入对应的样品孔中。用移液器反复吹打以充分混合样本与磁珠。观察已预热的焦磷酸测序仪，确认出现可加载圆盘的提示。拧开固定板的螺母，将装有样本的样品板与圆盘仓内的金属定位销对齐后放入。将反应板牢固地旋入反应板仓后，通过触摸屏界面上的启动按钮开始测序运行。运行完成后，从仪器中取出USB驱动器，并将其重新插入运行焦磷酸测序软件的计算机。当新生成的运行文件出现在USB驱动器上后，双击“运行结果”文件。该系统在核苷酸掺入后自动分析每个孔的荧光素酶信号输出，并定量目标线粒体等位基因。请根据测序读长的质量，查看软件显示的颜色评分。为保存结果，请在顶部窗口选择“报告”（Reports），然后选择“完整报告”（Full Report），以生成包含本次运行中每个孔的焦磷酸测序图谱和结果的 PDF 文件。或者，在“报告”选项卡下以其他格式下载结果。本图显示了使用针对 m.3243A>G 突变所选两组扩增引物进行 PCR 扩增后，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。此处，Het 表示待分析的接近同质性的 m.3243A>G 样本。该图展示了使用摩尔标准品进行校准的两组引物性能比较。测量值用垂直的虚线表示。图中显示了 X=Y 的线性函数，用于说明两种被测分析方法各自接近理想测量值的程度。X 轴上的细胞系名称为此分析方法所检测的不同胞质杂交克隆的名称。此处展示了使用两种检测方法对四个未知 m.3243A>G 异质性的胞质杂交克隆进行基因分型的结果。测序实验在技术上重复了三次。此处展示了经线粒体锌指核酸酶处理的细胞、未经处理的对照细胞以及模拟处理对照细胞的基因分型结果，以及用于生成这些结果的两个MEF细胞样本PCR重复实验的焦磷酸测序图谱，同时还包括野生型基因分型对照。焦磷酸测序可作为基因治疗实验的一种检测手段，用于评估针对线粒体DNA的各种基因治疗技术。

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一个 体外 研究线粒体功能障碍的方法：一种胞质杂交模型

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