Name: 秀丽隐杆线虫种系内突触复合体的超分辨率显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 了解超分辨率显微镜技术用于研究秀丽隐杆线虫种系内突触复合体的详细方法。该技术可实现30纳米分辨率的蛋白质定位成像，为减数分裂过程中的染色体配对与重组机制研究提供重要工具。

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我们感谢 Jonas Ries 及 Ries 实验室分享用于 SMLM 成像的成像缓冲液。我们还感谢 Yumi Kim 提供本实验方案中使用的 C. elegans 菌株，以及 Abby F. Dernburg 提供的鸡抗 HTP-3 抗体。我们感谢欧洲分子生物学实验室（EMBL）海德堡分部先进光学显微镜平台的 Marko Lampe 和 Stefan Terjung 在使用 Olympus iXplore SPIN SR 共聚焦显微镜过程中提供的技术支持。本研究工作得到了欧洲分子生物学实验室和德国研究基金会（DFG，德国研究基金会 - 452616889，SK）的资助。我们感谢欧洲分子生物学实验室成像中心（EMBL IC）提供的访问权限与技术服务，该中心得到了勃林格殷格翰基金会的慷慨支持。

1. 溶液和盖玻片的准备
注意：有关本实验方案中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参见材料表；溶液的组成请参见表1。
<ol>
	<li>聚-L-赖氨酸包被的盖玻片
	<ol>
		<li>配制0.01% (w/v) 聚-L-赖氨酸溶液（见表1）。</li>
		<li>将一片精密盖玻片（直径24 mm；厚度0.17 ± 0.005 mm，No. 1.5）在乙醇中清洗10–30分钟。用ddH2O冲洗盖玻片以去除乙醇，并在室温下晾干。</li>
		<li>使用等离子清洗仪对盖玻片进行等离子清洗。 
		注意：等离子清洗可提高盖玻片的亲水性，有助于后续步骤。若无等离子清洗仪，可省略此步骤，但可能需要调整聚-L-赖氨酸溶液的体积和/或浓度。该修改方案尚未经过测试。</li>
		<li>在盖玻片上滴加一滴（120 µL）0.01% (w/v) 聚-L-赖氨酸溶液，在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>孵育后，用ddH2O冲洗盖玻片，并在室温下干燥。于4 °C保存，最长可保存1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与荧光有机染料偶联的F(ab')2片段
	<ol>
		<li>按以下顺序向PCR管中加入试剂：10 µL浓度为0.6–0.7 mg/mL的F(ab')2片段PBS溶液、1 µL 0.1 M NaHCO3（pH 8.3）和1 µL 1 mM DMSO中的琥珀酰亚胺基（NHS）酯活性荧光染料（F(ab')2与染料的摩尔比约为1:17）。通过反复吹打充分混匀。</li>
		<li>在室温下孵育1小时。</li>
		<li>按照制造商说明，使用脱盐柱（7K MWCO）将F(ab')2片段与未反应的游离染料分离。用1× PBS平衡层析柱并洗脱标记后的F(ab')2片段。</li>
		<li>将标记后的F(ab')2片段在4 °C保存，最长可保存3个月。 
		注意：超过3个月的保存时间尚未经过测试。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 解剖与固定
注意：解剖和固定步骤是在先前推荐方案16,40的基础上进行改进的，以获得适用于超分辨率显微镜观察的最佳样品。
<ol>
	<li>解剖
	<ol>
		<li>将年龄匹配的 C. elegans 线虫（本研究中在 20 °C 下培养）挑入盖玻片（22 mm × 22 mm，No. 1）上的 30 µL EBTT 液滴中（1× 卵缓冲液41 含 0.2% 非离子去污剂，表 1）。将盖玻片置于载玻片上以便操作。用 30 µL EBTT 上下吹打数次进行清洗。吸除 30 µL 溶液，使盖玻片上保留 30 µL 液滴。 
		注意：所有用于转移线虫的溶液中必须添加少量非离子去污剂，以防止线虫黏附于塑料吸头。</li>
		<li>使用手术刀片切掉线虫的头部和/或尾部，以挤出性腺（图 2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定
	<ol>
		<li>向含有解剖后线虫的液滴中加入 30 µL 固定液（表 1），上下吹打混匀。 
		注意：上下吹打数次有助于释放更多性腺。</li>
		<li>加入固定液后，精确固定 1 分钟。</li>
		<li>将线虫转移至装有 TBST（表 1）的 PCR 管中以终止固定反应。转移时尽量减少液体体积（约 15 µL）。</li>
		<li>在小型台式离心机上离心 PCR 管（2,000 × g，10 秒）。弃上清，每次用 200 µL TBST 洗涤，共洗涤 2 次。</li>
		<li>用 200 µL PBST（表 1）洗涤 5–10 分钟。在保持解剖样品置于冰上的同时，重复步骤 2.1.1 至 2.2.5，最多处理四个样品。 
		注意：若处理超过四个样品，每完成四个样品后应立即进行步骤 2.2.6 至 2.2.7&#160;，以确保所有样品的固定条件一致。</li>
		<li>将解剖后的样品在小型台式离心机上离心（2,000 × g，10 秒），弃去 PBST，并加入 50–100 µL 冷甲醇（-20 °C）。 
		警告：甲醇有毒。请佩戴防护装备，避免吸入。</li>
		<li>上下吹打混匀，使样品在甲醇中放置 30–60 秒。用 200 µL PBST 洗涤 2 次。 
		注意：若处理超过四个样品，可继续对剩余样品进行解剖（步骤 2.1.1 至 2.2.7）。</li>
		<li>用 200 µL PBST 进行第三次洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 抗体孵育
<ol>
	<li>封闭
	<ol>
		<li>在1×封闭液（表1）中于室温下封闭样品45–60分钟。 
		注意：孵育时间可从室温30分钟至4 °C下数天不等（测试最长至3天）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗溶液
	<ol>
		<li>将抗HTP-3（鸡源42）和抗HA（小鼠源）抗体（或所选抗体）用1×封闭液稀释至工作浓度（SMLM样品为1:250，STED显微镜样品为1:1,000）。 
		注意：用于标记SMLM样品的抗体浓度高于STED样品，因为SMLM显微镜推荐更高的标记密度。</li>
		<li>将样品在小型台式离心机上离心（2,000 × g，10秒），弃去封闭缓冲液，加入30–50 µL一抗溶液。于4 °C孵育过夜（推荐）或室温孵育1–2小时。</li>
		<li>孵育后，用PBST洗涤3次，每次5–15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光染料标记的F(ab')2片段工作液
	<ol>
		<li>将标记的F(ab')2片段（步骤1.2.4）用1×封闭液稀释至工作浓度（SMLM样品为1:100，STED显微镜样品为1:1,000）。 
		注意：对于两种超分辨率成像技术，均采用先前报道的荧光染料组合，即SMLM使用AlexaFluor647/CF680，STED使用AlexaFluor594/Abberior STAR635P&#160;。AlexaFluor647和STAR645P用于标记抗小鼠(Fab')2片段以靶向SYP-5的C末端，CF680/AlexaFluor594标记的抗鸡(Fab')2片段用于靶向HTP-3。</li>
		<li>将样品在小型台式离心机上离心（2,000 × g，10秒），弃去PBST，加入30–50 µL二抗溶液。室温孵育30分钟至2小时（推荐）或4 °C过夜。用PBST洗涤3次，每次5–15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将样品固定在盖玻片上
<ol>
	<li>后固定 
	注意：将样品逐个进行步骤 4.1.1–4.2.1 的处理。
	<ol>
		<li>离心染色后的样品并弃去上清液。加入 50 µL PBST0.2，并将染色的线虫转移至 22 mm × 22 mm 的 1 号盖玻片上。 
		注意：此步骤应使用新鲜配制的含 0.2% 非离子去垢剂的 PBST0.2（表 1），以防止线虫黏附于盖玻片。</li>
		<li>用移液器将 5.7–6.3 µL 后固定液滴加至多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上。 
		注意：储存于 4 °C 的多聚-L-赖氨酸盖玻片应先恢复至室温。</li>
		<li>用移液器将解剖后的线虫以相同体积（5.7–6.3 µL）转移至多聚-L-赖氨酸盖玻片上的固定液液滴中（图 2B）。 
		注意：在此步骤及后续步骤中，必须确保解剖组织位于多聚-L-赖氨酸包被盖玻片的中央。若需将样品安装于定制样品架以适配本实验所用的定制单分子定位显微镜（见步骤 5.1，图 2B），此点尤为重要。</li>
		<li>用一小块盖玻片（直径 12 mm，图 2B）覆盖样品。用一小片滤纸吸除多余液体（图 2B）。在避光环境中固定 3–5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>&#34;冷冻裂解&#34;
	<ol>
		<li>将样品置于干冰上的铝块上进行冷冻（图 2B）。 
		注意：在放置样品前，铝块必须在干冰中充分预冷。同时可继续对剩余样品进行后固定处理（步骤 4.1.1 至 4.2.1）。样品需在干冰上冷冻至少 20 分钟，最长可达 1 小时，方可进行下一步（4.2.2）。</li>
		<li>使用刀片移除小盖玻片（图 2B）。 
		注意：如进行 STED 成像，请进入步骤 5.2.1；如进行 SMLM 成像，请继续步骤 4.2.3。</li>
		<li>将盖玻片浸入装有预冷 PBS（推荐）或 –20 °C 甲醇的 50 mL 锥形管中，约 10 秒。 
		注意：此步骤中温度极为关键，因此应使用新鲜解冻或置于冰/乙醇浴中保存的 PBS。</li>
		<li>将盖玻片放入六孔板的孔中，孔内已加入 PBST 缓冲液。吸除孔中的 PBST，加入新鲜 PBS。将样品在 PBS 中静置 5 分钟。 
		注意：应将 PBS 沿孔壁缓慢加入，避免直接冲击样品，以防损伤或脱落。</li>
		<li>用新鲜 PBS 洗涤，并将样品置于 4 °C 保存直至成像。 
		注意：样品在 2 周内保持稳定，但最佳成像效果通常在样品制备后 2 天内获得。</li>
		<li>成像前，使用体视显微镜评估样品安装质量。 
		注意：成功安装的生殖腺应牢固附着于盖玻片，无明显相对移动；附着不良的生殖腺会在缓冲液中摆动。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 成像
<ol>
	<li>单分子定位显微镜 
	注意：图像在EMBL成像中心使用一台定制的单分子定位显微镜采集，该显微镜基于定制的主体构建，如先前报道38,43，其独特特性详见材料表；参见&#160;https://www.embl.org/about/info/imaging-centre
	<ol>
		<li>获取三维微珠校准数据
		<ol>
			<li>按照先前描述的方法38,44，准备一张带有附着的100 nm荧光微珠的精密盖玻片（直径24 mm；厚度0.17 ± 0.005 mm，No. 1.5）。</li>
			<li>将步骤5.1.1.1中的校准样品放置于样品 holder 上。</li>
			<li>在洁净的100倍/1.5油镜上滴加一滴浸油，并将校准样品安装到显微镜上。</li>
			<li>在MicroManager 245,46中，指定校准样品上的15–20个位置。</li>
			<li>在EMU插件窗口47中，为步骤5.1.1.5中的每个位置设置采集z-堆栈图像。 
			注意：此处使用复合柱面透镜产生三维成像所需的像散，每个位置采集201个z-切片，覆盖-1 µm至1 µm范围，步长为10 nm。每个z-切片使用2 kW/cm2的640 nm激光照射25 ms。</li>
			<li>通过与步骤5.1.11中采集样品图像时相同的光路，采集100 nm荧光微珠的z-堆栈图像。</li>
			<li>使用超分辨率显微镜分析平台（SMAP48），生成实验点扩散函数（PSF）的cspline模型，该模型将用于步骤5.1.13中拟合3D-SMLM数据。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备样品 holder。对于此处使用的、通过磁环构建成像腔室的定制 holder（图2B），用Parafilm包裹磁环。 
		注意：也可使用带有凹陷腔的载玻片，用于在具有载玻片 holder 的显微镜上安装样品。</li>
		<li>制备1 mL成像缓冲液44（表1）。</li>
		<li>取步骤4.2.6中的一张盖玻片，放入自制的 holder 中。用包裹了Parafilm的磁环（步骤5.1.2）将盖玻片固定在 holder 上。</li>
		<li>用移液器小心地将成像缓冲液（步骤5.1.3）加入由磁环在样品上方形成的腔室中（图2B）。用一片Parafilm密封腔室。</li>
		<li>为安装样品，在洁净的100倍/1.5油镜上滴加一滴浸油。在不引入任何气泡的情况下，将装有样品的 holder（步骤5.1.5）轻轻放置于显微镜载物台上。 
		注意：在将样品置于显微镜前，用纸巾和70%乙醇清洁盖玻片底部。</li>
		<li>在MicroManager 245,46的EMU插件窗口47中，移动压电载物台，直至在四象限光电二极管（QPD）上检测到聚焦锁定激光的信号。 
		注意：为在整个成像过程中保持固定焦距，通过近红外光纤耦合激光在盖玻片上的全内反射实现聚焦锁定，并在四象限光电二极管（QPD）上进行高度敏感检测。QPD信号提供物镜压电支架的闭环控制。</li>
		<li>使用640 nm激发激光以低功率（即1–5%）采集后焦平面图像，以确认浸油中无气泡。 
		注意：若检测到气泡，需将样品从载物台上取下，清洁盖玻片底部和物镜，并重复步骤5.1.6–5.1.8。否则，继续在EMU软件47中锁定焦距。</li>
		<li>使用明场照明定位性腺组织。使用低强度640 nm照明，聚焦于含有大量联会复合体（SC）延伸区域的组织部分。 
		注意：不要聚焦于距离盖玻片超过2 µm的结构。不要使用更高激光功率定位样品，以免过早使部分荧光分子进入闪烁状态。此处使用1 kW/cm2的激光，以“上升”模式运行，脉冲设置为1,000。</li>
		<li>随后以高辐照度（27 kW/cm2）的640 nm照明照射样品约30秒，直至达到适当的闪烁速率（补充视频1）。</li>
		<li>使用MicroManager 245,46中的多维采集工具，以20 ms曝光时间采集200,000帧图像。</li>
		<li>同时，在EMU插件38,47的激活选项中设置紫外光激活，以维持所需的闪烁速率。 
		注意：使用3 kW/cm2辐照度的紫外激光，以“上升”模式运行，最大脉冲长度设置为10,000。</li>
		<li>执行SMLM图像重建与后处理。 
		注意：为从原始SMLM数据重建图像，请参考已发表的方法。本文所展示的数据使用SMAP48,49软件处理。在SMAP48软件中完成了超分辨图像重建、通道分配、漂移校正、对定位精度差的定位点进行滤除以及最大似然滤波。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>受激发射损耗显微镜 
	注意：图像在EMBL成像中心（https://www.embl.org/about/info/imaging-centre）的集成式STED显微系统上采集，该系统配备白光激光器、775 nm脉冲STED激光器以及FALCON Fluorescence Lifetime IMaging模块（材料表）。
	<ol>
		<li>在载玻片上滴加20 µL封片介质（材料表）。取步骤4.2.2中的一张盖玻片，将样品面朝下轻轻置于载玻片的封片介质上（图2B）。 
		注意：避免在封片介质中引入气泡。</li>
		<li>让封片介质过夜固化。 
		注意：可在次日进行成像，或在4 °C保存至成像前。</li>
		<li>为安装样品，在步骤5.2.2所得样品的盖玻片上滴加一滴浸油。使用100倍/1.40油镜，将样品轻轻放置于显微镜载物台上。</li>
		<li>对样品进行聚焦，并使用明场照明定位生殖系组织。</li>
		<li>使用显微镜软件，指定将要采集TauSTED图像的兴趣区域。</li>
		<li>选择用于激发样品中荧光分子的激发激光及其适当功率。 
		注意：此处使用580 nm激光（4%功率）成像AlexaFluor 594标记的F(ab')2二抗片段，使用635 nm激光（3%功率）成像STAR 635P标记的F(ab')2片段。</li>
		<li>使用显微镜软件，选择适当的STED耗尽激光功率并设置图像检测参数。 
		注意：此处775 nm STED耗尽激光功率设置为40%。探测器以计数模式运行，增益值设为10用于光子检测，扫描速率为100 Hz，像素大小为17 nm。TauSTED采集采用四线累积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

联会复合体（SC）的梯状结构对于同源染色体的正确重组和分离至关重要，这一结构最早于近70年前通过电子显微镜观察到3,4。尽管联会复合体的整体结构可通过电子显微镜清晰分辨，但要定位其内部各个组分则需要更为精确的方法。由于联会复合体宽度仅为约100 nm，其亚结构无法通过常规荧光显微镜分辨。然而，超分辨率显微镜已成为揭示联会复合体结构与功能新发现的重要推动力16,19,24,25,26,27,28,29,30。为了促进相关研究，我们展示了一种封片方法，可利用SMLM和STED显微镜对C. elegans性腺组织中的联会复合体结构进行研究。
优化SMLM成像分辨率的一个关键步骤是将生殖系组织直接共价交联到聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上（步骤4）。将组织共价固定在盖玻片上对于减少样品内部的移动至关重要，否则会导致显著的漂移，从而使SMLM无法进行长时间成像。此外，即使固定效果欠佳，导致含有联会复合体（SCs）的细胞核与盖玻片之间存在一定距离，也会因球面像差而显著降低可实现的分辨率（图4）。除本方案中使用的共价固定方法外，染色后的生殖系组织也可通过将样品置于两片密封盖玻片之间、并加入少量成像缓冲液的方式进行固定19,30。然而，该固定方法会将样品中成像缓冲液的体积从本优化方案所用的1 mL大幅减少至仅几 µL，从而导致成像缓冲液酸化，并显著缩短样品可成像的时间38,53,54。
SMLM 和 STED 显微镜的长时间采集限制了这些方法仅能用于化学固定样本的成像。此处，多聚甲醛固定可确保在样品制备和成像过程中保持联会复合体（SC）的结构。然而，尽管已采取措施在完整组织内对 SC 进行成像，固定后所获得的 SC 结构并不一定与活体生物体内天然状态下的结构完全相同。此外，由于固定样本中 SC 的单幅图像仅代表一个单一状态 &#34;快照&#34; 由于该方法无法揭示天然结构的动态变化，因此对生物结构的动力学过程仍然不敏感 体内.
然而，通过获取多个&#34;快照&#34;而非仅单个图像，也可以获得关于大分子结构动态变化和变异性的信息。尽管这种方法能够解析粗线期期间突触复合体（SC）结构的变化19，但使用本方案制备的单个样品存在多个因素，限制了可获取图像的数量。首先，图像采集过程中使用的高激光功率会导致荧光染料发生永久性漂白，从而无法对相邻的兴趣区域或多个z平面进行成像，显著减少了从单个样品中可获取的图像数量。其次，本方法在盖玻片上制备的样品/组织密度较低，这极大地限制了从单个盖玻片上可获取的图像数量。较低的样品密度还阻碍了自动化图像采集流程的应用，而此类流程已在其他生物学问题的研究中发挥了重要作用34,55,56,57,58,59。然而，经验丰富的操作者可略微提高样品密度。
本文所述方案经过优化，可实现高标记密度，这对于在单分子定位显微镜（SMLM）中获得最佳分辨率至关重要35。以往的方案在免疫染色前即将组织共价固定于盖玻片上16，而本新方案则在样品于溶液中完成染色后，再将组织交联至盖玻片。这一改进使得免疫标记所用抗体可从各个方向自由进入组织；若将组织提前共价固定于盖玻片，则可能阻碍抗体接近紧邻盖玻片的细胞核，从而降低标记程度。综上所述，本方案所作的改进使分辨率由40–50 nm（FRC分辨率）16提升至30–40 nm（本方案）。
重要的是，尽管高标记密度和高浓度的抗体对于单分子定位显微镜（SMLM）至关重要，但我们发现使用较低浓度的抗体可以获得更优的受激辐射损耗显微镜（STED）成像效果（步骤3）。在数十纳米分辨率下，用于标记目标蛋白的分子尺寸变得愈发重要。因此，我们采用了大小仅为全长抗体一半的F(ab')2片段。由于信号源更小，局部对比度得到提升，从而在分辨率上优于使用全长二抗的方法；这一改进使得通过TauSTED技术能够分辨出SYP-5蛋白在中心区域内的两个C末端，而使用全长抗体的传统STED则无法实现这一分辨能力（16，未展示数据）。我们预期，该优化后的在完整秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖腺中对联会复合体（SC）进行成像的实验方案，将有助于深入探究减数分裂过程中联会复合体结构与功能之间的关系。

在减数分裂过程中将染色体数目减半，对于有性生殖生物产生健康的后代至关重要。为了实现染色体数目的减半，同源染色体必须在减数第一次分裂期间配对并分离。为了确保同源染色体的准确分离，生殖细胞经历一个延长的前期I，在此期间同源染色体进行配对、联会和重组，从而在同源染色体之间形成物理连接1。联会复合体（SC）已被确认为调控减数分裂前期正确进程的关键核心结构2。
联会复合体（SC）是一种结构上在进化上保守的复杂结构，尽管其蛋白质组分之间的同源性较低。SC最初在电子显微照片中被识别为一种三部分的梯状结构，由两个侧向元件或轴、通过横丝形成的中央区域以及一个中央元件组成3,4。确定各个组分在该复合体内的排列方式，对于深入理解SC在减数分裂前期中的作用至关重要。
模式生物 C. elegans 非常适合用于研究联会复合体（SC）的结构与功能，因为其生殖系中含有大量具有完全组装 SC 的减数分裂细胞核5。遗传学和生物化学研究表明，在 C. elegans 中，染色体轴由三种不同的黏连蛋白复合物6,7 以及四种含有 HORMA 结构域的蛋白质 HTP-1/2/3 和 HIM-37,8,9,10,11 组成。在 SC 的中央区域，迄今已鉴定出六种含有卷曲螺旋结构域的蛋白质12,13,14,15,16,17。为了连接两条染色体轴，SYP-1、-5 和 -6 以头对头的方式形成二聚体（图 1），而另外三种蛋白质则在中央元件中稳定它们之间的相互作用16,17,18,19。
深入了解这些蛋白质的组织结构对于理解联会复合体（SC）在减数分裂过程中的多种功能至关重要。由于联会复合体中央区域的宽度仅为约100 nm，其亚结构无法通过衍射极限的荧光显微镜解析。然而，利用超分辨率显微镜可轻松实现对该尺寸结构内组分的可视化。事实上，结构照明显微镜（SIM）、扩张显微镜20、受激辐射损耗（STED）显微镜21以及单分子定位显微镜（SMLM）22,23 已成为研究跨物种联会复合体分子结构的关键工具16,24,25,26,27,28,29,30。
为了突破分辨率极限，STED显微镜利用STED激光产生的环形光束与发射光的衍射受限光斑重叠，理论上可将点扩散函数压缩至分子尺度31,32。然而，在生物样品中，STED实际可达到的分辨率在xy方向上仍处于几十纳米的范围33。
利用单分子定位显微技术（SMLM），可在生物样品中获得更高的分辨率。SMLM利用特定荧光染料的闪烁特性，通过在时间上分离空间上重叠的荧光分子，实现衍射极限以下的成像。随后对样品进行多次成像，以捕获不同子集的荧光分子。然后通过将点扩散函数（PSF）拟合到所有图像中的信号，确定样品内荧光分子的位置，从而解析出低至15 nm的结构23,34。
综上所述，这些定位图像编码了所有荧光分子的位置信息。单分子定位显微镜（SMLM）的分辨率取决于标记密度以及荧光分子的闪烁特性。根据奈奎斯特-香农采样定理，若物体之间的距离小于平均标记间距的两倍，则无法可靠地区分这些物体。因此，实现高分辨率成像需要较高的标记密度。对于秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的联会复合体（SC），可通过基因组编辑技术将表位标签插入内源蛋白的特定位点，从而实现高密度标记。随后可利用高亲和力的特异性单克隆抗体对这些表位标签进行高密度染色19,30。同时，单个荧光分子的开启周期必须足够短，以确保空间上重叠的荧光分子不会在同一时间被检测到35。
由于这两个要求，解析诸如突触连接复合体（SC）等大型大分子复合物的结构需要成像足够大量的图像，因此可能需要数小时。长时间成像的一个缺陷是样品容易发生漂移，原因包括载物台的移动或样品缓冲液中的微小电流；即使在10 nm量级的微小移动，在纳米级分辨率下也会产生不利影响，必须进行校正。然而，常用的漂移校正方法尚不足以准确地将依次成像的两个通道的图像进行叠加36。这带来问题，因为生物学问题通常要求在同一样品中对多个靶标进行精确定位和检测。为规避这些问题，已发展出诸如比率成像等方法。比率成像允许对激发和发射光谱重叠的多种荧光团进行同时成像，随后根据光谱分离通道中检测信号强度的比值，将每个检测到的信号分配给相应的荧光团37,38。
此外，研究诸如联会复合体（SC）等大分子复合物的结构需要三维（3D）信息。为了实现三维超分辨率成像（3D-SMLM），在发射光的光路中加入了一个柱面透镜，该透镜会根据荧光分子与焦平面之间的距离改变其点扩散函数（PSF）的形状。因此，通过分析荧光分子发射信号的形状，可以推断出其在z轴方向上的精确位置35,39。结合SMLM领域的这些进展，能够对包括联会复合体在内的大分子复合物的三维结构进行成像。

<table><tbody><tr><td>100x/1.5 油镜</td><td>Olympus</td><td>UPLAPO100XOHR</td><td>UPLAPO100XOHR</td></tr><tr><td>2-巯基乙胺（MEA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070-10G</td><td>用 MilliQ 水溶解配制成 5 M 溶液，用 HCl 调节 pH&amp;nbsp;至 8.7。分装为单次使用体积，冷冻并保存于 -80 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>额外的 640 nm 增强激光器</td><td>Toptica</td><td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594，NHS 酯</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A37572</td><td>用 DMSO 溶解配制成 1 mM 溶液，分装为单次使用体积，冷冻并保存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647，NHS 酯</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A37573</td><td>用 DMSO 溶解配制成 1 mM 溶液，分装为单次使用体积，冷冻并保存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>抗 HA 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2-2.2.14</td><td>小鼠单克隆抗体，1:250（SMLM），1:1,000（STED 显微镜）</td></tr><tr><td>抗 HTP-3 抗体</td><td>Abby F. Dernburg 惠赠</td><td>MacQueen et al., 2005</td><td>鸡多克隆抗体，1:250（SMLM），1:1,000（STED 显微镜）</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; 菌株&amp;nbsp; YKM349</td><td>Yumi Kim 惠赠</td><td>Hurlock et al., 2020</td><td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td></tr><tr><td>CF6680，NHS 酯</td><td>Biotium</td><td>92139</td><td>用 DMSO 溶解配制成 1 mM 溶液，分装为单次使用体积，冷冻并保存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>圆形盖玻片 12 mm No. 1</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser; VWR</td><td>631-0713</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片 24 mm No. 1.5</td><td>Carl Roth</td><td>PK26.1</td><td></td></tr><tr><td>柱面透镜</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td><td></td></tr><tr><td>卵缓冲液（10x）</td><td></td><td>Edgar 1995</td><td>250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4</td></tr><tr><td>乙醇（分析纯）</td><td>Merck</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>F(ab&amp;rsquo;)2 片段抗鸡 IgY 抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>AB_2340347</td><td>驴多克隆抗体，1:100（SMLM），1:1,000（STED 显微镜）</td></tr><tr><td>F(ab&amp;rsquo;)2 片段抗小鼠 IgG 抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>AB_2340761</td><td>驴多克隆抗体，1:100（SMLM），1:1,000（STED 显微镜）</td></tr><tr><td>Fisherbrand 显微镜载玻片 T/F 磨砂 0.8-1.0 mm 厚</td><td>Fisher scientific</td><td>7107</td><td></td></tr><tr><td>线虫挑针 30 号直径 0.254 mm - 铱 10%</td><td>Kisker</td><td>789265</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶酶混合物（GlOX/Cat）</td><td>Jonas Ries 惠赠</td><td>Hoess, Mund, Reitberger, &amp;amp; Ries, 2018</td><td>20x，1916 U/mL 葡萄糖氧化酶（Sigma G7141），42350 U/mL 过氧化氢酶（Sigma C3155），&lt;br/&gt; 50 mM Tris-HCl pH 8.0，51% 甘油，MilliQ 水。保存于 -20 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>成像缓冲液基础液</td><td>Jonas Ries 惠赠</td><td>Hoess, Mund, Reitberger, &amp;amp; Ries, 2018</td><td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-葡萄糖。&lt;br/&gt; 分装为单次使用体积（950 &amp;mu;L），冷冻并保存于 -80 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>Invitrogen ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td>该显微镜配备最新一代白光激光器、775 nm 脉冲 STED 激光器、FALCON &lt;strong&gt;F&lt;/strong&gt;luorescence &lt;strong&gt;L&lt;/strong&gt;ifetime &lt;strong&gt;IM&lt;/strong&gt;aging 模块、HC PL APO CS2 100x/1.40 油镜以及 Leica HyD X 检测器。该系统具备 FLIM 模块增强的 Tau-STED 功能，可测量染料的特异性荧光寿命，从而能够基于染料荧光寿命的差异去除背景信号，并区分样品中染料的不同状态。&amp;nbsp; 此外，通过校正耗尽环不同区域荧光寿命的变化，进一步提高了分辨率。</td></tr><tr><td>长波通道发射滤光片</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F47-702</td><td>700/100 nm 带通</td></tr><tr><td>甲醇（分析纯）</td><td>Merck</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>S5761-500G</td><td>100 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, pH 8.3</td></tr><tr><td>近红外光纤耦合激光器</td><td>Toptica</td><td>IBEAM-SMART-PT-CD</td><td>定制设计，808 nm - 75 mW</td></tr><tr><td>物镜压电位移台（PIFOC）</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-726.1.CD</td><td>100 &amp;micro;m 行程范围</td></tr><tr><td>Orca Fusion BT sCMOS 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673283</td><td>0.2 mL</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS 10x）</td><td></td><td>N/A</td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>28906</td><td>将 16% 甲醛从原始玻璃安瓿转移至 1.5 mL 管中，室温保存。</td></tr><tr><td>PlasmaPrep2 等离子清洗仪</td><td>GaLa Instrumente GmbH</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P2636-25MG</td><td>用 Milli-Q 水配制成 0.1% w/v 溶液，分装后于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>主二向色镜（照明反射）</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F73-866S</td><td>四通道带通 @ 405, 488, 561, 640</td></tr><tr><td>四陷波滤光片</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F40-072</td><td>405/488/561/640 nm</td></tr><tr><td>四象限光电二极管（QPD）</td><td>Laser Components</td><td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Apollo Herkenrath Solinger</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>折射光束整形器</td><td>AdlOptica</td><td>PiShaper 6_6_VIS</td><td></td></tr><tr><td>Roche 封闭试剂</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>按推荐方法配制成 10x 溶液。分装后冷冻，保存于 -20 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>手术刀片（Feather 品牌 #11，No. 3）</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1110911</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片废弃盒</td><td>Fisher scientific</td><td>10002-50</td><td></td></tr><tr><td>次级二向色镜（发射反射）</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F38-785S</td><td>750 nm 长通</td></tr><tr><td>短通滤光片</td><td>Semrock</td><td>BSP01-785R-25</td><td>&amp;nbsp;750 nm</td></tr><tr><td>短波通道发射滤光片</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F37-677</td><td>&amp;nbsp;676/37 nm 带通</td></tr><tr><td>单分子定位显微镜</td><td>EMBL 成像中心</td><td>Diekmann et al., 2020（经修改）</td><td>该显微镜通过单模光纤耦合激光引擎、额外的增强激光器和折射光束整形器提供均匀的宽场落射照明（Stehr et al, 2019）。宽场图像由 sCMOS 相机采集，配合适当的中继光学系统，系统放大倍数为 61x，像素大小为 106 nm。&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 为实现光谱重叠的远红染料的比率成像，图像分光器在相机上生成两个光谱不同的图像（分光二向色镜：665 nm 长通，短波通道发射滤光片：676/37 nm 带通，长波通道发射滤光片：700/100 nm 带通。额外的 405/488/561/640 nm 四陷波滤光片和 750 nm 短通滤光片为两条光路共用，提供额外的激光阻挡）。&lt;br/&gt; 复合柱面透镜提供 3D 成像所需的像散。&lt;br/&gt; 为在超过 2 小时（包含 200,000 - 250,000 张图像）的连续采集过程中保持固定焦平面，通过近红外光纤耦合激光在盖玻片上的全内反射，以及四象限光电二极管（QPD）对高度的敏感检测实现焦点锁定。&amp;nbsp; QPD 信号对物镜压电位移台提供闭环控制。&lt;br/&gt; 如需使用该显微镜，请访问 https://www.embl.org/about/info/imaging-centre 或联系 ic-contact@embl.de</td></tr><tr><td>单模光纤耦合多激光引擎</td><td>Toptica</td><td>iCHROME MLE-LFA-HP</td><td>在 405、488、561、640 nm 处提供 100 mW 的宽场落射照明</td></tr><tr><td>分光二向色镜</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F48-665SG</td><td>665 nm 长通</td></tr><tr><td>方形盖玻片 22 x 22 mm No.1</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser; VWR</td><td>630-2882</td><td></td></tr><tr><td>STAR 635P，NHS 酯</td><td>Abberior</td><td>ST635P-0002-1MG</td><td>用 DMSO 溶解配制成 1 mM 溶液，分装为单次使用体积，冷冻并保存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>立体显微镜 Stemi 305 Stand K LAB</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>盐酸四咪唑</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T1512-2G</td><td>用 Milli-Q 水配制成 1%（w/v）溶液。分装后冷冻，保存于 -20 &amp;deg;C。&lt;br/&gt; 解冻后的分装液保存于 4 &amp;deg;C，可使用数月。</td></tr><tr><td>TetraSpeck 微球</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>T7279</td><td>&amp;nbsp;0.1 &amp;micro;m，荧光蓝色/绿色/橙色/深红色</td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐水（TBS 10x）</td><td></td><td>N/A</td><td>200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P9416-50ML</td><td>原包装室温保存。</td></tr><tr><td>WormStuff 线虫挑针</td><td>Kisker</td><td>789277</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 XY 位移台</td><td>&amp;nbsp;Smaract</td><td>N/A</td><td>定制设计</td></tr><tr><td>Zeba 微型离心脱盐柱</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>89877</td><td>&amp;nbsp;7K MWCO, 75 &amp;micro;L</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

在减数分裂过程中，同源染色体必须相互识别并黏附，以确保其正确分离。保障同源染色体相互作用的关键事件之一，是在减数第一次分裂前期联会复合体（synaptonemal complex, SC）的组装。尽管不同物种间SC内蛋白质组分的序列同源性较低，但SC的整体结构在进化过程中高度保守。在电子显微镜图像中，SC呈现为三联的梯状结构，由侧向元件（或轴）、横丝以及中央元件组成。
然而，通过电子显微镜精确定位该复合物内各个组分的位置以确定联会复合体（SC）的分子结构仍具有挑战性。相比之下，荧光显微镜能够识别复合物中的各个蛋白质组分。但由于联会复合体宽度仅约 100 nm，其亚结构无法通过受衍射极限限制的传统荧光显微镜分辨。因此，解析联会复合体的分子结构需要采用超分辨率光学显微技术，例如结构照明显微镜（SIM）、受激发射损耗（STED）显微镜或单分子定位显微镜（SMLM）。
为了维持联会复合体（SC）内各个组分的结构及其相互作用，必须在接近生殖细胞天然环境的条件下观察该复合体。因此，我们展示了一种免疫组织化学与成像方案，可在完整且被挤出的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）生殖系组织中，利用单分子定位显微镜（SMLM）和受激辐射损耗显微镜（STED）研究SC的亚结构。将组织直接固定在盖玻片上，可减少成像过程中样品的移动，最大限度降低样品畸变，从而获得在生物学背景下可视化SC亚结构所需的高分辨率。

为了通过单分子定位显微镜（SMLM）对 C. elegans 生殖系组织中的联会复合体（SC）进行成像，我们采用了双色比率型三维SMLM技术，用于定位染色体轴结构组分HTP-3以及内源性标记了血凝素（HA）标签的横丝组分SYP-5的C末端。此前已有研究确定了这两种蛋白质在 C. elegans 联会复合体内的位置16,30。
为了最大限度地减少厚生物样本中固有的光散射和光学像差，我们对含有联会复合体（SCs）的减数分裂细胞核最底部的z轴层面进行成像（图3，黄色线条）。对于每幅获取的图像，均标记成像平面相对于物镜聚焦于盖玻片时压电载物台的位置，从而可计算出压电载物台距离盖玻片的距离。成功封片的样品应稳定地紧贴盖玻片，并保持性腺的原有形态（即在后固定步骤中组织未被两片盖玻片压碎）。样品封片质量可在体视显微镜下快速评估，因为附着良好的性腺在溶液中不会出现移动（步骤4.2.6）。然而，由于封片过程具有随机性，性腺组织不一定完全平铺在盖玻片上。因此，在同一性腺内，含有联会复合体的细胞核底面相对于盖玻片的距离可能存在差异。
为了说明分辨率如何随组织与盖玻片附着情况的变化而改变，我们在不同压电位移距离下采集了图像。为评估单幅图像的质量，计算了傅里叶环相关（Fourier ring correlation, FRC）曲线50,51，并利用SMAP软件中的FRCResolution插件确定分辨率48。在图4中展示了两个分别来自距离盖玻片不同位置的3D-SMLM图像的代表性细胞核。在靠近盖玻片的性母细胞（SCs）中，染色体轴以及SYP-5::HA的C末端在三个维度上均能被清晰分辨（图4A，距盖玻片0.8 µm）。要分辨相距一定距离的两个结构，所达到的FRC分辨率通常必须小于该距离轴向分辨率的一半。
为了在侧向分离相同结构，需要实现更小的FRC分辨率值。实际上，在靠近盖玻片的样品中，AlexaFluor 647通道的FRC分辨率为38 nm，CF680通道为34 nm，远低于SYP-516 C末端之间预期的84 nm距离。因此，该分辨率不仅可在正面视图中，也可在侧向视图中清晰分辨出联会复合体（SC）的组织结构（图4B i,ii）。相比之下，位于距盖玻片5 µm处的SC由于光散射和球面像差，分辨率有所下降（图4B）。在此距离下，FRC分辨率降至47 nm（AlexaFluor 647）和41 nm（CF680），无法完全分辨SYP-5的C末端。由于光学像差对侧向分辨率的影响比轴向分辨率更为严重，因此在距盖玻片5 µm处的样品中，HTP-3和SYP-5条带在侧向视图的横截面上不再能被清晰分辨（图4B ii）。通过比较在不同压电位移距离下从盖玻片获取图像的FRC分辨率发现，成像组织应位于距盖玻片不超过2 µm的范围内（图5）。该结果凸显了后固定步骤正确执行的重要性，在此步骤中必须成功将组织交联至盖玻片的聚-L-赖氨酸涂层上。
为了展示另一种超分辨率技术所能达到的分辨率，我们还利用TauSTED显微镜对固定且完整的生殖系组织中的联会复合体（SCs）进行了成像。图6A展示了本研究中通过正面观察联会复合体的线轮廓估算出的最高和最低分辨率的TauSTED图像（图6B）。在两个细胞核中，我们均能分辨出染色体轴上HTP-3的两个定位带以及中央区域SYP-5的C末端，表明采用该优化方案进行TauSTED成像时，其分辨率可低于84 nm。在最佳条件下（图6A，上方），我们甚至能够在联会复合体轻微倾斜的视图中分辨出仅相隔50 nm的C末端（图6A，黄色矩形框及6C）。
<img alt="同源染色体结构示意图；横切面、侧面及横断面视图，显示横向纤维。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：联会复合体结构的示意图 秀丽隐杆线虫 卡通图展示了联会复合体（SC）的简化结构 秀丽隐杆线虫 连接两条同源染色体（灰色）。该结构以正面、侧面和横截面视图展示。染色体轴以红色条状表示，而横向纤维以青色表示。横向纤维蛋白（SYP-1, 5, 6 在 秀丽隐杆线虫）在中心区域以头对头方式排列（青色球棍模型），以连接两条轴之间的距离。图中所示为轴之间以及横向纤维C末端之间的预期距离。缩写：SC = 联会复合体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="秀丽隐杆线虫解剖与成像装置；显微镜、抗体、受激辐射损耗显微镜、单分子定位显微镜及载玻片制备" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：本研究中所用样品制备示意图。 (A青年 秀丽隐杆线虫 成年个体在其头部或尾部（绿色虚线处）进行解剖，并按照方案中所述方法进行处理。B) 方法的各个步骤用图形表示，并以灰色箭头连接。缩写：STED = 受激发射损耗；SMLM = 单分子定位显微镜；PBS = 磷酸盐缓冲液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="染色体排列；荧光显微图像；细胞分裂过程中的蛋白质定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：可通过单分子定位显微镜观察的组织切片位置。 整体安装的 C. elegans 性腺的转盘共聚焦图像的最大强度投影（MIP）。该组织经 HTP-3 和 SYP-5 蛋白 C 末端（SYP-5::HA）染色，合并信号以灰色显示。通过使用 Grid/Collection 拼接 Fiji 插件52 将多个单独的共聚焦图像拼接，生成完整的性腺图像。插图显示了包含联会复合体（SCs）的最底层 z 平面的 xy 视图。该平面的位置由性腺 MIP 图像中矩形区域所示的组织切片正交视图标示（黄色线条）。比例尺 = 10 µm。缩写：MIP = 最大强度投影；SCs = 联会复合体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微成像过程；蛋白质标记物示意图；正面与侧面视图；科学分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4单分子定位显微镜观察HTP-3及SYP-5的C末端 (A，B) 左侧：显示粗线期细胞核的SMLM图像，经HTP-3（红色）和SYP-5的C末端（SYP-5::HA，青色）染色（比例尺 = 1 µm). 中心： 感兴趣区域的放大图像，这些区域在图中已标出 A 和 B 对应横截面视图显示在每张图像下方（i, ii；比例尺 = 100 nm）。放大图像中联会复合体（SC）的片段已旋转，使染色体轴与 y-轴 右侧： 图示中心区域放大图中展示的联会复合体（SC）取向，呈现了目标蛋白在SC内的定位情况。缩写：SMLM = 单分子定位显微镜；SC = 联会复合体。用于重建SMLM图像的原始数据可通过BioStudies数据库获取60 （登录号：S-BIAD504） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="FRC 与空间频率关系图，AlexaFluor647 和 CF680，压电距离数据，光谱拟合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：单分子定位显微镜图像的傅里叶环相关分辨率取决于成像 z 平面与盖玻片平面之间的距离。 彩色线条显示在距盖玻片不同距离（如颜色条所示）处获取图像的 FRC 曲线。用于确定 FRC 分辨率的 1/7 阈值由一条黑色水平线表示。插图显示 FRC 分辨率随压电驱动器距盖玻片距离的变化关系。绘图由自定义编写的 R 脚本（版本 4.1.2，补充文件 1）完成，其中使用“ggplot2”软件包中的函数对原始曲线进行平滑处理。缩写：FRC = 傅里叶环相关；SMLM = 单分子定位显微镜；SC = 联会复合体。FRC 曲线数据和 SMLM 数据可通过 BioStudies 数据库60 获取（登录号：S-BIAD504）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像，HTP-3 与 SYP-5:HA 分析，强度分布图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6：基于荧光寿命信息增强的受激发射损耗显微技术（TauSTED）可分辨出 HTP-3 和 SYP-5 C 末端的两个定位条带。（A）两张代表性 TauSTED 图像显示了粗线期细胞核中 HTP-3（红色）和 SYP-5 C 末端（SYP-5::HA，青色）的染色情况，分别具有较高（上图）和较低（下图）的结构分辨率（比例尺 = 1 µm）。矩形框标出了在联会复合体（SC）正面（白色）和略微倾斜（黄色）视角下可分辨的 SYP-5 C 末端区域。（B,C）TauSTED 分辨的 HTP-3（红色）和 SYP-5 C 末端（青色）信号分布。实线表示包含 SC 正面（B）或略微倾斜（C）视图的兴趣区域的线扫描轮廓，强度已归一化至最大值。线扫描轮廓使用 Fiji ImageJ 生成。B 中的虚线表示每种蛋白的平均数据。C 中粗的青色线对应于 SYP-5 C 末端之间分辨距离最短的线扫描轮廓。为确定靶向特定蛋白的抗体之间的距离，使用自编 R 脚本（版本 4.1.2，补充文件 1）对线扫描轮廓（n = 9（B），n = 7（C））进行双高斯拟合。每个图顶部分别标出了平均距离 ± 标准差（B）以及最小值加粗显示的范围（C）。缩写：STED = 受激发射损耗显微技术；SC = 联会复合体。所示图像及线扫描轮廓的数据点可通过 BioStudies 数据库60 获取（登录号：S-BIAD504）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：本实验方案中所用缓冲液和溶液的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充视频1：单分子定位显微镜数据采集。 视频显示荧光分子以适当的速率闪烁（共展示50帧，比例尺 = 5 µm，每帧20 ms）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充文件1：数据分析脚本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

超分辨率显微镜可提供减数分裂中联会复合体内部组分排列的详细信息。在此，我们展示了一种用于解析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）联会复合体各个蛋白质的实验方案。

Caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

在减数分裂过程中，同源染色体必须相互识别并黏附，以确保其正确分离。其中关键事件之一是……

联会复合体是减数分裂的关键组分。为了研究其功能，我们还必须了解其结构，而超分辨率显微镜已被证明在这一方面极为有用。我们优化了实验方案，能够将免疫染色的秀丽隐杆线虫（C. elegans）性腺稳定地附着在盖玻片上，从而在完整组织中将分辨率提高至30纳米。单分子定位显微镜实验的设计、后续分析以及数据的解读可能具有相当大的挑战性，最好与专家共同完成实验方案的制定。本实验操作将由实验室的博士前研究员伊瓦娜·卡夫卡（Ivana Cavka）进行演示。单分子定位显微镜图像的采集过程将由海洋生物实验室成像中心的光学工程师罗里·鲍尔（Rory Power）展示。从NGM琼脂平板上挑选年龄相匹配的秀丽隐杆线虫。将线虫转移至盖玻片上30微升EBTT液滴中。用额外的30微升EBTT洗涤线虫。移除30微升溶液，使盖玻片上留下含有线虫的30微升液滴。使用手术刀片切下线虫的头部和/或尾部，以挤出性腺。在成功的解剖操作中，性腺组织将完全从线虫体内挤出。用移液器将30微升固定液加入解剖后的线虫液滴中。通过移液混匀，并让样品固定1分钟。恰好1分钟后，用20微升移液器将线虫转移至含有TBST的PCR管中，以终止固定。然后使用小型台式离心机对解剖后的样品进行洗涤。去除上清液后，将线虫重悬于 200 µL 新鲜的 TBST 中。最后一次洗涤后，将线虫重悬于 200 µL 的 PBST 中，并将 PCR 管置于冰上。将解剖后的样品在小型台式离心机上离心，并移除上清液。加入50至100 µL预冷的甲醇，用移液器吹打混匀，将样品置于冰上静置30至60秒。用200 µL PBST洗涤样品两次。离心样品并去除上清液后，向样品中加入封闭液，在室温下孵育45至60分钟。用封闭缓冲液将一抗稀释至工作浓度。将样品在小型台式离心机上离心，去除封闭液，然后加入30至50微升一抗溶液。在4°C下孵育过夜。孵育结束后，用PBST洗涤样品三次。用封闭缓冲液将标记的Fab'2片段稀释至工作浓度。第三次洗涤后，离心样品，弃去上清液，加入30至50微升二抗溶液。将样品置于避光容器中，在室温下孵育30分钟至2小时，或在4摄氏度下孵育过夜。随后用PBST洗涤样品三次，每次5至15分钟。将染色后的样品离心并弃去上清液。加入50 µL PBST，将染色的线虫转移至盖玻片上。用移液器吸取5.7至6.3 µL固定后溶液，滴加到多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上。用相同体积的移液器将解剖后的线虫转移至多聚赖氨酸包被的盖玻片上的固定液滴中。用一小块盖玻片覆盖样品。用一小片滤纸吸去多余液体，并在避光环境中固定三至五分钟。将样品置于干冰上的铝块中进行冷冻。至少20分钟后，使用刀片取下较小的盖玻片。将盖玻片浸入含有预冷磷酸盐缓冲液（PBS）或在-20°C下冷藏的甲醇的50毫升锥形管中，约10秒钟。将盖玻片放入盛有PBST缓冲液的六孔板的一个孔中。移除孔中的PBST，加入新鲜PBST，并将样本孵育五分钟。再次用PBST洗涤后，将样本置于四摄氏度保存，直至成像。成像前，在体视显微镜下评估样品固定的质量。若使用此处所示的自制样品 holder，请先用 Parafilm 将磁环包裹，然后准备一毫升成像缓冲液。从六孔板中取出盖玻片。将其放入定制的样品 holder 中，并用包裹了封口膜的磁性环将盖玻片固定在 holder 上。轻轻将成像缓冲液加入由磁性环在样品上方形成的腔室中，然后用封口膜密封腔室。安装样品时，在洁净的油镜物镜上滴加一滴浸油。在不引入任何空气的情况下，将载有样品的样品 holder 轻轻放置在显微镜载物台上。在 MicroManager 2 中使用 EMU 插件窗口，移动压电载物台，直至在四象限光电二极管上检测到聚焦锁定激光的信号。使用 640 纳米激发激光在较低功率下采集后焦平面图像，以确认浸油中无气泡存在。使用明场照明定位性腺组织。采用640纳米波长的低强度照明，聚焦于含有大量联会复合体的组织切片。随后，用640纳米波长的高强度光照照射样品约30秒，直至达到适当的闪烁频率。使用 MicroManager 2 中的多维采集工具，以 20 毫秒的曝光时间采集 200,000 帧图像。同时，利用 EMU 插件的激活选项设置紫外光激活，以维持所需的闪烁速率。通过 HTP-3 和 SYP-5 染色，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）性腺中观察到包含联会复合体的减数分裂细胞核的最底层平面。在靠近盖玻片的联会复合体中，SYP-5 HA 的 C 末端染色体轴在三个维度上均能清晰分辨。然而，当联会复合体距离盖玻片五微米时，由于光散射和球面像差，分辨率下降。在不同压电位移距离下采集的图像显示，成像组织与盖玻片的距离不应超过两微米。该样品制备方案也可用于TauSTED显微镜成像。通过优化的样品制备，可在正面及轻微倾斜视角下清晰分辨染色体轴上的HTP-3以及联会复合体中央区域SYP-5的C末端。为获得最佳分辨率，必须将性腺紧密交联固定于盖玻片上，以确保联会复合体与盖玻片的距离不超过两微米。我们不仅将此方案用于单分子定位显微镜，也用于受激发射损耗显微镜。该方案可能对其他超分辨率显微镜技术也有帮助。

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生物学

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