秀丽隐杆线虫种系内突触复合体的超分辨率显微镜

突触复合体是减数分裂的关键组成部分。为了研究它的功能，我们还必须了解它的结构，超分辨率显微镜已被证明是非常有用的。我们优化了我们的方案，将免疫染色的秀丽隐杆线虫性腺稳定地附着在盖玻片上，这有助于将完整组织中的分辨率提高到30纳米。

单分子定位显微镜实验的设计、后续分析以及数据的解释可能非常具有挑战性，最好与专家一起设置。演示该程序的将是实验室的博士前研究员Ivana Cavka。单分子定位显微镜图像的采集也将由MBL成像中心的光学工程师Rory Power展示。

首先从NGM琼脂平板中挑选年龄匹配的秀丽隐杆线虫。将蠕虫转移到盖玻片上的 30 微升 EBTT 滴中。用额外的30微升EBTT清洗蠕虫。

取出 30 微升溶液，在盖玻片上留下 30 微升滴虫。使用手术刀刀片切断蠕虫的头部和/或尾巴以挤出性腺。在成功的解剖中，性腺组织将完全挤出蠕虫体外。

将30微升固定剂溶液移液到解剖蠕虫的滴中。通过移液混合，让样品固定一分钟。通过使用20微升移液管将蠕虫转移到充满TBST的PCR管上，在一分钟后停止固定。

然后通过在小型台式离心机上旋转解剖的样品来进行洗涤。除去上清液后，将蠕虫重悬于200微升新鲜TBST中。最后一次洗涤后，将蠕虫重悬于200微升PBST中，并将PCR管放在冰上。

在小型台式离心机上旋转解剖的样品并除去上清液。加入50至100微升冷甲醇，通过移液混合，并将样品在甲醇中在冰上放置30至60秒。用200微升PBST洗涤样品两次。

旋转样品并除去上清液后，将封闭溶液加入样品中，并在室温下保持45至60分钟。稀释封闭缓冲液中工作溶液的一抗。在小型台式离心机上旋转样品，除去封闭溶液，然后加入30至50微升一抗溶液。

在四摄氏度下孵育过夜。在孵育结束时，在PBST中洗涤样品三次。将标记的Fab两个片段稀释到封闭缓冲液中的工作溶液中。

第三次洗涤后，将样品旋转下来，除去上清液，然后加入30至50微升二抗溶液。将样品放入暗室中，在室温下孵育30分钟至2小时或在4摄氏度下孵育过夜。然后用PBST洗涤样品三次，持续5至15分钟。

旋转染色样品并除去上清液。加入50微升PBST并将染色的蠕虫转移到盖玻片上。将5.7至6.3微升固定后溶液移液到聚-l-赖氨酸盖玻片上。

以相同的体积移取解剖的蠕虫，并转移到聚-l-赖氨酸盖玻片上的固定剂滴中。用小盖玻片盖住样品。使用一小张滤纸去除多余的液体，并将样品在暗室中固定三到五分钟。

通过将样品放在干冰中的铝块上来冷冻样品。至少 20 分钟后，用剃须刀取下较小的盖玻片。将盖玻片浸入含有冰冷PBS或甲醇的50毫升锥形管中，在零下20摄氏度下冷却约10秒钟。

将盖玻片放入装有PBST缓冲液的六孔板的孔中。从孔中取出PBST，加入新鲜PBST并将样品放置五分钟。再次用PBST洗涤后，将样品保持在4摄氏度直至成像。

成像前，在体视显微镜下评估样品安装的质量。如果使用此处显示的定制样品架，请用封口膜包裹磁环，然后准备一毫升成像缓冲液。从六孔板中取出盖玻片。

将其放在定制的支架中，并用封口膜包裹的磁环将盖玻片固定在支架中。轻轻移液样品顶部磁环产生的腔室中的成像缓冲液，并使用封口膜密封腔室。要安装样品，请将一滴浸油添加到清洁油物镜中。

在不向浸油中引入任何空气的情况下，将装有已安装样品的样品架轻轻地放在显微镜载物台上。使用 MicroManager 2 中的 EMU 插件窗口，移动压电平台，直到在象限光电二极管处检测到来自聚焦锁定激光器的信号。使用640纳米激发的激光以较低功率获取后焦平面图像，以确认浸油中没有气泡。

使用明场照明定位性腺组织。使用640纳米的低强度照明，专注于包含许多突触复合物的组织切片。继续在高辐照度下曝光样品，以640纳米的照明约30秒，直到达到适当的闪烁率。

使用 MicroManager 2 中的多维采集工具采集 200， 000 帧，曝光时间为 20 毫秒。同时，使用 EMU 插件的激活选项设置 UV 激活以保持所需的闪烁率。使用 HTP-3 和 SYP-5 染色在秀丽隐杆线虫性腺导管内可视化含有突触复合物的减数分裂核的最底层平面。

SYP-5 HA的C末端的染色体轴在靠近盖玻片的突触复合物的所有三个维度上都得到了很好的分辨。然而，由于光散射和球面像差，位于距盖玻片5微米处的突触复合物的分辨率会下降。在距盖玻片不同压电距离处获得的图像显示，成像的组织不应距离盖玻片超过两微米。

样品制备方案也可以与TauSTED显微镜一起使用。通过优化样品制备，在正面视图和略微倾斜的视图中解决了染色体轴中的HTP-3和中部区域的SYP-5的C末端。为了获得最佳分辨率，性腺必须与盖玻片紧密交联，以确保突触复合物距离盖玻片不超过两微米。

我们不仅将该协议用于单分子定位显微镜，还用于受激发射损耗显微镜。它也可能对其他超分辨率显微镜技术有用。