荧光RNA适配体 外和细胞 开启动力学的测定
August 9th, 2022
该协议提供了两种确定荧光RNA适配体菠菜2和西兰花动力学的方法。第一种方法描述了如何使用酶标仪 在体外 测量荧光适配体动力学，而第二种方法详细介绍了通过流式细胞术测量细胞中荧光适配体动力学。
研究体外和细胞荧光适配体动力学使用户能够评估适配体染料相互作用是否足够快，可以实时研究感兴趣的过程。所介绍的技术允许在细胞内部和外部进行定量动力学测量，根据适配体的应用，其中任何一种都可能相关。所介绍的方法可应用于任何荧光RNA系统，包括替代适配体和基于RNA的小分子生物传感器。
首先，从热循环仪设置RNA复性程序。通过选择创建新程序创建程序"添加新阶段"并添加新步骤"多次添加特定于温度的步骤，然后按保存"根据程序调整其他设置。要使菠菜二和西兰花RNA变性，请在0.5毫升薄壁PCR管中的双蒸水中制备每种RNA的两微摩尔茎。
然后加入等体积的两倍复性缓冲液，制成一微摩尔RNA溶液。将试管放入热循环仪中。打开保存的复性程序并按运行"接下来，设置酶标仪进样器程序。
在荧光酶标仪上，选择温度"并将其设置为37摄氏度。在开始动力学之前，请确保温度已平衡到此值。打开酶标仪软件。
选择设置"然后采集视图"要输入动力学测量程序，请选择循环"对于每个孔。接下来，将基线设置设置为 60 个基线读数，并将智能注射设置设置为 10 微升注射。将荧光读数激发波长设置为 448 纳米，将发射波长设置为 506 纳米，将墨盒设置为单声道。
将总读取时间设置为 10 分钟，读取间隔为 0.5 秒。将 PMT 和光学元件设置为每次读取六次闪光。然后输入循环到下一个井。
要准备酶标器进样器，请在读板器上选择进样器"，并根据指示提供废物收集板。然后选择"洗涤"并按照酶标仪上的说明用一毫升体积的双蒸水，75%乙醇和蒸馏水清洁注射管。接下来选择吸气"允许注射器喷射多余的液体。
然后选择prime"用两个260微升的100微摩尔D F H B灌注进样器 I.To 进行一次动力学实验，将80微升结合缓冲液预混液加入到96孔透明底板的一个孔中。然后加入10微升变性RNA。让板和进样器中的 D F H B I 溶液平衡至 37 摄氏度 15 分钟。
接下来，在读取区域下的软件设置中选择要分析的孔。然后在主页选项卡下，选择运行"以执行前面描述的动力学程序。重复此过程，直到所有实验完成。
运行后，如前所述，清洗进样器以从注射管中取出剩余的D F H B I溶液。要设置实验文件，请打开流式细胞仪和计算机。在实验资源管理器选项卡中创建一个新文件，方法是右键单击流式细胞仪"用户名。
然后选择"新建实验"在下拉窗口中，当计算机屏幕上弹出一个新窗口时，选择实验类型为试管"然后选择确定"在新实验文件中右键单击组文件夹并选择添加新样品管"标记每个特定时间点的样品管并通过右键单击样品进行复制"并选择重命名"在下拉菜单中。接下来，通过在培养管中的AI培养基中加入1.5毫升1 X P B S和3微升诱导细胞来制备稀释的细胞溶液。在添加染料之前，测量细胞的背景荧光，以观察折叠随时间推移而打开。
加入染料后，将含有P B S细胞的培养管放入样品管升降器中，并将升降器抬高到样品注射针上。然后在收集面板选项卡中选择适当的样品文件并单击记录"运行完成后，用手用培养管降低样品管升降机。启动冲洗步骤，冲洗流体系统，并最大限度地减少每个生物重复样品之间的残留。
要移动到以下样品，请单击记录图标下样品管名称附近的右箭头图标，选择下一个示例文件。要用染料测量细胞的荧光，将1.4微升浓缩染料原液加入一个带有细胞的X P B S中，得到终浓度为50微摩尔D F H B I ONE T.固定培养管盖并倒置三至五次以使溶液均匀混合。接下来，取下盖子并将培养管放入样品管升降器中。
将支架抬高到样品进样针头后，单击正确样品文件下的记录"图标。然后，通过按开始开始定时器"荧光适配体菠菜二和西兰花的体外动力学，显示用于结合D F H B I染料的两相缔合动力学。对于这两种核酸适配体，在较长的测量时间内，两相关联比单相结合的动力学数据拟合得更好。
最佳拟合曲线决定了快速和慢速关联的速率常数和半衰期值。菠菜二处于结合能力状态，显示出比西兰花更快的开启。两种核酸适配体的第二相动力学相似，可能对应于一个共同的限速步骤。
核酸适配体动力学曲线由相似程度的快速结合RNA组成。对于表达菠菜两个T RNA的细胞，平均荧光强度或M F I在零时间点立即增加。此外，细胞荧光在五分钟内达到其最大平衡M F I值。
相比之下，对照细胞显示出低背景荧光，并且在D M S O添加的情况下M F I值没有变化。 所提出的方法使研究人员能够确定如何更快地在荧光适配体中制造基于RNA的传感器。
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概述
本协议概述了两种确定荧光RNA适配体Spinach2和Broccoli动力学的方法。第一种方法利用微板读取器进行体外测量，而第二种方法则采用流式细胞术进行细胞测量。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 分子生物学
背景
- 荧光RNA适配体可用于分子相互作用的实时研究。
- 了解适配体动力学对于其在各种生物过程中的应用至关重要。
- 这些方法可以适用于不同的RNA系统和生物传感器。
- 测量技术包括体外和细胞环境。
研究目的
- 评估RNA适配体的实时动力学。
- 提供适用于各种荧光RNA系统的方法。
- 促进适配体相互作用的定量测量。
使用的方法
- 使用微板读取器进行体外动力学测量。
- 使用流式细胞术进行细胞动力学测量。
- 在热循环仪中设置RNA变性程序。
- 在PCR管中准备RNA样品。
主要结果
- 成功测量了体外和细胞中适配体的动力学。
- 证明了适合实时研究的快速适配体-染料相互作用。
- 方法适用于各种基于RNA的生物传感器。
- 为两种实验设置获得了定量数据。
结论
- 所介绍的方法能够有效研究RNA适配体的动力学。
- 体外和细胞测量都是可行和有信息量的。
- 这些技术可以推进基于RNA的应用研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative determination of fluorogenic RNA aptamer turn-on kinetics is critical for enabling real-time RNA visualization and biosensor applications in live-cell systems. Accurate kinetic profiling ensures that aptamer-dye interactions are sufficiently rapid to support dynamic studies of gene expression and metabolite signaling. This capability directly impacts the predictive confidence and translational value of RNA-based discovery tools across the biopharma pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports interrogation of RNA function and pathway activity in live cells.
- Enables biological de-risking by confirming aptamer responsiveness aligns with experimental timescales.
- Facilitates functional target validation for RNA-based biosensors and reporters.
Screening & Assay Development
- Provides validated kinetic parameters for assay standardization and reproducibility.
- Enables development of high-throughput screening assays for RNA-targeted compounds.
- Delivers quantitative outputs essential for reliable compound evaluation and comparison.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biosensor performance with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of RNA-based tools into preclinical workflows.
- Improves predictive de-risking by quantifying aptamer kinetics in physiologically relevant contexts.
Pipeline & Workflow Integration
These kinetic measurement methods integrate at the interface of early discovery, assay development, and translational research, providing a foundation for robust RNA-based tool deployment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by quantifying real-time RNA dynamics.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility through standardized kinetic benchmarks.
- Analytics: Supplies quantitative fluorescence readouts and kinetic rate constants for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures biosensor kinetics are compatible with preclinical model requirements.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable workflow for diverse fluorogenic RNA systems and biosensors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable kinetic measurement protocols.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and enhances capital efficiency in RNA tool development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-based discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and fluorescence-based kinetic analysis.
- Depends on access to plate readers with injectors and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of kinetic measurement protocols.
- Adaptable to a range of fluorogenic RNA aptamers and biosensor platforms.
- Limited by the diffusion rates and cellular uptake characteristics of specific dyes and cell types.
