Name: 荧光RNA适配体 外和细胞 开启动力学的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 了解荧光RNA适配体Spinach2和Broccoli的体外与细胞内动力学测定方法。本实验方案使用酶标仪和流式细胞术进行实时定量分析，适用于各类RNA生物传感器研究。

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本工作获得了以下基金对 MCH 的资助：NSF-BSF 1815508 和 NIH R01 GM124589。MRM 部分得到了培训基金 NIH T32 GM122740 的支持。

<ol><li>Su, Y., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+small+molecules+and+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs.</a> Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+spinach+array+for+mRNA+Imaging+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells.</a> Scientific Reports. 5, 17295(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+spatial+complementation+of+aptamer-mediated+recognition+enables+live-cell+imaging+of+native+RNA+transcripts+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time.</a> Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).</li>
<li>Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+superfolding+Spinach2+reveals+the+dynamic+nature+of+trinucleotide+repeat-containing+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA.</a> Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).</li>
<li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).</li>
<li>Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+second+messengers+cyclic+di-GMP+and+cyclic+AMP-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).</li>
<li>Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidine+biosensors+enable+comparison+of+cellular+turn-on+kinetics+of+riboswitch-based+biosensor+and+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).</li>
<li>Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+fluorescent+biosensor+for+high-throughput+analysis+of+the+cGAS-cGAMP-STING+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).</li>
<li>Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+RNA-based+fluorescent+biosensors+enable+anaerobic+detection+of+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 139(2016).</li>
<li>Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+cellular+metabolites+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA.</a> Science. 335 (6073), 1194(2012).</li>
<li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li>
<li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broccoli%3A+Rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li>
<li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Basch, H., Gadebusch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antimicrobial+activity+of+dimethylsulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide.</a> Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).</li>
<li>Kallansrud, G., Ward, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+measured+and+calculated+single-+and+double-stranded+oligodeoxynucleotide+extinction+coefficients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients.</a> Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).</li>
<li>Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+pH+thermal+hydrolysis+method+for+quantification+of+structured+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs.</a> RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).</li>
<li>Szatmári, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+ion+concentrations+and+cation-dependent+remodelling+of+bacterial+MreB+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies.</a> Scientific Reports. 10, 12002(2020).</li>
<li>Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIVE%2FDEAD%C2%AE+BacLightTM%3A+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+G-quadruplex-containing+RNA+activates+fluorescence+in+a+GFP-like+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).</li>
<li>Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+ligand+binding+and+complex+stabilization+of+the+RNA+Mango+and+RNA+Spinach+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers.</a> RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+photophysics+of+the+Spinach-DFHBI+RNA+aptamer-fluorogen+complex+to+improve+live-cell+RNA+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+properties+of+Spinach+and+its+use+in+selective+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging.</a> Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).</li>
<li>Dao, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+DFHBI+bound+to+RNA+aptamer+Baby+Spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach.</a> Scientific Reports. 11, 7356(2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

对于 体外 动力学实验，可对相同的一般性方案进行修改以测量 体外 基于RNA的荧光生物传感器的动力学研究，该传感器包含配体结合域和荧光团结合域8在此情况下，应在加入配体之前，先将RNA与荧光染料孵育，以便在注入配体后测量配体响应动力学。若在重复样本间观察到较高的变异性，可通过检查每个样本在96孔板中测量前是否均经过相同时间的平衡来排查问题。每个样本或重复应分别在单独孔中制备，并在15分钟平衡步骤结束后立即测量，而不是一次性制备所有样本。
对于细胞动力学实验，可根据需要缩短或延长实验时间，但必须提前规划好生物学重复的次数，并相应调整所需的细胞溶液体积。建议每次生物学重复的检测间隔控制在30秒至1分钟之间，以确保有充足时间仔细完成每一步操作。另一种改进方法是测试使用一种不与RNA适体结合的荧光原性染料作为替代的阴性对照，该对照不应表现出超出背景水平的荧光激活。若观察到结果不一致，可通过检查流式细胞仪在不同实验运行之间是否已按照制造商的协议进行彻底清洗，以排除前一次实验的细胞或染料残留对后续实验的干扰。<...

荧光生成反应是指能够产生荧光信号的化学反应。荧光生成RNA适体通常通过结合小分子染料以增强其荧光量子产率来实现这一功能（图1A）1。目前已开发出多种不同的荧光生成RNA适体系统，每种系统均由特定的RNA适体序列及其对应的染料配体组成1。荧光生成RNA适体已被作为荧光标签连接到RNA转录本上，用于在活细胞中对mRNA和非编码RNA进行成像2,3,4。它们还被置于启动子序列之后，作为基因表达的荧光报告元件，其作用类似于绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子，但其报告功能发生在RNA水平5,6。最后，荧光生成RNA适体已被整合到基于RNA的荧光生物传感器中，这类传感器被设计为在响应特定小分子时触发荧光生成反应。基于RNA的荧光生物传感器已成功用于活细胞中多种非荧光代谢物和信号分子的成像研究7,8,9,10,11。
人们对开发荧光生成型RNA适体以可视化RNA定位、基因表达和小分子信号的动态变化日益关注。在这些应用中，获得实时测量结果是理想目标，但测量的准确性取决于荧光生成反应的动力学速度是否快于采样频率。本文描述了测定 体外 Spinach2 荧光RNA适体的动力学12&#160;和西兰花13 使用配备样品进样器的酶标仪，测定在细胞中表达的Spinach2的细胞激活动力学 大肠杆菌 使用流式细胞仪。选择这两种RNA适配体是因为它们已被用于研究RNA定位2,3,4，它们已被用于报告基因系统中5, 6 和生物传感器7,8,9,10,11，相应的染料配体（DFHBI 或 DFHBI-1T）可商业获得。它们的概述 体外 文献中确定的性质如下所示 表14,13,14这些结果为实验方案的制定提供了依据（例如所用的波长和染料浓度）。结果表明，受RNA适配体影响的荧光生成反应迅速，不会妨碍所需细胞生物学应用中的准确测量。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>BP160500</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳设备</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1A-BP</td><td></td></tr><tr><td>α-D-(+)-乳糖一水合物</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>18-600-440</td><td></td></tr><tr><td>琥珀色 1.5 mL 微量离心管</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵（(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT 流式细胞仪</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A24861</td><td></td></tr><tr><td>Attune 1x 聚焦液</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A24904</td><td></td></tr><tr><td>Attune 关机溶液</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A24975</td><td></td></tr><tr><td>Attune 性能追踪微球</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4449754</td><td></td></tr><tr><td>Attune 清洗液</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>&amp;nbsp;J24974</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>含氯漂白剂</td><td>Amazon</td><td>B07J6FJR8D</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 孔板</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF86610A</td><td></td></tr><tr><td>培养管，12 mm × 75 mm，5 mL，带双位置盖</td><td>Globe Scientific</td><td>05-402-31</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI-1T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2697</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖（无水）</td><td>Acros Organics</td><td>AC410955000</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>DNA 上样染料</td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 管（2.0 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA，pH 8.0</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（EtOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯的移液器吸头</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM12635, AM12648, AM12655, AM12665</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>FlowJo v10 软件</td></tr><tr><td>带加热控制的荧光酶标仪</td><td>VWR</td><td>10014-924</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳电源</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>EC3000XL2</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>糖原 AM95010</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM95010</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>来自学术团体许可的分析软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加热块&amp;nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159Z11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>无机焦磷酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>低分子量 DNA Marker</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233L</td><td>随附一管免费的紫色胶上样染料（6×），不含 SDS（NEB #B7025）。</td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MFCD00011110</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>带温控的微量离心机</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR</td><td></td></tr><tr><td>带 BioPak 单元的 Millipore 水过滤器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDUFBI001, ZRQSVR3WW</td><td></td></tr><tr><td>窄口移液器吸头</td><td>DOT Scientific</td><td>RN005R-LRS</td><td></td></tr><tr><td>PBS，10×</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>BP39920</td><td></td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28181</td><td></td></tr><tr><td>PCR 引物和模板</td><td>Integrated DNA technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于薄壁 PCR 管的 PCR 扩增仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>用于 0.5 mL 管的 PCR 扩增仪</td><td>Techne</td><td>5PRIME/C</td><td></td></tr><tr><td>pET31b-T7-Spinach2 质粒</td><td>Addgene</td><td>质粒 #79783</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>购买 Phusion 高保真酶时，会附带提供 5× Phusion HF 缓冲液、5× Phusion GC 缓冲液，以及 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 DMSO 溶液。</td></tr><tr><td>聚丙烯酰胺凝胶电泳梳子，C.B.S. Scientific</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>VGC-1508</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯酰胺凝胶电泳设备</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>刀片</td><td>Genesee Scientific</td><td>38-101</td><td></td></tr><tr><td>rNTPs：ATP、CTP、GTP、UTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>短波紫外光源</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11758221</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S375-500</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>通过学术团体许可获得的 SoftMax Pro 6.5.1（酶标仪软件）</td></tr><tr><td>无菌过滤装置</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>09-741-88</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染色剂</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳用 TAE 缓冲液</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨（颗粒状）</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>尿素-PAGE 凝胶系统&amp;nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td></td></tr><tr><td>紫外荧光 TLC 板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05789.0001</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>2215415</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯氰蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物（颗粒状）</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>BP9727-2</td><td></td></tr></tbody></table>

测定 体外 荧光rna适体的细胞内激活动力学

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

荧光生成型RNA适体已被应用于活细胞中，用于标记和可视化RNA、报告基因表达，以及激活可检测代谢物和信号分子水平的荧光生物传感器。为了研究上述每个系统的动态变化，理想情况下需获得实时测量数据，但测量的准确性取决于荧光生成反应的动力学速度是否快于采样频率。本文描述了测定 体外 使用配备样品注射器的酶标仪和流式细胞仪，分别测定荧光生成型RNA适体的细胞群体激活动力学和单细胞激活动力学。我们证明了 体外 Spinach2和Broccoli适体荧光激活的动力学可建模为双相缔合反应，其快速相速率常数分别为0.56 s⁻¹−1 和 0.35 秒−1分别。此外，我们显示了Spinach2荧光激活的细胞动力学过程 大肠杆菌，尽管染料向革兰氏阴性菌的扩散会进一步限制其效果，但仍足够快速，可在分钟级时间尺度上实现准确的采样频率。这些分析荧光激活动力学的方法同样适用于已开发的其他荧光原生RNA适体。

体外动力学 
合成寡核苷酸购自供应商，其DNA模板和引物序列见表2，试剂配方见补充文件1。通过PCR扩增增加含有T7启动子的DNA模板数量，以用于后续的体外转录（IVT）反应。此外，PCR扩增可在同一反应中实现两个目的：通过引物延伸生成全长的Broccoli DNA模板，同时扩增DNA模板的量。
体外转录（IVT）反应合成RNA后，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化可去除全长RNA产物中存在的任何不需要的截短转录本、降解产物以及未反应的核糖核苷三磷酸（rNTP）。首选此类纯化方法，是因为截短或降解的RNA会导致RNA浓度测定不准确。由于核苷酸碱基可吸收紫外光，因此在紫外光照射下，凝胶上的RNA条带和rNTP可在荧光薄层色谱（TLC）板背景上以阴影形式显现。因此，可选择性地切取对应于正确产物大小的条带进行回收。
最近邻法由于未考虑碱基配对引起的减色效应，...

该方案介绍了两种测定荧光RNA适体Spinach2和Broccoli动力学特性的方法。第一种方法描述了如何测量荧光适体的动力学参数 体外 使用酶标仪进行检测，而第二种方法详细描述了通过流式细胞术测量细胞中荧光生成型适配体动力学的过程。

测定 体外 荧光RNA适体的细胞内激活动力学

荧光生成型RNA适体已在活细胞中用于标记和可视化RNA、报告基因表达以及激活荧光生物传感器……

体外和细胞内荧光生成型适体动力学的研究可使用户评估适体与染料的相互作用速度是否足够快，从而能够实时观察目标生物学过程。本文介绍的技术可用于在细胞内外进行定量动力学测量，具体选择取决于适体的应用场景。所描述的方法可适用于任何荧光生成型RNA系统，包括其他类型的适体以及用于小分子检测的RNA生物传感器。首先，从热循环仪中设置RNA复性程序。通过选择“创建新程序”、“添加新阶段”和多次“添加新步骤”来创建程序，以添加特定温度的步骤，然后按“保存”。根据程序调整其他设置。为了复性spinach two和broccoli RNA，用双蒸水在0.5毫升薄壁PCR管中分别配制每种RNA的两微摩尔溶液。然后加入等体积的两倍复性缓冲液，配制为一微摩尔的RNA溶液。将试管放入热循环仪中。打开预先保存的复性程序并点击运行“下一步”，接着设置酶标仪进样程序。在荧光酶标仪上，选择“温度”并将其设置为 37 摄氏度。开始动力学检测前，确保温度已平衡至该设定值。打开酶标仪软件。选择设置，然后选择采集视图以输入动力学测量程序，为每个孔选择循环。接下来，将基线设置为60次基线读数，并设置10微升进样的智能注射参数。将荧光读数的激发波长设为448纳米，发射波长设为506纳米，滤光片盒设为单色。将总读取时间设置为10分钟，读取间隔为0.5秒。将PMT和光学参数设置为每次读取六次闪光。然后循环至下一孔。准备酶标仪进样器时，选择酶标仪上的“注入”选项，并在提示时放置废液收集板。然后选择“清洗”，按照酶标仪的指示，依次使用1毫升双蒸水、75%乙醇和蒸馏水冲洗进样管。接下来选择“吸液”，使进样器排出多余液体。然后选择“prime”以用两份260微升的100微摩尔DFHBI对注射器进行预填充。要进行一次动力学实验，将80微升结合缓冲液主混合液加入96孔透明底板的一个孔中。然后加入10微升复性的RNA。让96孔板以及注射器中的DFHBI溶液在37摄氏度下平衡15分钟。接下来，在软件设置的读取区域中选择待分析的孔。然后在“主页”选项卡下，选择“运行”以执行之前描述的动力学程序。重复此过程，直至所有实验完成。运行结束后，清洗进样器，以去除进样管中残留的 D F H B I 溶液，方法如前所述。设置实验文件时，打开流式细胞仪和计算机。在实验浏览器选项卡中，通过右键单击流式细胞仪“用户名”来创建一个新文件。然后在下拉窗口中选择“新建实验”，当计算机屏幕上弹出新窗口时，选择实验类型为“试管”，然后点击“确定”。在新的实验文件中，右键单击分组文件夹并选择“添加新样品管”。通过右键单击样品并选择下拉菜单中的“重命名”，为每个特定时间点和重复样本标记样品管。接下来，在培养管中加入 1.5 毫升 1× PBS 和 3 微升 AI 培养基中诱导的细胞，制备稀释的细胞溶液。在添加染料之前，测量细胞的背景荧光，以观察随时间变化的荧光倍数上升情况。加入染料后，将含有细胞的培养管放入PBS中，并置于样品管提升架上，然后升起提升架至样品进样针位置。接着在采集面板选项卡中选择正确的样品文件，点击“记录”。运行完成后，手动降低带有培养管的样品管提升架。为启动清洗步骤，冲洗流体系统，并尽量减少每个生物学重复样品之间的残留。要进入下一个样本，请点击记录图标下方样本管名称附近的右箭头图标，选择下一个样本文件。如需测量染色细胞的荧光，请将1.4 µL浓缩染料储备液加入含细胞的1× PBS中，使DFHBI的终浓度为50 µmol/L。拧紧培养管盖，倒置混匀3至5次，使溶液充分混匀。随后打开管盖，将培养管放入样本管升降架中。将样品架升至样品进样针位置后，点击相应样品文件下方的“record”图标。然后按下“start”开始计时。氟原生适体 Spinach2 和 Broccoli 的体外动力学显示了与 DFHBI 染料结合的两相缔合动力学。对于这两种适体，在较长的测量时间内，两相缔合模型对动力学数据的拟合效果优于单相模型。最佳拟合曲线确定了快速和慢速结合反应的速率常数及半衰期值。处于结合能力状态的Spinach two比broccoli的信号开启速度更快。两种适体的第二相动力学相似，可能对应于一个共同的限速步骤。适配体动力学曲线由相似程度的快速结合RNA组成。对于表达spinach two tRNA的细胞，平均荧光强度（MFI）在零时间点立即增加。此外，细胞荧光在五分钟内达到其最大平衡MFI值。相比之下，对照细胞显示出较低的背景荧光，且在加入DMSO后MFI值无变化。本研究所提出的方法可帮助科研人员确定如何更快地构建基于RNA的荧光原性适体传感器。

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荧光RNA适配体 外和细胞 开启动力学的测定

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