测定 体外 荧光RNA适体的细胞内激活动力学

体外和细胞内荧光生成型适体动力学的研究可使用户评估适体与染料的相互作用速度是否足够快，从而能够实时观察目标生物学过程。本文介绍的技术可用于在细胞内外进行定量动力学测量，具体选择取决于适体的应用场景。所描述的方法可适用于任何荧光生成型RNA系统，包括其他类型的适体以及用于小分子检测的RNA生物传感器。

首先，从热循环仪中设置RNA复性程序。通过选择“创建新程序”、“添加新阶段”和多次“添加新步骤”来创建程序，以添加特定温度的步骤，然后按“保存”。根据程序调整其他设置。为了复性spinach two和broccoli RNA，用双蒸水在0.5毫升薄壁PCR管中分别配制每种RNA的两微摩尔溶液。

然后加入等体积的两倍复性缓冲液，配制为一微摩尔的RNA溶液。将试管放入热循环仪中。打开预先保存的复性程序并点击运行“下一步”，接着设置酶标仪进样程序。

在荧光酶标仪上，选择“温度”并将其设置为 37 摄氏度。开始动力学检测前，确保温度已平衡至该设定值。打开酶标仪软件。

选择设置，然后选择采集视图以输入动力学测量程序，为每个孔选择循环。接下来，将基线设置为60次基线读数，并设置10微升进样的智能注射参数。将荧光读数的激发波长设为448纳米，发射波长设为506纳米，滤光片盒设为单色。

将总读取时间设置为10分钟，读取间隔为0.5秒。将PMT和光学参数设置为每次读取六次闪光。然后循环至下一孔。

准备酶标仪进样器时，选择酶标仪上的“注入”选项，并在提示时放置废液收集板。然后选择“清洗”，按照酶标仪的指示，依次使用1毫升双蒸水、75%乙醇和蒸馏水冲洗进样管。接下来选择“吸液”，使进样器排出多余液体。

然后选择“prime”以用两份260微升的100微摩尔DFHBI对注射器进行预填充。要进行一次动力学实验，将80微升结合缓冲液主混合液加入96孔透明底板的一个孔中。然后加入10微升复性的RNA。让96孔板以及注射器中的DFHBI溶液在37摄氏度下平衡15分钟。

接下来，在软件设置的读取区域中选择待分析的孔。然后在“主页”选项卡下，选择“运行”以执行之前描述的动力学程序。重复此过程，直至所有实验完成。

运行结束后，清洗进样器，以去除进样管中残留的 D F H B I 溶液，方法如前所述。设置实验文件时，打开流式细胞仪和计算机。在实验浏览器选项卡中，通过右键单击流式细胞仪“用户名”来创建一个新文件。

然后在下拉窗口中选择“新建实验”，当计算机屏幕上弹出新窗口时，选择实验类型为“试管”，然后点击“确定”。在新的实验文件中，右键单击分组文件夹并选择“添加新样品管”。通过右键单击样品并选择下拉菜单中的“重命名”，为每个特定时间点和重复样本标记样品管。接下来，在培养管中加入 1.5 毫升 1× PBS 和 3 微升 AI 培养基中诱导的细胞，制备稀释的细胞溶液。在添加染料之前，测量细胞的背景荧光，以观察随时间变化的荧光倍数上升情况。

加入染料后，将含有细胞的培养管放入PBS中，并置于样品管提升架上，然后升起提升架至样品进样针位置。接着在采集面板选项卡中选择正确的样品文件，点击“记录”。运行完成后，手动降低带有培养管的样品管提升架。为启动清洗步骤，冲洗流体系统，并尽量减少每个生物学重复样品之间的残留。

要进入下一个样本，请点击记录图标下方样本管名称附近的右箭头图标，选择下一个样本文件。如需测量染色细胞的荧光，请将1.4 µL浓缩染料储备液加入含细胞的1× PBS中，使DFHBI的终浓度为50 µmol/L。拧紧培养管盖，倒置混匀3至5次，使溶液充分混匀。随后打开管盖，将培养管放入样本管升降架中。

将样品架升至样品进样针位置后，点击相应样品文件下方的“record”图标。然后按下“start”开始计时。氟原生适体 Spinach2 和 Broccoli 的体外动力学显示了与 DFHBI 染料结合的两相缔合动力学。对于这两种适体，在较长的测量时间内，两相缔合模型对动力学数据的拟合效果优于单相模型。

最佳拟合曲线确定了快速和慢速结合反应的速率常数及半衰期值。处于结合能力状态的Spinach two比broccoli的信号开启速度更快。两种适体的第二相动力学相似，可能对应于一个共同的限速步骤。

适配体动力学曲线由相似程度的快速结合RNA组成。对于表达spinach two tRNA的细胞，平均荧光强度（MFI）在零时间点立即增加。此外，细胞荧光在五分钟内达到其最大平衡MFI值。

相比之下，对照细胞显示出较低的背景荧光，且在加入DMSO后MFI值无变化。本研究所提出的方法可帮助科研人员确定如何更快地构建基于RNA的荧光原性适体传感器。