基于原子力显微镜的人关节软骨外植体微压痕研究的实际问题

该协议的目的是创建一个体外模型，用于研究骨关节炎发病和进展期间关节软骨的机械性能。本技术的主要优点是软骨外植体易于生成，并且高度代表了天然年龄的软骨。该模型可用于在生物力学水平上分析和监测各种骨关节炎、诊断和治疗方法。

首先，用手术刀将软骨从骨头上切开。使用活检打孔器，生成直径为四毫米的椎间盘。将光盘放在定制的切割设备上。

使用刮刀固定并稳定软骨盘。用剃须刀片切割软骨盘。使用刮刀，收集圆盘并将其放入 1.5 毫升的管中。

为了留在软骨样品中，向96孔板的每个孔中加入130微升细胞渗透性荧光染料，并将圆盘分布在板上，每孔一个圆盘。将96孔板放在荧光显微镜的板架上。选择合适的荧光滤光片和物镜。

将物镜放置在含有单个软骨的预选孔下方。将焦点放在椎间盘上以查看细胞模式。选择导航器功能以获取整个油井的概览。

使用鼠标左键并拖动它以导航到不同的舞台位置。选择包含要扫描的感兴趣区域的正方形。选择软件的焦点图点选项，然后通过左键单击其中心来选择每个单独的图块。

在出现的窗口中选择选项焦点图，其中包含所有先前选择的图块。双击要显示的磁贴，并将其置于适当的焦点。接下来，单击设置 Z 以保存焦点计划并继续下一个磁贴。

调整每个单独瓷砖的焦平面后，按开始扫描开始图像采集。通过在培养皿的顶部，底部，左侧和右侧添加足够的生物相容性胶，将每个预先选择的含有细胞图案的软骨盘固定在培养皿中。用不含 L-谷氨酰胺的 2.5 毫升 Leibovitz 培养基覆盖光盘。

将培养皿放置在AFM设备样品架中。要校准悬臂梁，请将其放置在玻璃块悬臂的表面上，使其位于玻璃块中心的抛光光学平面上。使用步进电机功能以 100 微米的步长降低悬臂，直到它完全浸没在介质中。

为了确定所需的软骨测量部位，在培养皿的干净无样品区域上用悬臂开始扫描仪方法。然后将悬臂缩回距离板底部 1.5 毫米处。从明场视图切换到荧光视图，并直观地识别光盘的顶部。

将 AFM 样品架向圆盘中间移动 2 毫米。运行扫描仪方法以到达软骨盘的表面并将悬臂缩回 100 微米。要生成力距离曲线，请关注位于所需测量位置的单元。

单击运行按钮开始测量，并在每个测量点上获取五条力距离曲线。检查曲线后保存曲线。要估计杨氏模量，请使用打开一批光谱曲线选项，打开生成的要分析的力距离曲线。

选择赫兹拟合模型，然后选择弹性拟合选项。然后可视化并记录杨氏模量。使用 0.5 的泊松比和适当的悬臂尖端半径进行调整。

然后目视检查力距曲线拟合，确保正确性。对于压痕深度的确定，在数据分析软件中打开每个生成的力距离曲线，并选择赫兹拟合模型作为分析过程。应用减去基线偏移选项将垂直偏转轴归零，然后选择偏移加倾斜功能。

使用查找接触点功能自动识别接触点。使用垂直尖端位置功能，从压痕期间的原始压电陶瓷高度减去仅考虑悬臂挠度的距离。选择弹性拟合选项以显示处理的力距离曲线。

然后选择图形的区域，使其与垂直尖端位置轴上的最大负值对齐。在 XMIN 框的参数选项卡中，读取并记录缩进。包含单根弦的椎间盘显示出更高的刚度值，中位数为 2.6 千帕斯卡，这代表了未妥协的健康软骨区域。

随着骨关节炎的发生和进展，AFM测量显示，双串的硬度逐渐下降42%，小簇的硬度下降77%，最终在大簇代表的晚期阶段下降88%。包含漫反射图案的圆盘以高弹性显示，杨氏模量单个值有重要变化。对于所有具有指定主要细胞模式组织的软骨盘，发现与所采用的设定点相关的压痕深度与刚度成反比。

在生成的力距离曲线中看到的伪影表明悬臂梁和软骨表面之间的接触不理想，或者样品与培养皿的固定不当。我们的软骨外植体可以使用各种分子生物学技术进行进一步加工和分析，例如通过eliza进行蛋白质分析、免疫标记、蛋白质免疫印迹修饰或通过PCR进行基因分析。这种方法可用于研究新疗法对关节软骨的直接影响，并可能有助于研究人员获得对骨关节炎的软脂肪机制的重要见解。