通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

该方案可直接从新鲜获取的小鼠组织（如骨髓和脾脏）中鉴定并分离BFU-E和CFU-E红系祖细胞。利用此技术，我们能够分离出高纯度的红系祖细胞群体，而这是以往的流式细胞分析方案所无法实现的。该方法显著提升了我们研究红系疾病小鼠模型的能力，使祖细胞的分离可用于多种下游实验。

首先，将新鲜解剖得到的股骨和胫骨直接放入冰冷的染色缓冲液（SB-5）中，并将离心管置于冰上，直至准备提取骨髓。将一个洁净且已灭菌的研钵置于装有冰的容器中，并将骨骼转移至研钵内。使用解剖剪剪去每根骨骼两端约1毫米的骨端。

使用带有26号针头的3毫升注射器，吸入SB-5缓冲液，将骨髓从骨骼中冲洗出来，并收集至研钵中，每次使用新鲜缓冲液重复此操作3至5次，直至骨骼呈无色。将冲洗出的骨髓通过100微米细胞筛过滤，并将细胞收集到置于冰上的50毫升离心管中。接着，使用研钵和研杵在5至10毫升SB-5缓冲液中研磨已冲洗过的骨骼。

将破碎的骨骼与缓冲液的混合物通过100微米细胞滤筛过滤，收集至先前已收集的细胞中。将100微米孔径滤网置于一个空的50毫升离心管上，并将离心管放置在冰上。将单个脾脏置于滤网之上，并向脾脏加入0.5至1毫升SB-5溶液，以确保其不干燥。

使用3毫升或5毫升注射器活塞的橡胶端，将脾脏研磨通过滤网。每次加入5毫升SB-5，继续研磨，直至所有细胞均收集至离心管中。用大孔枪头吸取2毫升SB-5，将收集的细胞反复吹打，制备单细胞悬液。

通过向FACS管中的细胞悬液加入除该FMO对应抗体外的所有抗体，来染色荧光减一（fluorescence minus one, FMO）对照。对于单色对照，向FACS管中的细胞悬液加入单一抗体。将每个对照管在3000 RPM下涡旋2至3秒，随后在4摄氏度避光条件下振荡孵育2.5小时。

孵育结束后，用 SB-5 洗涤细胞，并用 SB-5 将细胞悬液体积补至 4 毫升。在 4 摄氏度下以 900 ×g 离心 10 分钟，吸除上清液。将未染色样本及所有单色对照重悬于 300 微升 SB-5 中，并通过 40 微米滤网过滤至新的 FACS 管中。

通过将DAPI储备液以1:10,000的比例稀释于SB-5中，配制DAPI SB-5溶液。将FMOS重悬于1.8毫升DAPI SB-5中，单色DAPI对照重悬于300微升DAPI SB-5中，随后通过40微米滤网过滤至新的FACS管中。向每份样品中加入抗体主混合液后，以3000 rpm涡旋震荡2至3秒，随后在4摄氏度避光条件下于摇床上孵育2.5小时。

按照先前演示的方法洗涤细胞后，将样品重悬于 1.8 毫升 DAPI SB-5 中，并通过 40 微米滤网过滤至新的 FACS 管中，然后使用流式细胞仪分析样品。利用前向散射根据细胞大小去除碎片，接着使用前向散射高度与前向散射面积的直方图排除细胞聚集体并选择单细胞。再利用侧向散射高度与侧向散射面积的直方图重复进行排除。

通过排除DAPI阳性细胞来去除死细胞。选择谱系阴性、TUR one 19阴性、c-Kit阳性细胞。从这些细胞中再选出表达CD 55的亚群。

根据CD49F和CD105的表达情况，将TUR阴性、19阴性、kit阴性、CD55阳性的谱系阴性细胞分为两个主要群体，即P6和P7。接着根据CD150和CD41的表达情况，进一步将P6细分为P3、P4和P5。类似地，根据CD150和CD71的表达情况，将P7进一步细分为BFU-E、早期CFU-E和晚期CFU-E。

在本研究中，从新分离的骨髓和脾细胞中鉴定了爆式红系集落和集落形成单位。在小鼠接受促红细胞生成素或载体注射72小时后，促红细胞生成素刺激组在分离的骨髓和脾细胞中显示出早期和晚期集落形成单位群体P1低和P1高数量的扩增。骨髓和脾祖细胞对促红细胞生成素的体内反应也表明，与载体对照组相比，早期和晚期集落形成单位群体P1低和P1高中的细胞数量更多。

在使用抗体标记细胞之前，最重要的是制备单细胞悬液。这可以通过反复吹打以及在缓冲液中添加EDTA来实现。纯化后的前体细胞可用于任何后续的细胞和分子分析。

例如，单细胞转录组学、atesque、菌落实验和生物化学方法。该技术帮助我们验证了单细胞RNA测序实验中的预测结果。