Name: 流式细胞术从小鼠组织中鉴定和分离爆破形成单元和集落形成单元红系祖细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学习利用流式细胞术从小鼠骨髓和脾脏中高效分离BFU-e与CFU-e红系祖细胞的方法。该技术可获得高纯度细胞群体，为红细胞疾病研究及下游单细胞转录组学和集落实验提供可靠支持。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01DK130498、R01DK120639 和 R01HL141402

所有实验均按照马萨诸塞大学陈医学院机构动物照护与使用委员会批准的动物实验方案 A-1586 和 202200017 进行。
注意：本文详细介绍了两种实验方案：首先为流式细胞术分析（第1部分），随后为流式细胞分选的方案调整（第2部分）。以下方案使用具有10个通道的流式细胞仪/分选仪。步骤1.14.5中参考了表1提供的示例设置。本方案也可使用9个通道完成；详见表2中的图注。
1. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>使用贵机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的适当方法（例如，CO2 吸入后行颈椎脱位）对成年（&#62;6 周龄）Balb/C 或 C57BL6 小鼠实施安乐死。进行流式细胞术分析时，单只小鼠的骨髓（BM）已足够。若用于分选，则所需小鼠数量取决于下游应用。各细胞群体的细胞产量见下文（步骤 2.3.3）。</li>
	<li>组织收获：
	<ol>
		<li>在冰上准备含有 3 mL 冷（4 °C）染色缓冲液（&#34;SB5&#34;：磷酸盐缓冲液（PBS）、0.2% 牛血清白蛋白（BSA）、0.08% 葡萄糖、5 mM EDTA）的 5 mL 荧光激活细胞分选（FACS）管，用于放置收获的组织。</li>
		<li>为每只小鼠解剖出的每种组织分别准备独立的离心管。不要将多只小鼠的组织混合。</li>
		<li>取出双侧股骨和双侧胫骨。在将骨骼放入含 SB5 的离心管前，彻底去除所有肌肉组织。</li>
		<li>通过腹部左侧切口解剖脾脏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨髓细胞提取：
	<ol>
		<li>将新鲜解剖的股骨和胫骨直接放入冷染色缓冲液（SB5）中，并将离心管置于冰上，待提取骨髓（BM）时使用。将一个洁净灭菌的研钵置于冰桶中。将骨骼连同离心管中的 SB5 一起转移至研钵中。</li>
		<li>使用解剖剪在每根骨骼两端剪去约 1 mm，使骨腔刚好可见。</li>
		<li>使用装有 SB5 的 26 G 针头和 3 mL 注射器冲洗骨骼中的骨髓，并将其收集至研钵中。每次使用新鲜缓冲液重复此过程 3–5 次，直至骨骼呈无色。</li>
		<li>将冲洗出的骨髓通过 100 μm 孔径滤网过滤，并收集到置于冰上的 50 mL 离心管中。</li>
		<li>使用研钵和研杵在 5–10 mL SB5 中碾碎已冲洗过的骨骼。将碾碎后的骨骼与缓冲液混合物通过 100 μm 细胞滤网过滤，并与步骤 1.3.4 中收集的细胞合并。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脾细胞提取：
	<ol>
		<li>在置于冰上的空 50 mL 离心管上安装 100 μm 孔径滤网。将单个脾脏置于滤网上。</li>
		<li>向脾脏中加入 0.5–1 mL SB5，防止其干燥。</li>
		<li>使用 3 mL 或 5 mL 注射器活塞的橡胶端将脾脏压过滤网。每次加入 5 mL SB5，继续研磨，直至所有细胞均被收集至离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从本步骤起，骨髓细胞与脾细胞的处理方式相同。</li>
	<li>在 900 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。使用真空抽吸装置吸除上清液。</li>
	<li>为制备单细胞悬液，将细胞重悬于 2 mL SB5 中，并使用带大孔吸头的 P1000 移液器上下吹打 50 次（参见材料表）。此类吸头具有较宽的开口，有助于防止脆弱细胞受损。</li>
	<li>为计数细胞，先上下吹打 20 次使细胞重悬。按 1:100 比例用 SB5 稀释细胞。取 10 μL 稀释后的细胞与 10 μL 台盼蓝混合，在血细胞计数板和/或细胞计数仪上进行计数。</li>
	<li>在 900 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。吸除上清液后，将细胞重悬于 SB5 中，浓度为 33 × 106 个活细胞/mL。</li>
	<li>通过混合表 3中所列每种抗体的等体积溶液，配制 Lin-FITC 抗体混合液。</li>
	<li>准备单色对照和&#34;荧光减一&#34;（FMO）对照的细胞。在进行步骤 1.14（用于流式细胞术分析的样本）和/或步骤 2.1（流式细胞术分选）的样本制备与染色的同时，平行执行步骤 1.11–1.12。
	<ol>
		<li>为未染色对照准备细胞：将 50 μL（1.6 × 106 个细胞）细胞悬液转移至冰上的 FACS 管中。为每个单色对照（共 11 管）准备细胞：将 50 μL（1.6 × 106 个细胞）细胞悬液转移至冰上的 FACS 管中。</li>
		<li>为以下荧光通道（Kit、CD41、CD150、CD49f [四管]）准备 FMO 对照：将 300 μL（10 × 106 个细胞）细胞悬液分别转移至冰上的独立 FACS 管中。</li>
		<li>在 900 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FMO 和单色对照的抗体染色
	<ol>
		<li>在 FACS 管中以 33 × 106 个细胞/mL（总体积 300 μL）对 FMO 进行染色。对每个对照，加入除该 FMO 所对应抗体外的所有其他抗体。例如，Kit FMO 中不加入 Kit 抗体。每种抗体的稀释比例和终浓度参见表 2。</li>
		<li>在 FACS 管中以 20 × 106 个细胞/mL（总体积 50 μL）对单色对照进行染色；每个对照仅加入表 2中列出的一种抗体，浓度按表中所示。</li>
		<li>将每管对照在 3,000 rpm（每分钟转数）下涡旋 2–3 秒，然后在 4 °C 黑暗条件下避光振荡孵育 2.5 小时。振荡时旋转轴应平行于管身长度方向，倾斜角度约为水平方向 10° 至 60°，确保内容物不接触管盖。</li>
		<li>用 SB5 洗涤细胞：将细胞悬液体积补至 4 mL。在 900 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞重悬：
	<ol>
		<li>将未染色对照及所有单色对照（DAPI 对照除外）重悬于 300 μL SB5 中，并通过 40 μm 滤网过滤至新的 FACS 管中。</li>
		<li>通过将 DAPI 储存液（1 mg/mL 溶于 100% 乙醇）按 1:10,000 比例稀释于 SB5 中，配制 DAPI/SB5 溶液。</li>
		<li>将 FMO 对照重悬于 1.8 mL DAPI/SB5 溶液中，并通过 40 μm 滤网过滤至新的 FACS 管中。</li>
		<li>将 DAPI 单色对照重悬于 300 μL DAPI/SB5 溶液中，并通过 40 μm 滤网过滤至新的 4 mL FACS 管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本制备：若细胞用于流式细胞术分析，请进入步骤 1.14；若用于分选，则跳至步骤 2.1。</li>
	<li>在 FACS 管中以 33 × 106 个细胞/mL（总体积 300 μL，即 10 × 106 个细胞）对用于流式细胞术分析的样本进行染色：
	<ol>
		<li>配制抗体主混合液。根据样本数量确定主混合液体积，每样本 300 μL。将表 2中列出的所有抗体按指定稀释比例用 SB5 稀释配制主混合液。主混合液中的兔 IgG 用作 Fc 受体阻断剂。</li>
		<li>将每管在 3,000 rpm 下涡旋 2–3 秒，然后在 4 °C 黑暗条件下避光振荡孵育 2.5 小时。</li>
		<li>用 SB5 洗涤细胞：将细胞悬液体积补至 4 mL。在 900 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，吸除上清液。</li>
		<li>将用于流式细胞术分析的样本重悬于步骤 1.12.5.2 中配制的 1.8 mL DAPI/SB5 溶液中，并通过 40 μm 滤网过滤至 FACS 管中。</li>
		<li>使用具备 10 个检测通道的流式细胞仪分析样本，以兼容表 2中的抗体偶联物及活力染料 DAPI。示例通道设置见表 1。也可仅使用九个通道，详见表 2图注。</li>
		<li>在分析流式细胞术数据时，参照步骤 2.4 的说明，利用单色对照和 FMO 对照进行标准的光谱补偿校正。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 流式细胞分选的实验方案调整
<ol>
	<li>Lin的制备-
	<ol>
		<li>将来自10只小鼠的相同组织（骨髓或脾脏）中提取的细胞全部汇集至一个50 mL离心管中。使用P1000移液器配合宽口吸头，通过吹打重悬每份混合细胞样品。</li>
		<li>以 900 x g 离心细胞 g4 °C 下离心 10 分钟，吸除上清液。</li>
		<li>按照第1节所述，使用未富集的细胞制备单色和FMO对照。</li>
		<li>Enrich Lin- 使用磁珠富集Lin标记的细胞进行分选- 细胞：</li>
		<li>将细胞重悬于 1 x 108 细胞/mL 与 SB5 混合后转移至 15 mL 离心管中。加入正常大鼠血清及下述生物素标记的抗体 表4 在4 °C下振荡孵育1小时。</li>
		<li>以 900 x g 离心细胞 g，4 °C 下离心 10 分钟，吸除上清液。将细胞重悬于 15 mL 冷 SB5 中。</li>
		<li>以 900 x g 离心细胞 g，4 °C 下离心 10 分钟，吸除上清液。将细胞重悬于 1 x 108 细胞/mL，置于冰上预冷的SB5中，并保持在冰上。</li>
		<li>将磁性纳米珠在3,000 rpm条件下涡旋5–10秒。每10 mL细胞取1 mL磁性纳米珠。</li>
		<li>在5 mL FACS管中洗涤纳米磁珠，用SB5缓冲液定容至4 mL，900 × g离心 g4 °C 下离心 5 分钟，吸除上清液。</li>
		<li>将纳米磁珠重悬于500 µL SB5缓冲液中，与步骤2.1.7制备的细胞混合。4 °C条件下振荡孵育15分钟。</li>
		<li>以 900 x g 离心细胞 g，4 °C 下离心 10 分钟，吸除上清液。将细胞重悬于 1 x 108 细胞/mL，使用SB5。</li>
		<li>将试管置于4 °C的磁力架上5分钟。</li>
		<li>小心地将上清液倒入一个新的15 mL离心管中。</li>
		<li>将含有步骤 2.1.13 上清液的离心管置于 4 °C 磁力架上静置 5 分钟。小心地将上清液倒入一个新的 15 mL 离心管中。</li>
		<li>将步骤 2.1.14 中的上清液离心，条件为 900 x g4 °C 下离心 10 分钟，吸除上清液。</li>
		<li>重悬 Lin-在1 mL SB5中富集细胞。</li>
		<li>将10 µL细胞以1:100的比例稀释于SB5培养基中。取10 μL稀释后的细胞与10 μL台盼蓝混合，使用血细胞计数板和/或细胞计数仪进行计数。</li>
		<li>根据步骤 2.1.17 中的细胞计数，将 Lin-富集细胞于 33 x 106 细胞/毫升</li>
	</ol>
	</li>
	<li>富集细胞的染色：
	<ol>
		<li>对富集的细胞样品进行染色，细胞数量为 33 x 106 细胞/mL，加入FACS管中，并添加所列全部抗体 表2每管涡旋震荡2-3秒（3,000 rpm），然后于4 °C避光摇动孵育2.5小时，避免光照。</li>
		<li>用SB5洗涤细胞：用SB5将FACS管中的体积补至4 mL。在900 x g下离心沉淀细胞。 g4°C 下离心 10 分钟，弃上清液。</li>
		<li>将样本重悬于4-6 mL按步骤1.12.5.2制备的DAPI/SB5溶液中用于流式细胞术分析，并通过40 µm滤网过滤至新的4 mL FACS管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品分选：
	<ol>
		<li>使用大口径喷嘴和低压力分选样本，以最大化CFU-e的得率，因为CFU-e细胞在高压力下容易受损。对于本研究中使用的流式细胞仪，采用14 psi配100 μm喷嘴，或12 psi配130 μm喷嘴。分选门的设置参见下文步骤2.4中的描述。</li>
		<li>制备收集缓冲液：向PBS中加入20%胎牛血清。</li>
		<li>为检测分选后细胞群的纯度，按照步骤1.12.5.2所述方法，取每份分选后细胞群的一小部分，重悬于含DAPI的缓冲液中并重新上机检测。 
		注意：通常，来自总共10只小鼠的骨髓（约1 x 109 细胞）可分别获得至少50,000–100,000个P1-hi、P1-low和P2细胞群，细胞活力约为70%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用所示的设门策略 图3 用于分析或设置分选门。
	<ol>
		<li>使用前向散射（FSC）参数根据细胞大小去除碎片。利用FSC-高度与FSC-面积的散点图排除细胞聚集体并选择单细胞；同样方法重复使用于侧向散射（SSC）-高度与SSC-面积的散点图。</li>
		<li>通过设门排除对DNA染料DAPI呈阳性的细胞，以去除死细胞，因为活细胞对DAPI不具有通透性。</li>
		<li>选择 Lin-Ter119-试剂盒+ 细胞，并从中筛选出表达 CD55 的亚群。</li>
		<li>将 Lin 细分- Ter119-试剂盒+CD55+ 根据CD49f和CD105的表达情况，将细胞分为两个主要群体P6和P7。</li>
		<li>根据CD150和CD41的表达情况，将P6进一步细分为P3（嗜碱性粒细胞或肥大细胞前体细胞）、P4（巨核细胞前体细胞）和P5（EBMP及红系偏向的MPP）。</li>
		<li>根据CD150和CD71的表达水平，将P7进一步细分为P2（BFU-e）、早期CFU-e（P1-low）和晚期CFU-e（P1-hi）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li>
<li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development%3A+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li>
<li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2021).</li>
<li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hemopoiesis+in+Culture%22%5BJournal%5D)">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).</li>
<li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li>
<li>Iscove, N. N., Sieber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid+progenitors+in+mouse+bone+marrow+detected+by+macroscopic+colony+formation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture.</a> Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).</li>
<li>Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture%3A+State+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation.</a> Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).</li>
<li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture%3A+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li>
<li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system%3A+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li>
<li>Pop, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biology. 8 (9), 1000484(2010).</li>
<li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71%2FTER119+flow-cytometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2809(2011).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo.</a> Blood. 108 (1), 123-133 (2006).</li>
<li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a%28-%2F-%295b%28-%2F-%29+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).</li>
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<li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li>
<li>Shearstone, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+DNA+demethylation+during+mouse+erythropoiesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo.</a> Science. 334 (6057), 799-802 (2011).</li>
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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

此前，研究人员一直难以直接从新鲜组织中前瞻性地分离出高纯度的BFU-e和CFU-e祖细胞。我们提出的新方法已通过单细胞RNA测序（scRNAseq）和细胞命运检测验证1,27，现在提供了实现这一目标的工具。
成功执行分选和分析方案的关键要点有若干。首先，细胞需以 900 x g 离心，以防止低密度细胞丢失。处于 CFU-e 阶段的许多细胞体积较大且密度较低，若不采取此措施则容易丢失。其次，在移液操作中上下吹打时，必须使用大孔径吸头，以帮助打散细胞聚集体，并防止脆弱的 P1 和 P2 细胞丢失。此步骤至关重要，因为许多 CFU-e 祖细胞与红细胞岛巨噬细胞（EBIs）相关联，若未能有效解离则会导致细胞丢失。第三，在染色前需用含 EDTA 的缓冲液（&#34;SB5&#34;）孵育细胞，以促进 EBIs 的解离。第四，在流式细胞术数据采集过程中，采集速率不应超过每秒 7,000 个事件，或不应超过所用流式细胞仪推荐的最大采集速率。
<p cla...

红细胞生成可分为两个主要阶段：早期红细胞生成和红系终末分化（图1)1,2,3在早期红细胞生成过程中，造血干细胞定向分化为红系谱系，并产生早期红系祖细胞，这些祖细胞于20世纪70年代首次被鉴定，其依据是在半固体培养基中形成集落的能力。4,5,6,7,8,9一般来说，红系祖细胞分为两类：较早期的祖细胞，每个都能产生一个 &#34;爆发&#34; （由多个较小的红系细胞簇聚集而成的大团块），称为 &#34;红系爆式集落形成单位&#34; 或BFU-e4,5,6；及其子代，每个子代形成一个单一的小型红系细胞簇或集落，称为 &#34;红系集落形成单位&#34; 或CFU-e7,8,9BFU-e 和 CFU-e 尚未表达终末红系基因，且在形态上无法识别。经过若干次自我更新或扩增性细胞分裂后，CFU-e 发生转录转换，诱导血红蛋白等红系基因表达，从而进入红系终末分化（ETD）。1,10在红系终末分化过程中，成红细胞会经历三到五次成熟性细胞分裂，随后脱核形成网织红细胞，后者进一步成熟为红细胞。
终末分化过程中的成红细胞最初根据形态学特征被分为原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多色性成红细胞和正色性成红细胞。流式细胞术的出现使得能够基于细胞大小（通过前向散射光，FSC测定）以及两种细胞表面标志物CD71和Ter119对这些细胞进行前瞻性分选与分离。11,12,13 (图1）。此类及类似的流式细胞术方法14 极大地推动了对红系终末分化（ETD）分子与细胞层面的研究，使得能够针对红细胞发育的特定阶段对成红细胞进行分析 体内 和 体外10,15,16,17,18,19,20CD71/Ter119 方法现已被常规用于红系前体细胞的分析。
直到最近，研究人员仍缺乏一种类似的、易于操作的流式细胞术方法，以直接、高纯度地前瞻性分离小鼠组织中的CFU-e和BFU-e。此前，研究人员所采用的流式细胞术策略仅能分离出这些前体细胞中的一部分，且常常伴随非红系细胞的共纯化，这些非红系细胞存在于相同的流式细胞术分群中。21因此，对BFU-e和CFU-e的研究仅限于 体外 从早期骨髓祖细胞中诱导并扩增BFU-e和CFU-e的分化系统。随后可在这些富集红系祖细胞的培养物中应用流式细胞术策略，以区分CFU-e与BFU-e22,23另一种方法利用胎儿期CFU-e和BFU-e，这些细胞在妊娠中期小鼠胎儿肝脏的Ter119阴性组分中高度富集10,24,25然而，这两种方法均无法对成人BFU-e和CFU-e在其生理状态下的特性进行研究 体内当回想起基于集落形成实验的结果时，便可理解这一挑战的难度：这些细胞在成年骨髓中的频率分别仅为0.025%和0.3%6.
本文所述方案是一种基于新鲜分离的小鼠骨髓Kit+细胞单细胞转录组分析的新型流式细胞术方法（Kit在骨髓所有早期前体细胞群体中均有表达）1。我们的方法包含了一些Pronk等人此前已使用过的细胞表面标志物21,26。通过单细胞转录组数据确定了能够识别红系及其他早期造血前体细胞的细胞表面标志物组合（图2）。具体而言，谱系阴性（Lin-）Kit+细胞中的CD55+组分可进一步划分为五个群体，其中三个群体对应红系发育轨迹的连续阶段（图2）。每个群体的转录组特征通过分选后进行单细胞RNA测序（scRNAseq），并将分选后的单细胞转录组数据投影回原始转录组图谱加以验证（可在 https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html 查阅这五个群体及整个骨髓数据集中各基因的表达情况）1。&#160;各群体的细胞命运潜能通过传统的集落形成实验（图2）以及一种新型高通量单细胞命运检测方法进行了验证1,27。这些分析表明，该新型流式细胞术方法可实现对新鲜成年小鼠骨髓和脾脏中所有BFU-e和CFU-e前体细胞的高纯度分离。具体而言，群体1（P1）仅包含CFU-e，不含其他造血前体细胞；群体2（P2）包含骨髓中全部的BFU-e前体细胞以及少量CFU-e，但无其他前体细胞1。下文详述的实验方案还以小鼠为例进行了说明，这些小鼠分别被注射了生理盐水或促红细胞生成素（Epo）。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L型大孔吸头</td><td>美国科学公司</td><td>1011-9000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记抗小鼠 CD55（DAF）抗体</td><td>BioLegend</td><td>131806</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 标记抗小鼠 CD117（c-kit）抗体</td><td>BioLegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>生物素-CD11b</td><td>BD 生物科学</td><td>557395</td><td>M1/70（克隆）</td></tr><tr><td>生物素-CD19</td><td>BD 生物科学</td><td>553784</td><td>1D3（克隆）</td></tr><tr><td>生物素-CD4</td><td>BD 生物科学</td><td>BDB553045</td><td>RM4-5（克隆）</td></tr><tr><td>生物素-CD8a</td><td>BD 生物科学</td><td>BDB553029</td><td>53-6.7（克隆）</td></tr><tr><td>生物素-F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>BM8（克隆）</td></tr><tr><td>Biotin-Ly-6G 和 Ly-6C</td><td>BD 生物科学</td><td>553125</td><td>RB6-8C5（克隆）</td></tr><tr><td>Biotin-TER-119</td><td>BD 生物科学</td><td>553672</td><td>TER-119（克隆）</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 抗人/小鼠 CD49f 抗体</td><td>BioLegend</td><td>313624</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD41 抗体</td><td>BioLegend</td><td>133921</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 抗小鼠 CD150（SLAM）抗体</td><td>BioLegend</td><td>115931</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 大鼠抗小鼠 TER-119/红系细胞</td><td>BD 生物科学</td><td>563827</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure 兔 IgG，全分子</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>用于 LSR II 的 Digital DIVA 硬件和软件</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 F4/80 抗体</td><td>BioLegend</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗 CD11b</td><td>BD 生物科学</td><td>557396</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗小鼠 CD19</td><td>BD 生物科学</td><td>553785</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗小鼠 CD4</td><td>BD 生物科学</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗小鼠 CD8a</td><td>BD 生物科学</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗小鼠 Ly-6G 和 LY-6C</td><td>BD 生物科学</td><td>553127</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件&amp;nbsp;</td><td>FlowJo</td><td>版本 10</td><td>流式细胞仪分析软件</td></tr><tr><td>LSR II 数字多参数流式细胞仪分析仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>流式细胞仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NewlineNY 不锈钢手动压碎器 &amp;研钵和研杵套装</td><td>亚马逊</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常大鼠血清</td><td>干细胞技术</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 CD105 抗体</td><td>BioLegend</td><td>120408</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗小鼠 CD71 抗体</td><td>BioLegend</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，10倍浓缩液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素纳米珠</td><td>BioLegend</td><td>480016</td><td>磁珠</td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

早期红系祖细胞最初是根据其集落形成潜能定义的 体外 并分为爆式集落形成和集落形成 &#34;单位&#34; 称为BFU-e和CFU-e。直到最近，仍缺乏能够直接、前瞻性地从新鲜分离的成年小鼠骨髓中完整分离出纯BFU-e和CFU-e前体细胞的方法。为填补这一空白，研究人员分析了小鼠骨髓的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，筛选编码细胞表面标志物的基因表达情况。该分析结合细胞命运测定实验，从而建立了一种新型流式细胞术方法，可识别并分离小鼠骨髓或脾脏中完整且纯净的BFU-e和CFU-e前体细胞亚群。该方法还可识别其他前体细胞亚群，包括富含嗜碱性粒细胞/肥大细胞潜能和巨核细胞潜能的亚群。该方法包括使用靶向Kit和CD55的抗体标记新鲜骨髓或脾脏细胞。表达这两种标志物的前体细胞进一步被划分为五个主要群体：群体1（P1或CFU-e，Kit+ CD55+ CD49f医学/低 CD105中/高 CD71中/高) 包含所有CFU-e祖细胞，可进一步细分为P1-低（CD71医学 CD150高）以及 P1-hi（CD71高 CD150低），分别对应早期和晚期CFU-e；群体2（P2或BFU-e，Kit+ CD55+ CD49f中/低 CD105中/高 CD71低 CD150高) 包含所有的BFU-e祖细胞；P3群（P3，Kit+ CD55+ CD49f中/高 CD105医学/低 CD150低 CD41低) 富含嗜碱性粒细胞/肥大细胞祖细胞；群体4（P4，Kit+ CD55+ CD49f中/高 CD105中/低 CD150高 CD41+) 富含巨核细胞祖细胞；而群体5（P5，Kit+ CD55+ CD49f中/高 CD105中/低 CD150高 CD41-) 包含具有红系、嗜碱性粒细胞/肥大细胞和巨核细胞潜能的前体细胞（EBMP），以及红系/巨核细胞/嗜碱性粒细胞偏向的多能前体细胞（MPPs）。这一新方法在分析红系及其他造血前体细胞时具有更高的精确性，并可对每一流式细胞术定义的细胞群体进行转录组信息的比对与参考。

本方案描述了一种通过流式细胞术鉴定 freshly harvested 骨髓和脾脏细胞中 BFU-es 和 CFU-es 的方法。首先从实验小鼠中获取新鲜的骨髓（BM）和脾脏组织，并立即将组织置于冰上。所有操作均在低温条件下进行，以维持细胞活性。细胞使用“谱系”（lineage）抗体混合物进行标记，从而排除所有表达已分化血液谱系标志物的细胞（在流式细胞术分析中使用 FITC 标记的 Lin 抗体混合物，见表3；或使用磁珠富集法获取谱系阴性细胞，见表4）。同时，细胞还使用针对特定标志物的抗体进行标记，以便在谱系阴性细胞组分中区分多种早期前体细胞群体。标记完成后，进行流式细胞术分选或分析。流式细胞术分选的方法与流式分析类似，但需先通过磁珠富集 Lin- 细胞组分，以减少分选大量细胞所需的时间和成本。在分选前体细胞时，骨髓样本通常来自多只小鼠，具体数量取决于后续实验用途。一般而言，来自总共10只小鼠的骨髓（约 1 × 109 个细胞）可分别获得至少 50,000 至 100,000 个 P1-hi、P1-low 和 P2 细胞群体，...

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。

早期红系祖细胞最初根据其在体外的集落形成潜能进行定义，并分为爆式集落形成单位和集落形成单位……

该方案可直接从新鲜获取的小鼠组织（如骨髓和脾脏）中鉴定并分离BFU-E和CFU-E红系祖细胞。利用此技术，我们能够分离出高纯度的红系祖细胞群体，而这是以往的流式细胞分析方案所无法实现的。该方法显著提升了我们研究红系疾病小鼠模型的能力，使祖细胞的分离可用于多种下游实验。首先，将新鲜解剖得到的股骨和胫骨直接放入冰冷的染色缓冲液（SB-5）中，并将离心管置于冰上，直至准备提取骨髓。将一个洁净且已灭菌的研钵置于装有冰的容器中，并将骨骼转移至研钵内。使用解剖剪剪去每根骨骼两端约1毫米的骨端。使用带有26号针头的3毫升注射器，吸入SB-5缓冲液，将骨髓从骨骼中冲洗出来，并收集至研钵中，每次使用新鲜缓冲液重复此操作3至5次，直至骨骼呈无色。将冲洗出的骨髓通过100微米细胞筛过滤，并将细胞收集到置于冰上的50毫升离心管中。接着，使用研钵和研杵在5至10毫升SB-5缓冲液中研磨已冲洗过的骨骼。将破碎的骨骼与缓冲液的混合物通过100微米细胞滤筛过滤，收集至先前已收集的细胞中。将100微米孔径滤网置于一个空的50毫升离心管上，并将离心管放置在冰上。将单个脾脏置于滤网之上，并向脾脏加入0.5至1毫升SB-5溶液，以确保其不干燥。使用3毫升或5毫升注射器活塞的橡胶端，将脾脏研磨通过滤网。每次加入5毫升SB-5，继续研磨，直至所有细胞均收集至离心管中。用大孔枪头吸取2毫升SB-5，将收集的细胞反复吹打，制备单细胞悬液。通过向FACS管中的细胞悬液加入除该FMO对应抗体外的所有抗体，来染色荧光减一（fluorescence minus one, FMO）对照。对于单色对照，向FACS管中的细胞悬液加入单一抗体。将每个对照管在3000 RPM下涡旋2至3秒，随后在4摄氏度避光条件下振荡孵育2.5小时。孵育结束后，用 SB-5 洗涤细胞，并用 SB-5 将细胞悬液体积补至 4 毫升。在 4 摄氏度下以 900 ×g 离心 10 分钟，吸除上清液。将未染色样本及所有单色对照重悬于 300 微升 SB-5 中，并通过 40 微米滤网过滤至新的 FACS 管中。通过将DAPI储备液以1:10,000的比例稀释于SB-5中，配制DAPI SB-5溶液。将FMOS重悬于1.8毫升DAPI SB-5中，单色DAPI对照重悬于300微升DAPI SB-5中，随后通过40微米滤网过滤至新的FACS管中。向每份样品中加入抗体主混合液后，以3000 rpm涡旋震荡2至3秒，随后在4摄氏度避光条件下于摇床上孵育2.5小时。按照先前演示的方法洗涤细胞后，将样品重悬于 1.8 毫升 DAPI SB-5 中，并通过 40 微米滤网过滤至新的 FACS 管中，然后使用流式细胞仪分析样品。利用前向散射根据细胞大小去除碎片，接着使用前向散射高度与前向散射面积的直方图排除细胞聚集体并选择单细胞。再利用侧向散射高度与侧向散射面积的直方图重复进行排除。通过排除DAPI阳性细胞来去除死细胞。选择谱系阴性、TUR one 19阴性、c-Kit阳性细胞。从这些细胞中再选出表达CD 55的亚群。根据CD49F和CD105的表达情况，将TUR阴性、19阴性、kit阴性、CD55阳性的谱系阴性细胞分为两个主要群体，即P6和P7。接着根据CD150和CD41的表达情况，进一步将P6细分为P3、P4和P5。类似地，根据CD150和CD71的表达情况，将P7进一步细分为BFU-E、早期CFU-E和晚期CFU-E。在本研究中，从新分离的骨髓和脾细胞中鉴定了爆式红系集落和集落形成单位。在小鼠接受促红细胞生成素或载体注射72小时后，促红细胞生成素刺激组在分离的骨髓和脾细胞中显示出早期和晚期集落形成单位群体P1低和P1高数量的扩增。骨髓和脾祖细胞对促红细胞生成素的体内反应也表明，与载体对照组相比，早期和晚期集落形成单位群体P1低和P1高中的细胞数量更多。在使用抗体标记细胞之前，最重要的是制备单细胞悬液。这可以通过反复吹打以及在缓冲液中添加EDTA来实现。纯化后的前体细胞可用于任何后续的细胞和分子分析。例如，单细胞转录组学、atesque、菌落实验和生物化学方法。该技术帮助我们验证了单细胞RNA测序实验中的预测结果。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

流式细胞术从小鼠组织中鉴定和分离爆破形成单元和集落形成单元红系祖细胞

一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠骨髓、脾脏或胎肝中鉴定和分析分化阶段特异性小鼠红系祖细胞和前体细胞的分子方法。该检测基于细胞表面标志物CD71、Ter119以及细胞大小。...

利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

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