Name: （poro-）弹性收缩肌动球蛋白网络作为细胞骨架模型系统的机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 了解多孔弹性肌动球蛋白凝胶的力学特性，用于细胞骨架模型研究。该方法通过体外重组技术揭示肌球蛋白收缩性与流体动力学的关系，无需复杂设备即可提取动态演化系统的机械特性。

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我们感谢Dina Aranovich在蛋白质纯化和标记方面的工作。G.L. 感谢以色列科学、技术与太空部提供的贾博廷斯基博士奖学金。A.B.G. 感谢以色列科学基金会（资助号：2101/20）以及以色列科学技术部（资助号：3-17491）提供的经费支持。

1. 玻璃表面处理与钝化：
注意：本节包括三个主要步骤（见图1）：(i) 清洗与亲水化处理，(ii) 硅烷化，以及 (iii) 表面钝化。
<ol>
	<li>清洗与亲水化
	<ol>
		<li>使用piranha溶液清洗玻璃表面。 
		注意：piranha溶液由30% H2O2 和70% H2SO4 组成（材料表）。其主要目的是去除盖玻片表面的有机污染物，并暴露玻璃表面的羟基（OH）基团。通过此方式，玻璃表面变为亲水性。</li>
		<li>将10–12片#1.5规格（22 mm × 22 mm）的玻璃盖玻片（材料表）放入自制的聚四氟乙烯支架中（底座面积：5.5 cm&#160;× 5.5 cm）。将该聚四氟乙烯支架转移至一个400 mL烧杯（材料表）中，并加入300 mL piranha溶液，于冰上并在通风橱中孵育2小时。 
		注意：固定在支架底座上的聚四氟乙烯杆长12 cm，比烧杯（11 cm）更长，便于安全地将支架浸入或取出piranha溶液。由于piranha溶液仍可能具有高度反应性并产生大量热量，必须彻底终止反应。最简便的终止方法是将piranha溶液倒入（自来水）水中，实现至少50倍稀释。此后溶液可安全废弃。切勿将使用过的piranha溶液储存在密闭玻璃瓶中——可能导致瓶子爆炸。</li>
		<li>将聚四氟乙烯支架转移至一个盛有新鲜双蒸水（DDW）的洁净烧杯中，以洗去盖玻片上残留的piranha溶液。</li>
		<li>将烧杯放入超声波清洗仪（材料表）中，在25 °C下以80 Hz全功率超声处理10分钟。使用新鲜双蒸水重复此步骤两次，每次均需更换新鲜双蒸水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>硅烷化
	<ol>
		<li>将支架转移至一个洁净的400 mL烧杯中，烧杯内盛有300 mL纯甲醇（材料表），随后将烧杯放入超声波清洗仪（材料表）中，在25 °C下以80 Hz全功率超声处理30分钟。</li>
		<li>超声处理后，将支架转移至硅烷溶液中。硅烷溶液的配制方法为：15 mL双蒸水、3.1 mL乙酸（材料表）、340 mL甲醇和7.6 mL硅烷（(3-巯丙基)三甲氧基硅烷）（材料表）。用封口膜密封烧杯，并于4 °C冰箱中静置过夜。 
		注意：硅烷溶液的配制和操作必须在通风橱中进行。硅烷化步骤完成后，将使用过的硅烷溶液（废液）倒入通风橱内专用的玻璃瓶中。</li>
		<li>次日，将支架短暂（15秒）转移至一个盛有300 mL纯甲醇的洁净烧杯中。随后，在擦干聚四氟乙烯支架底部以去除多余甲醇后，将支架转移至另一个洁净烧杯中，并将烧杯放入烘箱（材料表）中，在120 °C下干燥5分钟，以干燥玻璃盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用惰性聚合物进行表面钝化
	<ol>
		<li>通过将玻璃盖玻片与惰性聚合物孵育实现表面钝化（材料表）。每次实验取两片盖玻片，置于一个预先用乙醇（EtOH）清洗过的含聚四氟乙烯膜（parafilm）涂层的培养皿中（DDW/EtOH：30/70 体积比）（材料表）。</li>
		<li>每片盖玻片加入1 mL浓度为4 mg·mL−1、分子量为5 kDa的甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺（mPEG-mal，Mw = 5 kDa）（材料表）溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）（材料表）的溶液，在22 °C下孵育1小时。 
		注意：将盖玻片置于疏水性聚四氟乙烯膜层上，可使亲水性的PEG聚合物溶液局限于玻璃盖玻片表面。孵育时间对实现最佳钝化效果至关重要。建议孵育时间控制在45分钟至2小时之间。超过此时间可能导致玻璃盖玻片表面劣化，引起蛋白质吸附并降低透明度。</li>
		<li>孵育结束后，每片盖玻片用5 mL双蒸水冲洗，并用氮气（N2）气流吹干。切勿在真空条件下干燥。由于钝化后的盖玻片必须保持湿润，应立即在PEG修饰的表面加入1 mL 10 mM Tris缓冲液。处理后的盖玻片需在2小时内使用。 
		&#8203;注意：所有操作步骤均应在超净工作台中进行，以防止玻璃表面污染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质纯化
<ol>
	<li>使用凝胶过滤法从兔骨骼肌丙酮粉中纯化G-actin24.
	<ol>
		<li>肌动蛋白纯化需要1周时间。将纯化的G-actin保存在G缓冲液（5 mM Tris pH 7.8，0.01% NaN3，0.1 mM CaCl2，0.2 mM ATP，和 1 mM DTT），置于冰上保存，并在2周内使用。 
		注意：每隔几天更换一次冰。</li>
		<li>用马来酰亚胺修饰的荧光染料标记肌动蛋白16 (材料清单）。根据 Ono 等人的方法纯化 GST-fascin。25. 将两种蛋白质在液氮中快速冷冻2，并于 −80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用标准方案从兔骨骼肌中纯化肌球蛋白II26纯化的肌球蛋白II（二聚体）储存缓冲液包含10 mM Tris（pH 7.4）、0.5 M KCl和35% w/v蔗糖。将肌球蛋白在液氮中速冻2，并于 −80 °C 保存。 
	注意：高浓度 KCl 可保持肌球蛋白马达的二聚体形式，而高浓度蔗糖可确保马达在冷冻过程中活性不受影响。处理肌球蛋白 II 储存液时，应使用专用于黏稠液体操作的移液器。材料表).
	<ol>
		<li>用荧光染料标记肌球蛋白 II 二聚体（材料表在成对的工程化半胱氨酸残基处19,27使用鸡胃肌胃轻链突变体A来实现该目的26. 将标记的肌球蛋白 II 在液氮中快速冷冻2，并于 −80 °C 保存。 
		注意：该标记程序可确保标记后的肌球蛋白保持与天然肌球蛋白II蛋白相同的活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计（UV-Vis spectrophotometer）材料表）测定储备蛋白溶液的吸光度，并利用以下消光系数通过比尔-朗伯定律推算蛋白浓度：G-actin（ε290 = 26,460 M−1·cm−1），GST-束蛋白（ε280 = 99,330 M−1·cm−1），肌球蛋白II二聚体（ε280 = 268,800 M−1·cm−1）和 RLC 突变体 A（ε280 = 3,960 M−1·cm−1)19.</li>
</ol>
3. 样品制备
注意：在大量肌球蛋白II马达和强被动交联蛋白fascin存在的条件下，使肌动蛋白单体聚合，以形成宏观上可收缩的弹性肌动蛋白-肌球蛋白网络19,23。向溶液中添加荧光微球可用于追踪凝胶收缩过程中的溶剂流动。
<ol>
	<li>蛋白质（&#34;肌动球蛋白&#34;）溶液
	<ol>
		<li>除G-actin外，其余蛋白质均以小份分装后于−80°C保存，使用前在37°C解冻。肌动球蛋白溶液的总体积为40 µL。</li>
		<li>将10 mM Tris（pH 7.4）与2 mM MgCl混合，配制溶液2，25 mM KCl，1 mM ATP，ATP再生系统（0.5 mg·mL−1 肌酸激酶和5 mM 磷酸肌酸），200 µM EGTA（螯合Ca）2+ 离子）、抗淬灭溶液（0.1 mg·mL⁻¹）−1 葡萄糖氧化酶，0.018 mg·mL−1 过氧化氢酶，以及 5 mg·mL−1 葡萄糖）、5 µM G-肌动蛋白、280 nM GST-束蛋白和1.67 nM 肌球蛋白II。标记的G-肌动蛋白比例为5%（摩尔百分比）。 
		注意：使用低比例的标记G-actin，以避免在凝胶收缩的后期阶段荧光信号饱和。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备肌球蛋白II分子马达聚集体
	<ol>
		<li>将肌球蛋白马达以聚集体的形式加入蛋白溶液中。为形成较大的肌球蛋白聚集体（每个聚集体含150个肌球蛋白二聚体），用10 mM Tris pH 7.4稀释肌球蛋白储备液，使终浓度为25 mM KCl。</li>
		<li>将稀释后的肌球蛋白溶液在室温（RT）下放置10分钟，然后转移至冰上待用。马达蛋白在2小时内保持完全活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量溶剂流动
	<ol>
		<li>为了追踪溶剂在凝胶孔隙中的流动，将荧光微球加入肌动球蛋白溶液中。通过钝化微球以减少微球与肌动球蛋白网络之间的相互作用。实际操作中，将1 µL微球（材料表) 与5 µM G-actin在室温下孵育20分钟，然后通过离心去除多余的G-actin（材料表)（条件：6,000 × g 4 °C下离心5分钟。</li>
		<li>用10 mg·mL重复此步骤−1 牛血清白蛋白（BSA）（材料表) 以封闭（可能存在的）未包被表面。实验中使用微球的终浓度为1:10,000（体积比）。 
		注意：必须根据凝胶孔径调整微珠的直径，使微珠与孔径的尺寸比为 &#60;1 在所有阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶液黏度的影响
	<ol>
		<li>通过添加甘油来控制溶液的黏度（材料表)加入到肌动球蛋白溶液中。按重量百分比从0%到34%添加甘油，可诱导溶液黏度相应增加，从 ηω 至 2.76 ηω，其中 ηω&#160;是20 °C时水的黏度28. 
		&#8203;注意：在处理甘油时，必须使用专用于粘稠液体操作的移液器材料表).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 运行实验
<ol>
	<li>自制样品台操作
	<ol>
		<li>取一片PEG钝化的盖玻片，将其上放置涂有润滑剂的Parafilm间隔片，然后放入样品台中。 
		注意：可用任意间隔物替代Parafilm间隔片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备肌动球蛋白溶液
	<ol>
		<li>在冰上使用微量离心管配制肌动球蛋白溶液，依次加入各种显微组分，再加入II型肌球蛋白马达聚集体，最后加入EGTA。充分混匀溶液。EGTA的加入会启动肌动球蛋白网络的聚合反应，标志着实验的起始时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取1.1 µL上述溶液滴加至安装在样品台上的盖玻片上，再将第二片盖玻片覆盖其上。旋紧样品台以密封样品。此过程会轻微挤压液滴，使其呈圆盘状。液滴直径范围为2,800–3,000 µm。</li>
	<li>将样品台置于显微镜载物台上并开始图像采集。应提前准备好显微镜，以缩短初始采集时间。通常在溶液混合后1–2分钟内开始样品成像。</li>
</ol>
5. 显微镜技术
<ol>
	<li>使用倒置荧光显微镜（材料表）并由专用软件（材料表）控制对样品进行成像。
	<ol>
		<li>采用2.5倍/0.075 Plan-NEOFLUAR物镜（材料表）的低倍率观察整个凝胶区域，并随时间追踪其宏观收缩情况。</li>
		<li>使用10倍/0.3 Ph1 UPlanFL物镜（材料表）表征网络孔隙率和结构，并随时间观察网络的自组织和收缩过程。 
		注：该物镜还可用于定位网络中的肌球蛋白II分子马达聚集体，并追踪荧光微珠在凝胶孔隙中的运动。更高倍率的物镜虽可使用，但会牺牲视野范围，这一限制在双色成像模式下尤为明显（材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在488 nm（肌动蛋白/荧光微珠）和561 nm（肌球蛋白马达聚集体/荧光微珠）波长下激发样品。使用专用软件（材料表）和电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机（材料表），以每帧100 ms的速度在流式模式下采集图像。 
	注：荧光灯（材料表）的强度应保持在尽可能低的水平，以避免网络收缩过程中信号饱和。</li>
	<li>同步双色成像
	<ol>
		<li>该模式用于两个目的：(i) 检测肌球蛋白马达聚集体在肌动蛋白网络中的定位；(ii) 表征网络收缩过程中内部和外部的溶剂外向流动。</li>
		<li>分别在488 nm和561 nm波长下激发肌动蛋白和肌球蛋白II马达，并使用双发射装置（材料表）在EMCCD相机（材料表）上同步记录图像。使用相同的成像系统同时对肌动蛋白凝胶（488 nm）和荧光微珠（561 nm）进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文采用一种体外方法，将多孔弹性肌动球蛋白凝胶作为细胞骨架的模型系统，更广义地说，也作为细胞质的模型系统进行力学特性表征，已有研究表明细胞质表现出多孔弹性材料的性质3,5。细胞骨架（细胞质）的流变学特性可通过一个孔弹性扩散常数来描述，该常数决定了在施加机械应力后，细胞内胞质液体在细胞内重新分布所需的时间。已有研究提出，细胞可利用这一机制来调控其形态5。
受这些发现的启发，我们开发了一个用于研究多孔弹性力学的框架 体外利用所提出的模型系统，我们揭示了肌球蛋白收缩性如何促进流体流动的产生，以及网络速度与溶剂速度的方向性和速率在时间和空间上的相关性。由此，我们证明了网络结构与其嵌入的溶剂相互关联，不能被视为彼此独立的实体。我们描述了实验装置，并提供了凝胶制备及实验操作的详细方案。同时，本文还提出了数据定量分析的完整框架。所提出的分析框架可轻松适用于多种实验装置和系统中的多孔弹性研究，不受具...

活细胞具有独特的力学特性。除了能够被动地响应外加力之外，它们还能主动产生力以应对外部刺激1。这些特性在多种细胞过程中至关重要，尤其是在细胞运动期间，主要归因于细胞骨架的力学和动态特性，特别是肌动球蛋白细胞骨架。肌动球蛋白细胞骨架是由极性肌动蛋白丝、肌球蛋白分子马达以及辅助蛋白组成的活性凝胶。这些肌动球蛋白网络表现出由肌球蛋白马达蛋白驱动的内在自组织和收缩特性，肌球蛋白通过交联肌动蛋白丝并利用ATP水解提供的能量在网络中主动产生机械应力2。
已有大量实验和理论研究用于探究细胞骨架的材料特性3。目前普遍接受的观点是，细胞骨架表现出黏弹性材料的性质4。这意味着在较短的时间尺度上，细胞骨架表现为弹性材料；而在较长的时间尺度上，由于交联蛋白以及肌球蛋白马达的解离（和重新结合），网络结构能够动态更新，因而表现为黏性流体。然而在许多情况下，黏弹性模型无法解释实验结果，这些结果更符合一种将细胞骨架、更广义地说是细胞质，描述为一种具有活性的孔弹性材料的观点5,6。这类材料具有两个主要特征。（i）第一个主要特征是由肌球蛋白马达驱动的收缩力梯度，引起细胞溶质（即&#34;溶剂&#34;）在凝胶孔隙中的流动，这一过程是细胞出泡7、运动性8和细胞形态振荡9等现象的基础。这种细胞溶质流动可以是局部的（如出泡过程），也可以是全局性的（如细胞运动）。在后一种情况下，细胞后部施加的收缩应力驱动细胞溶质流体向前端流动，从而补充形成片状伪足所需的蛋白质库8。（ii）第二个主要特征是应力的松弛过程具有扩散性，并由一个有效扩散常数表征，该常数取决于凝胶的弹性模量、孔隙率以及溶剂的黏度5。孔弹性扩散常数决定了系统对外加应力的响应速度：扩散常数越大，应力重新分布越快。这反过来决定了在受到外部或内部机械应力（例如由肌球蛋白马达产生的主动收缩应力）作用后，细胞内细胞溶质流体在细胞内重新分布所需的时间。因此，这些例子表明，细胞骨架与细胞溶质的力学行为是紧密耦合的，不能被单独处理3。
由于细胞可以通过多种方式调控其力学特性，网络力学与流体流动动力学之间的相互作用仍然 poorly understood。一种强有力的替代方法是使用体外重建系统（in vitro reconstituted systems），该系统可完全控制各种微观组分和系统参数，从而使这些模型系统成为物理分析的理想选择10,11。该方法已被成功用于研究蛋白质组成和系统几何结构对基于肌动蛋白的运动性的影响12,13,14,15,16,17,18、肌球蛋白-肌动蛋白网络的二维图案形成19,20,21,22，以及多孔弹性肌动蛋白-肌球蛋白凝胶中网络收缩性与流体流动动力学之间的相互作用，后者是本文的研究重点23。
本文基于 Ideses 等人的研究23，讨论了可调控尺寸和材料特性的收缩性弹性肌动蛋白-肌球蛋白网络的制备方法。通过分析和量化凝胶收缩过程中的动力学行为以及溶剂的流动情况，证明了这些肌动蛋白-肌球蛋白凝胶可被描述为一种多孔弹性活性材料。进一步研究溶剂黏度对应力扩散性的影响，证实了这些网络的多孔弹性特性。文中提供了用于数据量化的各种标度关系。最后，还讨论了实验中的挑战、常见误区，以及实验结果与细胞骨架的相关性。

<table><tbody><tr><td>(3-巯丙基)三甲氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>175617</td><td>在氩气氛围下储存于 4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Bio-Lab 有限公司</td><td>1070521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogene</td><td>A10254</td><td>用 DMSO 稀释，在氩气氛围下储存于 -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647</td><td>Invitrogene</td><td>A20347</td><td>用 DMSO 稀释，在氩气氛围下储存于 -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>A3059</td><td>储存于 4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>C9322</td><td>原装瓶在干燥环境（硅胶）中于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Mezel-glaser</td><td>CG2222-1.5</td><td>经 Piranha 溶液处理后保存于 milliQ 水中，3 周内使用</td></tr><tr><td>肌酸激酶</td><td>Roche 生命科学产品</td><td>10736988001</td><td>用甘氨酸缓冲液新鲜配制，置于冰上，3 天内使用。&amp;nbsp; 原装瓶在干燥环境（硅胶）中于 4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Roche 生命科学产品</td><td>10621714001</td><td>溶解后应于 -20 &amp;deg;C 保存，3 个月内使用。原装瓶在氩气氛围下于 4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Roche 生命科学产品</td><td>10708984001</td><td>溶解后应于 -20 &amp;deg;C 保存，3 个月内使用</td></tr><tr><td>双通道同步成像系统&amp;nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>DV2-CUBE</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>195174</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD 相机</td><td>Andor Technology Ltd</td><td>DV 887</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD 相机</td><td>Photometrics</td><td>Evolve Delta</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Bio-Lab 有限公司</td><td>525050300</td><td></td></tr><tr><td>荧光灯</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG 微球</td><td>Polysciences</td><td>17151-10</td><td>直径 200 nm</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>194024</td><td>溶解后应于 -20 &amp;deg;C 保存，3 个月内使用。</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>G7141</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C，3 个月内使用。原装粉末在氩气氛围下于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>甘油</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>800687</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>MP Biomedicals</td><td>808822</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>216763</td><td>储存于 4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Bio-Lab 有限公司</td><td>1368052100</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI3000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-5k&amp;nbsp;</td><td>分子量 = 5000 Da。按重量分装成小批次。在氩气氛围下于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>尼罗红微球</td><td>Spherotech</td><td>FP-2056-2&amp;nbsp;</td><td>直径 2300 nm</td></tr><tr><td>物镜 (10x)</td><td>Leica 德国</td><td>HC PL AP0</td><td>UPlanFL 数值孔径 = 0.3</td></tr><tr><td>物镜 (2.5x)</td><td>Leica 德国</td><td>506304</td><td>&amp;nbsp;Plan-NEOFLUAR 数值孔径 = 0.075</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>WTC Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>快门驱动器</td><td>Vincet Associates</td><td>VMM D1</td><td></td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Merck</td><td>1.01907.5000</td><td></td></tr><tr><td>超声仪</td><td>Elma</td><td>Elmasonic P</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Carlo Erba 试剂</td><td>410301</td><td></td></tr><tr><td>DV2 双通道同步成像系统</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Pharmacia</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td>1&amp;ndash;10 μL</td></tr><tr><td>MATLAB R2017b</td><td>MathWorks</td><td></td><td>数据量化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MetaMorph&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>光学成像系统的控制软件；数据量化（颗粒追踪分析、网络网格尺寸）</td></tr></tbody></table>

用于模拟细胞骨架的（多孔）弹性收缩性肌动球蛋白网络的力学特性

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

细胞能够主动改变其形状并获得运动能力，这一特性依赖于其内部结构的主动重组能力。该特性主要归因于细胞骨架，特别是肌动球蛋白细胞骨架所具有的力学与动态特性。肌动球蛋白细胞骨架是一种由极性肌动蛋白丝、肌球蛋白马达蛋白及辅助蛋白组成的活性凝胶，具有内在的收缩特性。通常认为，细胞骨架表现为一种黏弹性材料。然而，这一模型并不总能解释实验结果，而这些结果更符合将细胞骨架描述为一种多孔弹性活性材料——即嵌入细胞质溶胶的弹性网络。肌球蛋白马达产生的收缩力梯度驱动细胞质溶胶在凝胶孔隙中的流动，表明细胞骨架的力学特性与细胞质溶胶的流动动力学紧密耦合。多孔弹性的一个主要特征是网络中应力的扩散弛豫，其特征为一个有效扩散系数，该系数取决于凝胶的弹性模量、孔隙率以及细胞质溶胶（溶剂）的黏度。由于细胞具有多种调控其结构与材料特性的途径，目前对于细胞骨架力学与细胞质溶胶流动动力学如何耦合的理解仍然十分有限。本文介绍了一种 体外 采用重组方法来表征多孔弹性肌动球蛋白凝胶的材料特性，以此作为细胞骨架的模型系统。凝胶的收缩由肌球蛋白马达的收缩力驱动，从而引发渗透溶剂的流动。本文描述了此类凝胶的制备方法及实验操作流程，并讨论如何在局部和整体尺度上测量与分析溶剂流动和凝胶收缩。文中给出了用于数据量化的各种标度关系。最后，探讨了实验中的常见挑战与潜在误区，及其对细胞骨架力学研究的相关性。

每次实验使用两片玻璃盖玻片。玻璃盖玻片需经过清洗并用聚乙二醇（PEG）聚合物进行钝化处理。钝化对于防止可溶性蛋白质在实验早期阶段黏附于玻璃表面，以及最小化收缩网络与玻璃壁之间的相互作用至关重要。若钝化效果不佳，可能导致网络收缩效率低下，甚至在极端情况下抑制肌动蛋白网络的形成。
图1&#160;描述了表面处理过程的三个主要步骤。这些步骤包括：（i）使用Piranha溶液进行表面清洗和亲水化处理，以去除盖玻片表面的有机污染物，并暴露玻璃表面的OH基团；（ii）使用（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane）进行表面硅烷化，旨在将硅烷共价结合到玻璃表面，使每个硅烷分子末端带有SH基团；（iii）用PEG聚合物（mPEG-mal，5 kDa）进行钝化处理——在此步骤中，PEG聚合物的马来酰亚胺基团与（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷上的SH基团发生共价反应，从而在玻璃表面形成一层PEG单分子层。
进行Piranha处理和硅烷化...

在此工作中，一个 体外 采用重建方法在受控条件下研究肌动球蛋白凝胶的多孔弹性。通过量化肌动球蛋白凝胶及其嵌入溶剂的动力学行为，揭示了网络的多孔弹性特性。我们还讨论了实验中的挑战、常见误区及其与细胞骨架力学的相关性。

细胞能够主动改变其形状并获得运动能力，这一特性依赖于其主动重组内部结构的能力。

我们开发了一种体外方法，用于表征类细胞骨架（更广泛地说，细胞质）的多孔弹性肌动球蛋白凝胶的力学特性，此类系统已被证实具有多孔弹性活性材料的行为。该方法有助于揭示肌球蛋白收缩性如何促成流体流动的产生，以及网络结构与胞质溶胶速度在时间和空间上的相关性。这种简单的方法使我们能够在无需使用复杂设备或技术的情况下，提取动态演化系统的力学性质，尤其适用于原子力显微镜（AFIM）等传统工具无法应用的场景。该方法可深入了解多孔弹性活性材料的流变学特性，而无需考虑活性凝胶和嵌入流体的具体类型。首先，将10至12个1.5号玻璃盖玻片放入自制的聚四氟乙烯支架中，并在400毫升烧杯中配制Piranha溶液。在冰上于化学通风橱中配制该溶液。将支架转移至盛有Piranha溶液的烧杯中。三小时后，将支架转移至一个洁净的烧杯中，烧杯内装有新鲜的重蒸水，以洗去盖玻片上残留的Piranha溶液，随后将烧杯放入超声波清洗仪中，在80赫兹、全功率条件下于25摄氏度超声处理10分钟。用新鲜的重蒸水重复此步骤两次。对于硅烷化处理，将载具转移至一个盛有300毫升纯甲醇的洁净烧杯中，随后放入超声波清洗仪中超声处理30分钟。然后将载具转移至硅烷溶液中。用封口膜密封烧杯，并于4摄氏度冰箱中静置过夜。第二天，将载具转移至一个盛有300毫升纯甲醇的洁净烧杯中，浸泡15秒。擦干载具底部以去除多余的甲醇，然后将其转移至另一个洁净烧杯中。随后将烧杯放入烘箱，在120摄氏度下干燥玻璃盖玻片5分钟。为实现表面钝化，每次实验取两张盖玻片，放入已用乙醇清洁过的涂有帕拉膜（parafilm）层的培养皿中。将每张盖玻片与一毫升甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺溶于1X PBS的溶液在22摄氏度下孵育一小时。孵育结束后，倾斜培养皿以去除溶液并进行peg化处理。用五毫升双蒸水冲洗每张盖玻片，并用氮气流吹干。由于盖玻片在钝化后必须保持湿润，立即在聚乙二醇化表面加入一毫升十毫摩尔Tris溶液，并在两小时内使用盖玻片。为形成较大的肌球蛋白聚集体，用十毫摩尔Tris溶液稀释肌球蛋白储备液，使终浓度达到二十五毫摩尔氯化钾。将稀释后的肌球蛋白溶液在室温下放置10分钟，然后转移至冰上直至使用。马达分子在两小时内保持完全活性。为追踪溶剂在凝胶孔隙中的流动，需制备钝化的荧光微球，并通过将1微升微球与5微摩尔G-肌动蛋白孵育20分钟，以减少微球与肌动蛋白-肌球蛋白网络之间的相互作用。通过离心去除多余的G-肌动蛋白。用10毫克/毫升的牛血清白蛋白重复此步骤，以封闭剩余的未包被表面，并在实验中将珠子以1:10,000的终浓度使用。为制备肌动球蛋白溶液，将储存于-80摄氏度的蛋白质等分试样解冻并置于冰上。然后配制溶液，使其终浓度为 10 毫摩尔 Tris、5 微摩尔 G-肌动蛋白、280 纳摩尔 GST Fascin 和 1.67 纳摩尔肌球蛋白 II。取一片聚乙二醇钝

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

（poro-）弹性收缩肌动球蛋白网络作为细胞骨架模型系统的机制

利用光镊探测肌球蛋白在肌动蛋白细丝束中的集合力学行为

差分动态显微镜（DDM）结合了动态光散射和显微镜技术的特点。本文介绍了利用DDM通过量化波形蛋白网络中粒子的亚扩散和受限运动，以及活性肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管复合物的弹道运动，来表征重建细胞骨架网络的过程。...

使用差分动态显微镜定量细胞骨架动力学

本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。...

在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

在本文中，我们展示了将F-肌动蛋白细胞骨架包封进巨大单层脂质囊泡（也称为脂质体）的实验技术，以及在脂质体膜内小叶形成模拟细胞皮层的F-肌动蛋白层的方法。...

体外 在巨大单层囊泡内重建肌动蛋白细胞骨架

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。...

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

肌球蛋白收缩力在细胞和组织形态发生中起着重要作用。然而，调控肌动球蛋白收缩力具有挑战性 体内 急性地。本方案描述了一种光遗传学系统，可快速抑制由 Rho1 介导的肌动球蛋白收缩力 果蝇 胚胎，揭示肌动球蛋白失活后上皮张力的立即丧失 体内.

光遗传学抑制Rho1介导的肌动球蛋白收缩力并结合上皮张力测量 黑腹果蝇 胚胎

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。...

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

本方案描述了一种可调节的肌动蛋白彗尾珠运动性实验，用于定量研究肌球蛋白马达活性如何影响类膜界面上的分支肌动蛋白组装及网络结构。...

在基于微珠的肌动蛋白彗尾运动性实验中重建肌球蛋白-I介导的分支肌动蛋白组装

传统的二维细胞培养技术通常会导致分化标志物、细胞因子和生长因子等特性的改变。在旋转细胞培养系统（RCCS）中进行三维细胞培养可重建许多此类因子的表达，本文以绒毛外滋养层细胞系为例展示了这一效果。...

用于人类细胞培养的旋转细胞培养系统：以人类滋养层细胞为模型

我们优化了一种微胶囊化技术，作为胚胎干细胞向内胚层和多巴胺能（DA）神经元增殖与分化的有效三维平台。该技术还可在细胞移植过程中实现细胞与宿主之间的免疫隔离。此平台也可适用于其他类型的细胞。...

海藻酸盐微胶囊作为人胚胎干细胞（hESC）向不同谱系扩增与分化的三维平台

了解多孔弹性肌动球蛋白凝胶的力学特性，用于细胞骨架模型研究。该方法通过体外重组技术揭示肌球蛋白收缩性与流体动力学的关系，无需复杂设备即可提取动态演化系统的机械特性。

用于模拟细胞骨架的（多孔）弹性收缩性肌动球蛋白网络的力学特性

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