Name: 斑马鱼动物模型，用于研究对蜱唾液生物分子的过敏反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 了解利用斑马鱼模型研究蜱唾液生物分子引发的过敏反应机制。该方法通过注射蜱唾液和α-Gal，结合行为学观察与分子检测，揭示α-Gal综合征的免疫机制，为过敏性疾病治疗提供新思路。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢SaBio研究团队在实验设计以及鱼类实验设施技术协助方面的合作，感谢Juan Galcerán Sáez（IN-CSIC-UMH，西班牙）提供斑马鱼。本研究由西班牙科学与创新部/国家研究机构MCIN/AEI/10.13039/501100011033以及欧盟区域发展基金（EU-FEDER）资助（项目号BIOGAL PID2020-116761GB-I00）。Marinela Contreras由西班牙科学、创新与大学部资助（项目号IJC2020-042710-I）。

本研究所述所有方法均已获得卡斯蒂利亚-拉曼查大学动物实验伦理委员会批准，研究编号为 &#34;斑马鱼模型中灭活 M. bovis 疫苗免疫应答及 M. marinum 攻毒试验评估，编号 PR-2017-05-12&#34;。
蜱虫取自实验室种群，该种群中的代表性蜱虫样本通过PCR检测常见的蜱传病原体，以确认无病原体存在，并饲养于捷克科学院生物中心寄生虫研究所（IP BC CAS），捷克共和国。所有动物实验均依照捷克共和国第246/1992号动物保护法（伦理批准编号34/2018）进行。
1. 斑马鱼处理
注意：本试验旨在评估斑马鱼在摄入哺乳动物肉类后，对蜱虫唾液处理所引发的过敏反应及免疫应答。
<ol>
	<li>用蜱虫唾液处理鱼类（如第4节所述），使用商品化的Gala1-3Gal-BSA 3（α-Gal）（见材料表）作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照。成年斑马鱼被随机分为三个性别均衡的组（图1）。 
	注意：任何其他与AGS相关的化合物均可通过此模型进行评估。</li>
</ol>
2. &#8203; Ixodes ricinus 蜱虫唾液提取
<ol>
	<li>使用在豚鼠身上吸血6-7天的半饱血、无病原体的雌性蜱虫。</li>
	<li>用50 µL注射器（配0.33 mm针头）将5 µL浓度为2% (wt/vol) 的盐酸匹鲁卡品PBS溶液（pH 7.4）注入蜱虫血腔（参见材料表），以诱导蜱虫分泌唾液，方法如前所述28。 
	注意：使用镊子操作蜱虫时应小心，避免夹持时用力过大。</li>
	<li>使用装在移液器上的10 µL吸头收集唾液。
	<ol>
		<li>小心将吸头插入蜱虫的口下片内。</li>
		<li>将收集的唾液置于冰上的1.5 mL离心管中，合并样本后于-80 °C保存，方法如前所述27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用BCA蛋白检测试剂盒（参见材料表），按照制造商说明测定唾液中的蛋白浓度，以确定参照既往研究27注入鱼类的蛋白量。</li>
</ol>
3. 斑马鱼的维护
<ol>
	<li>将斑马鱼饲养于循环水系统中，水温维持在 27 °C，光照周期为 14 小时光照/10 小时黑暗（图 2）。</li>
	<li>每天于上午 9:30 和下午 1:30 两次投喂干鱼饲料（每尾鱼 50–70 μg），持续至第 2 天。</li>
	<li>自处理注射后的第 2 天起，直至实验结束，每天于上午 9:30 和下午 1:30 两次投喂干狗粮（每尾鱼 50–70 μg）。</li>
</ol>
4. 斑马鱼显微注射
<ol>
	<li>每组选取10条鱼，雌雄比例相近，体重相似。 
	注意：第1组为注射PBS的鱼，第2组为注射蜱唾液的鱼，第3组为注射α-Gal的鱼。</li>
	<li>将鱼短暂浸入0.02%三卡因甲磺酸盐（MS-222）中进行麻醉（视频 1). 
	注意：正确麻醉的鱼应表现出正常的呼吸且无游泳行为，可能位于水箱底部或漂浮于水中。每条鱼必须单独进行麻醉，以避免可能的生理损伤。</li>
	<li>使用渔网捕获麻醉后的鱼。</li>
	<li>用镊子或手小心地将鱼置于湿润的海绵上，使其侧卧，尾鳍朝向右侧，以便沿同一方向注射化合物，从而控制病灶位置。</li>
	<li>按照之前的研究方法，对鱼群进行皮内注射26，在距尾鳍5 mm处的肌肉中，与鱼体成45°角视频 2）。按照之前所述，在第0、3和8天使用相应的处理方法27&#160;使用装有1 cm、29 G针头的100 µL注射器，加入1 µL（含9 µg/µL蛋白）的样品 I. ricinus PBS（磷酸盐缓冲液）10 µL 中的唾液（蜱虫唾液）、PBS 10 µL 中的 5 µg α-半乳糖（α-Gal）27,&#160;和 10 µL 的 PBS（图3). 
	注意：操作必须迅速且小心，以避免对动物造成任何物理损伤。 
	蜱唾液中的其他生物分子可依据本方案进行评估。</li>
	<li>将处理后的鱼放回不含麻醉剂的淡水水族箱中进行恢复。 
	&#8203;注意：同一组的所有鱼可置于同一水族箱中进行恢复。</li>
</ol>
5. 斑马鱼喂养
<ol>
	<li>用研钵和研杵将狗粮捣碎。</li>
	<li>每天上午9:30和下午1:30，每条鱼喂食50–70 μg干鱼饲料，每日两次，持续至第2天。</li>
	<li>从处理注射后的第2天起，每天上午9:30和下午1:30，每条鱼喂食50–70 μg捣碎的狗粮，每日两次，直至第8天实验结束。 
	&#8203;注意：若需评估不同接种期间对处理或饲料所引起的α-Gal或IgE抗体的免疫标志物或抗体滴度，则喂食需持续至实验结束。</li>
</ol>
6. 斑马鱼过敏反应、病变及行为的评估
<ol>
	<li>使用放大镜或体视显微镜准确观察出血型过敏反应（皮肤发红、变色和出血），并根据表1中的分类标注其在鱼体上的出现位置（图4A）。 
	注意：在注射蜱唾液并摄入含红肉饲料后，图4中所示的过敏反应出现。因此，所描述的反应类型与α-半乳糖综合征（AGS）相关的反应一致，因为在临床环境中也会出现类似的反应。
	<ol>
		<li>在每天两次投喂期间，观察鱼类在水箱中是否在处理后出现任何反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过评估游泳模式的变化27（活动性、速度、静止于水箱底部、之字形游泳）来检查鱼类行为，并依据表1中的分类进行判断。</li>
	<li>评估累积死亡率，记录死亡鱼的数量及死亡时间/日期（图4B）。 
	注意：所有参数均在处理后或更换饲料后立即开始评估，并每日持续观察，直至第8天实验结束，期间对定性变量进行分类（表1）。建议由具备斑马鱼相关知识的专业人员进行此项评估，以便基于其背景和使用该动物模型的经验来判断行为变化。</li>
	<li>统计每组每天出现过敏反应、异常行为和摄食改变的斑马鱼数量，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行组间比较。</li>
</ol>
7. 样品采集
<ol>
	<li>在第8天将鱼浸入0.04% MS-222中实施安乐死。 
	注意：试验期间因过敏反应死亡的鱼也需采集样本。</li>
	<li>用针将鱼固定在石蜡板上。</li>
	<li>安乐死后立即从鱼的鳃部血管29采集血清，此时鳃仍处于血液灌注状态，使用配备1 cm、29 G针头的0.5 mL注射器进行采集。将血清储存于1.5 mL离心管中，置于-20 °C保存至使用（视频3）。</li>
	<li>使用手术刀片沿矢状面切开鱼体，检查内部病变（出血性病变或肉芽肿）27,30&#160;（如出现）。 
	注意：病变不一定出现，但若存在则必须记录。</li>
	<li>按照先前描述的方法31，分别将每条鱼的肠道（视频4）和肾脏（视频5）采集至独立的空1.5 mL离心管中，并储存于-80 °C（图4C）。</li>
	<li>使用RNA纯化试剂盒（见材料表）从斑马鱼肠道和肾脏样本中提取总RNA。</li>
	<li>按照先前描述的方法30,32分析斑马鱼中与免疫应答相关基因的表达（引物序列见表2），采用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），使用适用于RT-qPCR的逆转录混合液（见材料表），依照制造商说明进行操作。以D. rerio GAPDH作为内参对mRNA的cT值进行标准化，并采用方差不等的Student t检验比较各组间差异（唾液处理组、α-Gal处理组与PBS处理组）。</li>
	<li>采用ELISA法测定斑马鱼血清样本中识别α-Gal的IgM抗体滴度，方法如前所述27,30。使用酶标仪记录450 nm处的吸光度（O.D.450 nm ）值，并采用方差不等的Student t检验比较各组间差异（唾液处理组、α-Gal处理组与PBS处理组）。 
	注意：IgM抗体滴度测定和基因表达分析为可选步骤，仅在需要免疫学信息时进行。RT-qPCR混合液是用于实时定量PCR基因表达分析的cDNA第一链合成试剂盒。</li>
</ol>

<ol><li>de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).</li>
<li>de la Fuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-pathogen+interactions+and+vector+competence%3A+identification+of+molecular+drivers+for+tick-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114(2017).</li>
<li>Villar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tick+salivary+gland+and+saliva+alphagalactome+reveals+candidate+alpha-gal+syndrome+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).</li>
<li>Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+tick+salivary+proteins+as+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The use of tick salivary proteins as novel therapeutics.</a> Frontiers in Physiology. 10, 812(2019).</li>
<li>Chung, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cetuximab-induced+anaphylaxis+and+IgE+specific+for+galactose-alpha-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).</li>
<li>Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+between+tick+bite+reactions+and+red+meat+allergy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Medical+Journal+of+Australia%22%5BJournal%5D)">An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans.</a> The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).</li>
<li>Cabezas-Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+molecular+drivers+of+the+%CE%B1-Gal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1210(2019).</li>
<li>de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-Gal+syndrome%3A+new+insights+into+the+tick-host+conflict+and+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation.</a> Parasites & Vectors. 12 (1), 154(2019).</li>
<li>Platts-Mills, T. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+cause+and+consequences+of+IgE+to+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose%3A+A+report+from+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+workshop+on+understanding+IgE-mediated+mammalian+meat+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).</li>
<li>Commins, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+anaphylaxis%2C+angioedema%2C+or+urticaria+after+consumption+of+red+meat+in+patients+with+IgE+antibodies+specific+for+galactose-alpha-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).</li>
<li>Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphylaxis+to+the+carbohydrate+side+chain+alpha-gal%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Allergy+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal.</a> Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).</li>
<li>Mateos-Hernández, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-host+conflict%3A+immunoglobulin+E+antibodies+to+tick+proteins+in+patients+with+anaphylaxis+to+tick+bite%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite.</a> Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).</li>
<li>Galili, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+in+primates+by+%26%2334%3BCatastrophic-selection%26%2334%3B+interplay+between+enveloped+virus+epidemics%2C+mutated+genes+of+enzymes+synthesizing+carbohydrate+antigens%2C+and+natural+anti-carbohydrate+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Evolution in primates by &#34;Catastrophic-selection&#34; interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies.</a> American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).</li>
<li>Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+mechanism+of+galactose-alpha-1%2C3-galactose+in+the+elicitation+of+delayed+anaphylactic+reactions+to+red+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Allergy+and+Asthma+Reports%22%5BJournal%5D)">Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3(2019).</li>
<li>Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+research+meets+tick+vectors+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cancer research meets tick vectors for infectious diseases.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).</li>
<li>Yilmaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+elicits+a+protective+immune+response+against+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission.</a> Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).</li>
<li>Cabezas-Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+immune+response+to+%CE%B1-Gal+and+vector-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).</li>
<li>Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+of+alpha-gal+syndrome%3A+Current+standards%2C+pitfalls+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Hautarzt%3B+Zeitschrift+Fur+Dermatologie%2C+Venerologie%2C+Und+Verwandte+Gebiete%22%5BJournal%5D)">Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives.</a> Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).</li>
<li>Commins, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+tick+bites+to+the+production+of+IgE+antibodies+to+the+mammalian+oligosaccharide+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).</li>
<li>Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+spectrum+of+%CE%B1-Gal+syndrome%3A+from+immediate-type+to+delayed+immediate-type+reactions+to+mammalian+innards+and+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Allergo+Journal+International%22%5BJournal%5D)">Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat.</a> Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).</li>
<li>Hodžić, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+Toxocara+canis+inhibits+the+production+of+IgE+antibodies+to+%CE%B1-Gal+in+humans%3A+towards+a+conceptual+framework+of+the+hygiene+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis.</a> Vaccines. 8 (2), 167(2020).</li>
<li>Kiewiet, M. B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+serological+characterization+of+the+%CE%B1-Gal+syndrome-importance+of+atopy+for+symptom+severity+in+a+European+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology.+In+Practice%22%5BJournal%5D)">Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).</li>
<li>Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-gal+story%3A+lessons+learned+from+connecting+the+dots%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).</li>
<li>Hashizume, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Amblyomma+testudinarium+tick+bites+are+associated+with+increased+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose+carbohydrate+IgE+antibody+levels%3A+A+retrospective+cohort+study+in+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).</li>
<li>Chandrasekhar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+exposure+to+clinically+relevant+lone+star+ticks+promotes+IgE+production+and+hypersensitivity+through+CD4%2B+T+cell-+and+MyD88-dependent+pathways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice.</a> Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).</li>
<li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amblyomma+sculptum+tick+saliva%3A+%CE%B1-Gal+identification%2C+antibody+response+and+possible+association+with+red+meat+allergy+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil.</a> International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).</li>
<li>Contreras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+reactions+and+immunity+in+response+to+tick+salivary+biogenic+substances+and+red+meat+consumption+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78(2020).</li>
<li>Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E%282%29+in+tick+saliva+regulates+macrophage+cell+migration+and+cytokine+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile.</a> Parasites & Vectors. 6 (2), 261(2013).</li>
<li>Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+will+tell%3A+what+hematological+analyses+can+reveal+about+fish+welfare%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare.</a> Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955(2021).</li>
<li>Pacheco, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+alpha-gal+protects+against+mycobacterial+infection+in+the+zebrafish+model+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis.</a> Vaccines. 8 (2), 195(2020).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), e1717(2010).</li>
<li>Lu, M. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+response+is+involved+in+nervous+necrosis+virus+acute+and+persistent+infection+in+zebrafish+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model.</a> Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).</li>
<li>Saralahti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+model+for+pneumococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis.</a> Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).</li>
<li>Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish%3A+A+fintastic+model+for+hematopoietic+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312(2018).</li>
<li>Katoch, S., Patial, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+emerging+model+system+to+study+liver+diseases+and+related+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).</li>
<li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+comprehensive+catalog+of+zebrafish+behavior+1.0+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond.</a> Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).</li>
<li>Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prednisolone+on+behavior+and+hypothalamic-pituitary-interrenal+axis+activity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325(2020).</li>
<li>Aleström, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+Housing+and+husbandry+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: Housing and husbandry recommendations.</a> Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

斑马鱼是一种经济实惠且易于操作的模式生物，同时也是研究免疫反应分子机制、病原体疾病、新药测试以及疫苗接种和抗感染保护的可行工具33,34,35。对斑马鱼行为的研究具有重要意义，因为先前的研究发现，某些鱼类在受到应激时会在水箱底部保持静止不动，从而影响其摄食行为，导致进食减少；此外，鱼类在游动时出现的之字形运动也可能与应激和焦虑有关36,37。通过评估斑马鱼这些参数所获得的信息，将有助于深入理解蜱-宿主之间的分子相互作用以及宿主对α-Gal免疫反应的相关机制，进而揭示α-半乳糖综合征（AGS）的发生机制，包括对哺乳动物肉类摄入产生过敏反应的机理。
为避免对注射分子产生假阳性反应，进行皮内注射时应避免过深，需与斑马鱼体表平行，并在注射时评估鱼类是否受损。因操作或针头穿刺造成损伤的个体不...

蜱是病原体的传播媒介，可引起疾病，同时也会导致过敏反应，影响全球人类和动物的健康1,2。在蜱吸血过程中，蜱唾液中的生物分子（尤其是蛋白质和脂质）有助于这些外寄生虫的取食，从而逃避宿主的防御机制3。某些含有糖类Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R（α-Gal）修饰的唾液生物分子，在部分个体被蜱叮咬后会诱导产生高水平的抗α-Gal IgE抗体，这种现象被称为α-Gal综合征（AGS）4。该疾病是一种由IgE介导的过敏反应，可能导致对蜱叮咬、非灵长类哺乳动物肉类摄入以及某些药物（如西妥昔单抗）产生过敏性休克5。对α-Gal的过敏反应通常较为严重，有时甚至可能致命6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。
α-半乳糖（α-Gal）存在于所有哺乳动物中，但旧世界猴、猿类和人类除外，后三者缺乏合成 α-Gal 的能力13然而，某些病原体（如细菌和原生动物）在其表面表达这种聚糖，可诱导机体产生大量抗α-Gal IgM/IgG抗体，这可能是一种针对这些病原体的保护性机制16,17然而，抗α-半乳糖抗体的产生会增加发生IgE介导的抗α-半乳糖过敏的风险7,13人类体内产生的天然抗α-半乳糖抗体（主要为IgM/IgG亚型）可能与肠道微生物群中细菌所含的这种修饰有关16. AGS 是一种具有挑战性的临床诊断，因为目前主要的诊断方法依赖于临床病史中出现的延迟性过敏反应，尤其是与食物过敏相关的症状（如瘙痒、局部荨麻疹或反复发生的血管性水肿，直至过敏性休克、荨麻疹及胃肠道症状），以及 IgE 抗-α-Gal 抗体水平的检测9目前的研究结果表明，蜱虫叮咬是导致α-半乳糖综合征（AGS）出现的主要风险之一。18,19蜱叮咬后，α-半乳糖（α-Gal）特异性IgE水平升高20倍或以上19α-半乳糖综合征（AGS）患者中蜱虫叮咬史20,21,22AGS 患者体内存在针对蜱虫抗原的反应性抗体19，且抗α-Gal IgE与抗蜱IgE水平密切相关19,23 但需要进一步研究以确定实际参与的生物分子。
此外，另一种可能的情况是，某些患者对蜱叮咬表现出强烈的过敏反应，并且体内抗α-半乳糖（α-Gal）IgE抗体水平较高，但却能够耐受哺乳动物肉类的摄入12。因此，哺乳动物肉类过敏可能是蜱叮咬相关过敏的一种特殊类型。与α-半乳糖综合征（AGS）相关的主要蜱种包括Amblyomma americanum（美国）、Amblyomma sculptum（巴西）、Amblyomma testudinarium 和 Haemaphysalis longicornis（日本）、Ixodes holocyclus（澳大利亚），以及Ixodes ricinus（欧洲莱姆病螺旋体病的主要传播媒介）11,24。
目前唯一用于评估与蜱虫叮咬相关的IgE产生的模型是α−1,3-半乳糖基转移酶基因敲除的转基因小鼠模型（α-Gal KO小鼠）25,26，因为与其他哺乳动物一样，小鼠也在蛋白质和脂质上表达α-Gal，且不会产生针对α-Gal的IgE。然而，斑马鱼（Danio rerio）是适用于哺乳动物的生物医学研究的有用模型，因其与哺乳动物具有许多解剖学上的相似性，并且与人类一样，也无法合成α-Gal。由于斑马鱼本身不天然产生α-Gal，因此该模型成本较低、易于操作，并可实现较大的样本量，适用于α-Gal相关过敏反应的研究。
本研究采用斑马鱼作为模式生物，用于表征和描述局部过敏反应、行为模式以及与经皮致敏蜱唾液26,27及随后摄入哺乳动物肉类相关的分子机制。为此，通过皮内注射使斑马鱼暴露于蜱唾液，随后喂食含有适于动物使用的哺乳动物肉类衍生产品的狗粮，该狗粮含有α-Gal27，然后评估可能相关的过敏反应。该方法可应用于其他与过敏过程相关的生物分子的研究，尤其是与α-半乳糖综合征（AGS）相关的研究。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>525-0990</td><td></td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>水生生物设施</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>解剖工具组</td><td>VWR</td><td>631-1279</td><td></td></tr><tr><td>狗粮 - Red Classic</td><td>Acana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISA 板 - 96 孔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10547781</td><td></td></tr><tr><td>Gala1-3Gal-BSA 3 (&amp;alpha;-Gal)&amp;nbsp;</td><td>Dextra</td><td>NGP0203</td><td></td></tr><tr><td>iScript 逆转录超级混合液</td><td>Supermix</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>微升注射器</td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>pilocarpine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 P10&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>613-0364</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 P1000</td><td>VWR</td><td>613-0359</td><td></td></tr><tr><td>高级热带鱼粮</td><td>DAPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>海绵动物固定架&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>由废弃泡沫制成</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR 仪</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（MS-222）</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究蜱虫唾液生物分子引发过敏反应的斑马鱼动物模型

Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules

蜱虫是通过传播病原体引起疾病的节肢动物媒介，其叮咬可能引发影响全球人类健康的过敏反应。在某些个体中，蜱虫叮咬可诱导产生针对糖类抗原Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R（α-Gal）的高水平免疫球蛋白E抗体。由蜱虫唾液中存在的含α-Gal糖类的糖蛋白和糖脂介导的过敏性反应，与α-Gal综合征（AGS）或哺乳动物肉类过敏相关。斑马鱼（Danio rerio）已成为研究多种病理过程的常用脊椎动物模型。本研究利用斑马鱼作为模型，研究对α-Gal及哺乳动物肉类摄入引发的过敏反应，因为斑马鱼与人类相似，均不能合成该糖类。为此，评估了斑马鱼在摄入Ixodes ricinus蜱虫唾液及哺乳动物肉类后的行为模式和出血性过敏性反应。该实验方法可获得有效数据，支持将斑马鱼作为动物模型用于研究蜱传过敏性疾病，包括AGS。

本文所述方案基于先前发表的多项实验27，30以及本实验室的研究结果，其中斑马鱼模型已建立并验证可用于研究α-半乳糖综合征（AGS）及对α-半乳糖（α-Gal）的免疫反应，因为人类和斑马鱼均不合成该分子13。该模型可用于表征和评估多种过敏反应，这些反应源于宿主对蜱虫唾液的应答（图4），并涉及AGS的发病机制。此外，在接受蜱虫唾液处理的鱼类中观察到行为改变，例如游动缓慢（视频6）、侧卧于水箱底部（视频7）、不进食、震颤或呈之字形运动（视频8），而对照组鱼类未见此类现象；这些现象在第2天给予犬粮后尤为显著。此时，鱼类已通过α-Gal和蜱虫唾液致敏，并开始通过饲料摄入红肉。最终，在接受蜱虫唾液处理的鱼类中观察到显著的过敏反应发生率（图4A、B</s...

本研究采用斑马鱼（Danio rerio）作为模型，通过评估对蜱虫唾液及哺乳动物肉类摄入的过敏反应，来研究α-半乳糖综合征（AGS）相关的过敏反应和免疫应答。

蜱虫是通过传播病原体引起疾病的节肢动物媒介，其叮咬可能引发影响人类健康的过敏反应……

问题是为何只有部分被蜱虫叮咬的个体才会产生过敏反应。对我们而言，阐明蜱虫唾液中的生物分子以及参与该过程的免疫机制，是解答这一问题的关键。α-半乳糖综合征的斑马鱼动物模型能够重现人类在接触蜱虫唾液后出现的行为模式和过敏反应。该实验方法推进了对蜱-宿主分子相互作用的理解，其中涉及与α-Gal综合征相关的冲突以及与抗α-Gal抗体反应相关的协作，后者对病原体感染具有保护作用。为用蜱唾液处理鱼类，将成年斑马鱼分为三个性别均衡的组。使用商业化的Gala1-3Gal-BSA 3或α-Gal作为阳性对照，PBS作为阴性对照。进行唾液提取时，使用在豚鼠身上吸血6至7天、半饱血且无病原体的雌性蜱虫。用50微升注射器（配0.33毫米针头）将5微升pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中含2%盐酸匹罗卡品的溶液注入蜱虫血腔。使用装有10微升吸头的微量移液器收集蜱虫假头处的唾液。将唾液置于冰上的1.5毫升离心管中，并在-80摄氏度下保存。使用BCA蛋白检测试剂盒，按照制造商的说明测定唾液中的蛋白浓度，以确定注射到斑马鱼体内的蛋白量。将斑马鱼饲养在循环水系统中，温度维持在27摄氏度，光照-黑暗周期为14小时光照、10小时黑暗。接下来，每组选取10条鱼，雌雄比例相近且体重相似，用于注射。将鱼短暂浸入0.02%三卡因甲磺酸盐溶液中进行麻醉。用镊子或手小心地将麻醉后的鱼侧放于湿润的海绵上，尾鳍朝向右侧，以便沿同一方向注射化合物，从而控制损伤位置。使用带有1厘米长、29号针头的100微升注射器，在距尾鳍5毫米处以45度角向鱼体肌肉进行皮内注射。注射后，将处理过的鱼放回淡水水族箱中，无需麻醉即可恢复。每天上午9:30喂食两次。每天上午9:00和下午1:30，每条鱼投喂50至70微克的干燥鱼饲料，持续至第2天。随后用研钵和研杵将狗粮研碎，在处理注射后的第2天开始投喂，直至第8天实验结束。进行样品采集时，用大头针将安乐死后的鱼固定在石蜡板上。当鱼鳃仍被血液灌注时，使用装有1厘米长、29号针头的0.5毫升注射器从鱼鳃血管中采集血清。将采集的血清储存于1.5毫升离心管中，于20°C保存，待用。用手术刀沿矢状面切开鱼体，评估内部病变。然后将每条鱼的肠道和肾脏分别收集到1.5毫升离心管中。使用RNA纯化试剂盒从肠道和肾脏中提取总RNA。通过定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析与免疫应答相关基因的表达水平，使用适用于RT-qPCR的逆转录混合液，并按照制造商说明书操作。以斑马鱼GAPDH的mRNA cT值作为内参进行归一化处理，并采用方差不等的Student t检验进行组间比较。采用ELISA法测定血清样本中识别α-Gal的IgM抗体滴度。使用酶标仪以450纳米处的光密度值记录抗体滴度，并采用方差不等的Student t检验进行组间比较。该斑马鱼模型可用于表征和评估由宿主对蜱虫唾液的反应及其在α-半乳糖综合征（alpha-Gal syndrome，AGS）中的作用所引发的多种过敏反应。此外，与对照组鱼类相比，在经蜱虫唾液处理的鱼类中观察到行为改变，如游泳缓慢、静卧于水箱底部、不进食，以及出现震颤或之字形运动。在使用蜱虫唾液处理的鱼类中观察到显著的过敏反应发生率，并表现出快速的脱敏和耐受性。与仅使用α-半乳糖处理的鱼类相比，使用蜱虫唾液处理的鱼类行为变化更为明显。通过RT-PCR对代表性免疫标志物的表达进行了进一步分析。结果显示，在肾脏中，与对照组相比，经唾液和α-半乳糖（alpha-Gal）处理的斑马鱼其免疫反应标志物表达下调。此外，经唾液和α-半乳糖处理的斑马鱼体内产生了针对α-半乳糖的IgM抗体，其水平高于经PBS处理的鱼类。给药注射、过敏反应及行为评估，以及记录因过敏反应导致死亡的鱼的数量，是本实验方案中最重要的部分。利用 mRNA、蛋白质以及微生物组水平的组学技术来表征对蜱虫唾液的反应，可帮助我们鉴定出参与该过程的关键生物分子。

zebrafish-animal-model-for-study-allergic-reactions-response-to-tick

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

斑马鱼动物模型，用于研究对蜱唾液生物分子的过敏反应

采集感染蜱虫的血淋巴、唾液腺及唾液对于研究蜱传病原体如何致病具有重要意义。本实验方案中，我们演示了如何从吸血的肩突硬蜱（Ixodes scapularis）若虫中采集血淋巴和唾液腺，并演示了从雌性肩突硬蜱（I.

唾液、唾液腺和血淋巴的采集自 Ixodes scapularis 蜱虫

先天免疫反应可保护生物体免受病原体感染。先天免疫反应的关键组分——吞噬细胞呼吸爆发——能够产生活性氧物质，从而杀灭入侵的微生物。本文介绍一种呼吸爆发检测方法，用于定量测定化学诱导先天免疫反应时所产生的活性氧物质。...

斑马鱼先天免疫健康的呼吸爆发反应定量检测

本文介绍了一种在斑马鱼耳囊内建立并成像局部细菌感染的方法。...

Streptococcus iniae 感染的斑马鱼幼体模型中先天免疫反应的非侵入性成像

本文介绍了一种利用自然病原体Mycobacterium...

在感染Mycobacterium marinum的成年斑马鱼中建立结核病模型

本文介绍了一种对成年斑马鱼（Danio...

成年斑马鱼免疫用于DNA疫苗的临床前筛选

本方案描述了一种在斑马鱼幼鱼中建立Aspergillus感染的模型。Aspergillus孢子被显微注射至幼鱼的后脑，通过化学处理诱导免疫抑制。利用每日成像系统监测感染进展，以观察真菌生长和免疫反应，并通过菌落形成单位平板法对存活孢子进行计数。...

斑马鱼幼虫感染 曲霉属 用于宿主-病原体相互作用分析的孢子

本文介绍了在临床研究中使人暴露于肩突硬蜱（Ixodes...

一种用于人类接触幼虫期Ixodes scapularis蜱虫的实验暴露模型

本文介绍了一种实验方案，通过解剖已摄食的单个蜱虫，收集其唾液、血淋巴、唾液腺和中肠组织，以研究蜱传病原体在不同组织中的特异性定位，从而增进对媒介传播能力及病原体与微生物组相互作用的理解。...

从单个蜱虫（蜱螨目：硬蜱科）中提取唾液、血淋巴、唾腺及中肠

该方法概述了一种新型的开发流程 体外...

硬蜱研究中通过3D打印腔室上的人工膜进行蜱虫吸血

为了模拟炎症信号如何影响遗传易感生物体的神经发育，我们提供了一种将IL-6微量注射到斑马鱼幼鱼库维埃管（总主静脉）的实验方案，可在结节性硬化症（TSC）背景下实现炎症的可控诱导，并评估其对发育的影响。...

向TSC斑马鱼幼鱼血液中显微注射白细胞介素-6以研究类神经精神障碍行为

了解利用斑马鱼模型研究蜱唾液生物分子引发的过敏反应机制。该方法通过注射蜱唾液和α-Gal，结合行为学观察与分子检测，揭示α-Gal综合征的免疫机制，为过敏性疾病治疗提供新思路。

用于研究蜱虫唾液生物分子引发过敏反应的斑马鱼动物模型

探索更多视频