利用遗传密码子扩展技术对细菌分泌蛋白进行超分辨率成像

遗传密码扩展（GCE）克服了其他标记策略的局限性。它使我们能够实现对蛋白质的特定位点标记，并利用高亮度的有机荧光染料实现其可视化，从而避免使用可能干扰蛋白质功能的荧光蛋白融合等标记方法。该方法可应用于其他任何体系。

例如，我们已将其用于标记寨卡病毒CO蛋白，从而能够提供并制备可标记的寨卡病毒，以便观察其感染宿主细胞的过程。首先，将100微升的初级培养物转移至5毫升含有35微克/毫升氯霉素和100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中。在37°C、250 RPM振荡条件下培养，直至600纳米处的光密度达到0.6。

将LB培养基替换为添加了1毫摩尔TCO（一种非天然氨基酸）的改良N最小培养基，并在34摄氏度下培养细菌30分钟。加入0.2%阿拉伯糖、25毫克/毫升氯霉素和100毫克/毫升氨苄青霉素，继续振荡培养细胞6小时，转速为250 RPM。

六小时后，用不含非经典氨基酸（ncAA）的新鲜 MgM 培养基，每隔 30 分钟洗涤细菌一次，共洗涤四次。离心细菌，重悬于 PBS 缓冲液中，于 4 摄氏度避光孵育 1 小时，以去除多余的 ncAA。1 小时后，在 4 摄氏度下以 3,000 G 离心 15 分钟，收集细菌并保存以供后续使用。

作为对照实验，通过在不含非天然氨基酸（ncAA）的条件下表达携带ncAA的蛋白质，重复相同的实验。将表达SseJ并掺入TCO的沙门氏菌细胞在PBS中重悬，分别在有或无TCO的条件下进行处理。用PBS将600纳米处的光密度调整至4，然后在37摄氏度避光条件下，加入20微摩尔Janelia Fluor 646四嗪或20微摩尔BDPFL四嗪孵育，并以250转/分钟振荡1至2小时。

离心收集细胞，并用含有5%DMSO和0.2%Pluronic F-127的PBS洗涤三至四次。将沉淀重悬于含5%DMSO的PBS中。在4°C避光条件下孵育过夜后，再用PBS洗涤两次。

立即使用共聚焦显微镜对细胞成像，或在室温避光条件下用含1.5%多聚甲醛的PBS固定30至45分钟。在37摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度条件下培养并维持HeLa细胞，培养基为添加10%胎牛血清及青霉素-链霉素的高糖DMEM。在感染前一天培养细菌，挑取单个菌落的携带pEVOL质粒（包含正交tRNA合成酶对）和pWSK29质粒（包含SseJ基因）的野生型沙门氏菌，接种于5毫升含抗生素的标准LB液体培养基中，于37摄氏度、250 RPM振荡过夜培养。

将细胞悬液调整至每毫升100,000个细胞，然后在八孔板中每孔接种50,000个HeLA细胞，每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的500微升DMEM培养基。将八孔板置于37摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度的培养箱中培养24小时。进行细菌感染时，将含有pEVOL质粒和携带SseJ基因的pWSK29质粒的野生型沙门氏菌进行传代培养，方法是将100微升过夜培养的菌液接种至3毫升LB培养基中，该LB培养基中含有35微克/毫升氯霉素和100微克/毫升氨苄青霉素。

在37摄氏度、250转/分钟振荡条件下孵育5至7小时。为启动HeLa细胞感染，从培养箱中取出HeLa细胞后，用预热的DPBS洗涤细胞，并向每孔加入500微升含10% FBS的新鲜DMEM。将腔室载玻片放回二氧化碳培养箱中，直至感染开始。

孵育5至7小时后，将沙门氏菌培养物稀释，使在1毫升DMEM生长培养基中600纳米处的光密度为0.2，并向腔室载玻片的每个孔中加入所需量的沙门氏菌接种物，使感染复数为100。将感染后的细胞在二氧化碳培养箱中孵育30分钟，随后用预热的DPBS洗涤细胞3次，以去除胞外沙门氏菌。将此时间点设为感染后0小时，并加入含有100微克/毫升庆大霉素的500微升完全培养基，作用1小时。

孵育后，再次如前所述用 DPBS 洗涤细胞三次，并向腔室载玻片的每个孔中加入 500 µL 完全培养基，培养基中添加 0.2% 阿拉伯糖和 10 µg/mL 庆大霉素。在对照实验中，对 HeLa 细胞进行类似的感染处理，但不加入 TCO。将腔室载玻片在二氧化碳培养箱中孵育 10 小时后，用新鲜的不含 TCO 的完全培养基替换原有培养基，并用预热的 DPBS 每 30 分钟洗涤 HeLa 细胞一次，共洗涤四次。

然后用不含TCO的新鲜完全培养基洗涤细胞。感染后12小时，吸去细胞培养液，并用预热的DPBS洗涤细胞两到三次。在其中一组孔中加入500微升染料溶液混合物一，在同一腔室载玻片的另一组孔中加入500微升染料溶液混合物二。

将培养 chamber 载玻片放回二氧化碳培养箱中孵育 1.5 至 2 小时。感染后 13.5 至 14 小时，用预热的 DPBS 缓冲液冲洗 HeLa 细胞两次，并加入 500 微升含 FBS 的新鲜 DMEM 培养基。孵育 30 分钟后，再次用预热的 DPBS 缓冲液冲洗细胞（方法如前所述），随后在 30 分钟的时间间隔内用新鲜 DMEM 培养基洗涤四次。

感染后16小时，通过向每孔加入200微升4%多聚甲醛，在室温避光条件下孵育10分钟，固定HeLa细胞。吸除多聚甲醛溶液，用PBS洗涤三次，将细胞置于PBS中，于4摄氏度避光保存。

将细胞转移至显微镜下，把成像腔室置于显微镜载物台的样品 holder 中。随后用 0.4 毫升新配制的 GLOX BME 成像缓冲液更换孔中的培养基。将激光功率降低至约 1 毫瓦，以识别感兴趣的 HeLa 细胞，并在用低强度 647 纳米激光照射样品的同时调整焦平面和激光束角度。

调整 HILO 照明角度。捕获目标结构的衍射受限参考图像，并通过将激光调至最大功率使荧光分子进入暗态。将前置放大器增益设为 3，并启动帧转移。

然后将EM增益设为200，以提高dSTORM测量的灵敏度。调节激光强度至适当水平，使闪烁事件在空间和时间上相互分离。将曝光时间设为30毫秒，并开始采集图像。

获取 10,000 到 30,000 帧。在不同的 ROI 处重复类似的采集。对于 dSTORM 的图像重建，打开 ImageJ 并导入原始数据。

打开 Thunderstorm 插件，并根据设备配置相应的相机设置。进入运行分析界面，设置适当的参数，例如图像滤波、定位方法以及分子的亚像素定位。点击“确定”以开始图像重建，并启动后期处理结果分析。

表达与TCO偶联的SseJ的沙门氏菌经Janelia Fluor 646四嗪处理，并在有或无TCO存在的情况下用Janelia Fluor 646荧光成像。仅在存在TCO时检测到SseJ的荧光。用携带psseJ-HA质粒的沙门氏菌感染HeLa细胞16小时，随后固定并用抗HA抗体、LPS和DAPI进行免疫染色。

正如预期，感染细胞中形成了依赖SseJ的沙门氏菌诱导丝状结构（SIFs）。在缺乏TCO的情况下，琥珀密码子未被抑制，因此在感染的HeLa细胞中未观察到依赖SseJ的SIFs。而在存在TCO时，可观察到依赖SseJ的SIFs，这明确表明通过遗传密码子扩展技术（GCE）表达SseJF10TCOHA成功恢复了SseJ的功能。

通过使用两种不同的染料混合物（染料混合物一和染料混合物二）进行SPIEDAC点击反应，展示了分泌的SseJF10TCOHA在HeLa细胞中的标记特异性。进一步使用点击染料Janelia Fluor 646 TZ检测携带SseJ HA并表达TCO和P vault质粒的野生型沙门氏菌感染HeLa细胞时是否存在背景标记。结果显示SseJ被释放到宿主细胞的细胞质中，且无细胞内或非特异性荧光信号，表明荧光信号特异性地来源于SseJ。

本图展示了用GCE标记的SseJ在HeLa细胞中的超分辨率成像。图中显示了正在观察的HeLa细胞的明场图像，以及用TCO和Janelia Fluor 646标记的分泌型SseJ的衍射受限宽场图像，和相应的SseJ修饰的SIFs的dSTORM图像。

插图显示了方框区域内超分辨 SseJ 的放大视图。NCAA 储存液用 NaOH 配制。在将其加入培养基之前或之后，切记进行中和处理。

标记目标蛋白后，需对细胞进行充分洗涤，以使背景信号降至最低。通过我们的GCE实验流程，现在可以对细菌中的任意毒力因子进行标记，并利用成像技术追踪其活性。