使用遗传密码扩增对细菌分泌蛋白进行超分辨率成像

遗传密码扩展（GCE）克服了其他标记策略的局限性。它使我们能够定位特异性标记的蛋白质，并且我们有明亮的有机荧光团可以使它们可视化，因此我们可以避免进行荧光蛋白融合的策略，这可能会破坏蛋白质功能。此方法可以应用于任何其他系统。

例如，我们已经用它来标记寨卡一氧化碳蛋白，这使我们能够提供和生产标记的寨卡病毒，然后我们可以观察感染宿主细胞。首先，将100微升原代培养物转移到含有每毫升35微克氯霉素和每毫升100微克氨苄西林的5毫升LB培养基中。在37摄氏度下孵育，以250RPM振荡，直到600纳米处的光密度达到0.6。

用补充有一毫摩尔TCO（一种非规范氨基酸）的改良N-最小培养基替换LB培养基。并将细菌在 34 摄氏度下培养 30 分钟。加入0.2%阿拉伯糖，每毫升25毫克氯霉素和每毫升氨苄西林100毫克，再培养细胞6小时，以250RPM振荡。

六小时后，用不含非规范氨基酸或ncAA的新鲜MgM培养基在30分钟内洗涤细菌四次。离心细菌，重新悬浮在PBS缓冲液中，并在黑暗中以4摄氏度孵育一小时以去除多余的ncAA。一小时后，将细菌在4摄氏度下以3， 000克离心15分钟，并储存以备进一步使用。

对于对照实验，在没有ncAA的情况下通过表达携带ncAA的蛋白质来重复相同的实验。在PBS中不存在或存在TCO的情况下，重新悬浮表达与TCO结合的SseJ的沙门氏菌细胞。将 600 纳米处的光密度调节至 PBS 中的 4，并在黑暗中用 20 微摩尔 Janelia Fluor 646 四烯或 20 微摩尔 BDPFL 四嗪在 37 摄氏度下孵育细胞，并以 250 RPM 摇动一至两个小时。

沉淀细胞并用含有5%DMSO和0.2%Pluronic F-127的PBS洗涤三到四次。将沉淀重新悬浮在含有5%DMSO的PBS中。在黑暗中在四摄氏度下孵育过夜后，用PBS再次洗涤两次。

立即使用共聚焦显微镜对细胞进行成像，或在室温下在黑暗中用PBS中的1.5%多聚甲醛固定30至45分钟。在高糖DMEM中培养并保持HeLa细胞在37摄氏度，5%二氧化碳和95%湿度下，除青霉素链霉素外还补充了10%FBS。在感染前一天培养细菌，并在含有正交tRNA合成酶对的pEVOL质粒和含有SseJ基因的pWSK29质粒中接种含有pEVOL质粒的野生型沙门氏菌的单个菌落，在含有标准LB肉汤的5毫米抗生素中，在37摄氏度下过夜，以250 RPM振荡。

以每毫升 100， 000 个细胞修复稀释的细胞原液，并在含有 10%FBS 生长培养基的 500 微升 DMEM 中每孔接种 50， 000 个 HeLA 细胞。将腔室载玻片在培养箱中在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 95% 湿度下保持 24 小时。对于细菌感染，通过将100微升过夜细菌培养物稀释到含有35微克/毫升氯霉素和100微克/毫升氨苄西林的LB培养基中，将携带pEVOL质粒和含有SseJ基因的pWSK29质粒的野生型沙门氏菌传代培养。

在 37 摄氏度下以 250 RPM 振荡孵育 5 到 7 小时。为了启动HeLa细胞感染，从培养箱中取出HeLa细胞后，用预热的DPBS洗涤细胞，并向每个孔中加入500微升含有10%FBS的新鲜DMEM。将腔室载玻片放回二氧化碳培养箱中，直到感染开始。

孵育五至七个小时后，稀释沙门氏菌培养物，使600纳米处的光密度在一毫升DMEM生长培养基中为0.2，并向腔室载玻片的每个孔中加入必要量的沙门氏菌接种物，使感染的多重性为100。将感染的细胞在二氧化碳培养箱中孵育30分钟后，用预热的DPBS洗涤细胞三次以去除细胞外沙门氏菌。将此时间点设置为感染后零小时，并加入 500 微升每毫升庆大霉素含有 100 微克的完全培养基，持续 1 小时。

孵育后，再次如前所示用DPBS洗涤细胞三次，并向腔室载玻片的每个孔中加入500微升补充有0.2%阿拉伯糖，每毫升庆大霉素10微克的完整培养基。在对照实验中，在没有TCO的情况下对HeLa细胞进行类似的感染。在二氧化碳培养箱中孵育室载玻片10小时后，用不含TCO的新鲜完全培养基替换完全培养基，并在30分钟的间隔内用预热的DPBS洗涤HeLa细胞四次。

然后用不含TCO的新鲜完全培养基洗涤细胞。感染后12小时后，从细胞中吸出培养基，并用预热的DPBS洗涤细胞两次或三次。在一组孔中，加入500微升染料溶液混合物一个，在另一组孔的同一腔室载玻片中，加入500微升染料溶液混合物两个。

将腔室载玻片放回二氧化碳培养箱中一小时和 1/2 至两个小时。感染后13.5至14小时后，用预热的DPBS冲洗HeLa细胞两次，并加入500微升补充FBS的新鲜DMEM。孵育30分钟后，如前所述，用预热的DPBS再次洗涤细胞，然后在30分钟的间隔内用新鲜DMEM洗涤四次。

在感染后16小时，通过向每个孔中加入200微升4%多聚甲醛并在室温下在黑暗中孵育10分钟，用多聚甲醛固定HeLa细胞。吸去多聚甲醛。用PBS冲洗三次，并将细胞储存在PBS中，在黑暗中温度为四摄氏度。

将细胞带到显微镜下，并将成像室放在样品架的显微镜载物台上。然后用0.4毫升新鲜制作的GLOX BME成像缓冲液更换孔中的培养基。将激光功率降低到大约一毫瓦以识别感兴趣的HeLa细胞并调整焦平面和激光束角度，同时用低647纳米激光密度照射样品。

调整 HILO 照明角度。捕获目标结构的分数限制图像的参考，并通过将激光旋转到其最大功率将荧光团切换到暗状态。将前置放大器增益设置为3并激活帧传输。

然后将 EM 增益设置为 200，以提高 dSTORM 测量的灵敏度。将激光强度调整到合适的水平，其中闪烁事件在空间和时间上分开。将曝光时间设置为30毫秒并开始采集。

获取 10， 000 到 30， 000 帧。在不同的投资回报率下重复类似的采集。对于dSTORM的图像重建，请打开图像J并导入原始数据。

打开雷暴插件，配置设备对应的相机设置。转到运行分析并设置适当的设置，例如图像过滤、定位方法和分子的亚像素定位。单击"确定"开始图像重建，开始后处理最终结果分析。

表达与TCO结合的SseJ的沙门氏菌用珍妮莉亚福陆646四嗪处理，并在不存在或存在TCO的情况下用珍妮莉亚福陆646荧光成像。SseJ的荧光仅在存在TCO时检测。HeLa细胞感染含有psseJ-HA的沙门氏菌16小时，用抗HA抗体，LPS和DAPI固定和免疫染色。

正如预期的那样，SseJ依赖性沙门氏菌诱导的细丝或SIF在感染细胞中形成。在没有TCO的情况下，琥珀色密码子不被抑制，并且在感染的HeLa细胞中不存在SseJ依赖性SIF。在存在TCO的情况下观察到SseJ依赖性SIF，这清楚地表明SseJ是通过使用遗传密码扩展或GCE表达SseJF10TCOHA来拯救的。

此处显示了使用两种交替染料混合物一和染料混合物二通过SPIEDAC点击反应标记HeLa细胞中分泌的SseJF10TCOHA的特异性。点击染料Janelia Fluor 646 TZ进一步用于观察在TCO和Pvault质粒存在下感染携带SseJ HA的野生型Salmanella感染的HeLa细胞中是否存在任何背景标记。SseJ被释放到宿主细胞的细胞质中，没有细胞内或非特异性荧光信号，表明荧光信号对SseJ具有特异性。

该图中显示了HeLa细胞中GCE标记的SseJ的超分辨率成像。此处显示了正在观察的HeLa细胞的明场图像。这里展示了用TCO和Janelia Fluor 646标记的分泌SseJ的衍射限制宽场图像以及SseJ装饰的SIF的相应dSTORM图像。

插页显示了盒装区域中超分辨率 SseJ 的放大视图。NCAA储备溶液在NaOH中制备。不要忘记在添加到介质之前或之后中和它。

标记感兴趣的蛋白质后，广泛洗涤细胞，使背景信号最小。按照我们的GCE程序，现在，我们可以标记细菌中的任何毒力因子，并使用我们的成像技术跟踪其活性。