Name: Langendorff 模型中离 体 小鼠双心室功能的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 了解如何使用Langendorff离体灌流系统评估小鼠供心左右心室功能，比较冷保存后双心室收缩与舒张功能差异，为心脏移植保存生物学研究提供可靠方法。

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本方案中的所有动物实验均经密歇根大学安娜堡分校机构动物护理与使用委员会批准。所有小鼠均&#160;在无病原体房间中，以12小时光照/12小时黑暗循环饲养。参见 材料表 有关本方案中使用的所有材料、动物和设备的详细信息。
1. 硅胶球囊导管的构建
注意：硅胶气囊的制备方法如前所述13。
<ol>
	<li>向100 mL烧杯中加入9.5 mL蒸馏水、14.2 mL轻质玉米糖浆和33.8 g蔗糖。加热并搅拌溶液，直至糖完全溶解。</li>
	<li>将10 g小麦面粉与5 g水混合，揉至形成均匀一致的面团，静置10分钟。</li>
	<li>取一小块面团捏成椭圆形——即&#34;头部&#34;——并将其附着在一根干燥的意大利面末端。然后将此头部浸入糖溶液中，再缓慢取出，使头部完全被糖液包裹。 
	注意：面团应光滑且质地均匀。可通过调整面团大小制备不同尺寸的气球，短径范围为5 mm至7 mm（长径）。尽量使其表面覆盖一层薄薄的糖溶液。</li>
	<li>将意大利面悬置于聚苯乙烯泡沫块或其他支撑物上，使头部表面形成均匀光亮的覆盖层，并过夜干燥。</li>
	<li>将模具浸入硅酮分散液（硅橡胶分散于二甲苯中），然后将意大利面重新放回聚苯乙烯泡沫块中，在37 °C下放置2小时或直至干燥。重复此步骤一次。 
	注意：必须防止硅酮分散液因暴露于空气中而发生氧化凝胶化，否则会导致气球壁厚不均。</li>
	<li>将模具放入水中，使气球分离并收集。将气球储存于0.02%叠氮化钠溶液中。</li>
	<li>从22 G针头上截取一段两端均为钝端的部分；将一端钝端连接至硅胶气球，另一端连接至PE导管。使用4-0丝线将气球牢固绑扎在针头上。 
	&#8203;注意：通过向气球内注入水来检测其完整性。气球充水后，轻轻按压以检查其内部是否能维持张力。若发现泄漏，则更换新气球。安装好的气球可保存以供后续使用。</li>
</ol>
2. 心脏灌注系统的准备
<ol>
	<li>配制 1 L Krebs-Henseleit (KH) 灌流缓冲液，并将其转移至 Langendorff 系统的水储液罐中。</li>
	<li>将通气管连接至水储液罐，并开启气流，使 KH 缓冲液与 5% CO2 和 95% O2 平衡至少 30 分钟。</li>
	<li>将水浴温度设定为 41.5 °C，并使水在 Langendorff 系统外层循环，以预热系统和 KH 缓冲液。 
	&#8203;注意：水浴温度需根据每套系统进行优化。对于本系统，当缓冲液灌流心脏时，水浴温度可使 KH 缓冲液维持在 37–37.5 °C。</li>
</ol>
3. 小鼠心脏的分离、固定与插管
<ol>
	<li>为抗凝，通过腹腔注射（i.p.）给予200单位肝素生理盐水溶液&#160;注射至C57/B6小鼠腹部右象限。&#160;注射前回抽注射器，以确认针头斜面位置&#160;不在膀胱或胃肠道管腔内。&#160;每个实验条件下至少使用四只小鼠（但也需考虑处理效应的大小）。
	<ol>
		<li>30分钟后，通过腹腔注射给予小鼠80 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪以进行麻醉。通过脚趾夹捏测试检查小鼠是否失去意识，确保无任何反应。&#160;可添加2mg/kg的乙酰丙嗪&#160;如果所用菌株对酮/氯混合物敏感&#160;小鼠的数量&#160;未达到&#160;仅使用氯胺酮/甲苯噻嗪即可达到足够的麻醉水平。</li>
		<li>在胸骨下方紧邻处做一切口。使用剪刀剪开膈肌和肋骨以打开胸腔。将前胸壁向外翻折，充分暴露胸腔。在降主动脉（靠近主动脉弓处）进行剪切。将小鼠的心脏、肺和胸腺转移至预冷的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）缓冲液中。在冰冻的HTK缓冲液中分离器官。去除周围结缔组织，暴露主动脉。 
		注意：切除时应包含升主动脉和主动脉弓区域，以最大化获取主动脉的长度，从而留出足够的空间连接针头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将主动脉末端连接至22 G针头，并用6-0丝线结扎。确保灌注导管位于主动脉根部上方，以免干扰主动脉瓣。在约10分钟内用10 mL冷（4 °C）HTK缓冲液灌注主动脉。 
	注意：从心脏取出至主动脉插管耗时少于15分钟；然而，保持灌注速度在适当水平至关重要。注射过快或过于剧烈可产生高压，导致血管/心脏损伤。</li>
	<li>将心脏置于含有冰冻HTK溶液的50 mL离心管中保存8小时，或立即进行灌注（对照组不得保存），避免与冰直接接触。 
	注意：心脏组织直接接触冰可能导致冷损伤。</li>
	<li>将装有针头的心脏连接至Langendorff装置中的插管，并用丝线结扎固定。 
	注意：为标准化操作流程，在灌注前，导管插入过程需等待总共 3 min。</li>
	<li>以3 mL/min的恒定流速模式开始灌注；随后转换为70-80 mmHg的恒定压力模式，并将心脏调整至约6 mL/min。 
	注意：轻柔按压心脏有助于加快心脏复跳。若在恒压模式下灌注流速远高于6 mL/min，可能存在插管漏液或主动脉瓣功能异常。应调整连接以修复漏液。恒流模式会 overriding 心脏血管张力的自我调节功能，而恒压模式允许心脏自主调节冠状动脉灌注流量。因此，恒压模式可更精确地评估心脏功能及心脏保存质量。</li>
	<li>将一个未充气且充满水的气球通过三通阀连接至压力传感器和一个充满水的注射器。经过15–20分钟的平衡期后，剪开右心房（RA），并通过RA将气球插入右心室（RV）。使用胶带将气球固定在RV内。尽量减小RA的开口面积，以帮助将气球限制在心室内（参见 图1 （用于装置的设置）。 
	注意：需要一段平衡期，因为心脏的收缩和舒张在开始时并不稳定，此时测量结果的准确性和代表性较差。如果在打开右心房（RA）过程中损伤了房室结，心脏将出现频繁的心律失常。</li>
	<li>在采集右心室功能数据20分钟后，剪开左心房（LA），将一个未充气的注水球囊经左心房插入左心室（LV）。使用胶带固定球囊，使其保持在左心室内。 
	&#8203;注意：心脏应维持稳定的血流动力学状态超过1.5小时。</li>
</ol>
4. 功能数据记录
<ol>
	<li>压力传感器的校准
	<ol>
		<li>用温盐水填充一个10 mL注射器，并通过三通阀将注射器连接到压力传感器帽上。打开阀门，缓慢将盐水注入传感器帽内，然后关闭所有阀门并取下注射器。将充满盐水的传感器帽连接至压力传感器；将压力计连接到三通阀的第三个端口。</li>
		<li>在记录软件中，从连接至压力传感器的通道下拉菜单中选择Bridge Amp。将该通道重命名为灌注压。点击Zero对压力传感器进行调零。</li>
		<li>点击Start开始记录，使传感器读数为0 mmHg。记录数秒后，缓慢推动注射器，将压力升至100。点击stop停止记录。</li>
		<li>在单位转换对话框中，选择一段对应0 mmHg的记录区域，点击箭头至Point 1，并输入0 mmHg。选择对应100 mmHg的记录区域，点击箭头至Point 2，并输入100 mmHg。点击OK完成传感器校准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将连接带有球囊的压力传感器的通道重命名为心室压。当心脏连接至系统后开始记录。将球囊插入心室后，通过三通阀使用微量注射器调节球囊内的水量，使舒张末期压力维持在5–10 mmHg。 
	注：测量过程中舒张末期压力可能下降，建议起始值接近10 mmHg。</li>
	<li>将一个空通道重命名为dP/dt。从下拉菜单中选择Derivative | source channel为Ventricle Pressure。该通道将记录心室腔内在收缩期间压力变化的速率。</li>
	<li>选择一段稳定的测量时期，然后点击Blood pressure模块中的Setting。
	<ol>
		<li>选择心室压作为输入通道，并为计算时间段点击选择 | OK。</li>
		<li>点击Classifier view以剔除异常的心动周期（例如周期时间或压力异常）。</li>
		<li>点击table view生成所选时间段内最大dP/dt（收缩）和最小dP/dt（舒张）的平均值表格。 
		注：保存每个样本的记录文件，并保存平均心功能数据表格用于统计分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">The past, present and future of heart transplantation.</a> Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).</li>
<li>Gaffey, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+%26%2334%3Bhigh-risk%26%2334%3B+donor+hearts%3A+Implications+for+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of &#34;high-risk&#34; donor hearts: Implications for infection.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).</li>
<li>Hsich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matching+the+market+for+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Matching the market for heart transplantation.</a> Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679(2016).</li>
<li>Piperata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+the+new+era+of+extended+donor+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in the new era of extended donor criteria.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).</li>
<li>Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+utilization+of+marginal+donors+for+orthotopic+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).</li>
<li>Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+graft+dysfunction+after+heart+transplantation%3A+a+thorn+amongst+the+roses%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses.</a> Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury%3A+impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li>
<li>Matsuura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+inotropic+effects+of+ATP+released+via+the+maxi-anion+channel+in+Langendorff-perfused+mouse+hearts+subjected+to+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion.</a> Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997(2021).</li>
<li>Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+arrhythmogenesis+following+slowed+conduction+in+heptanol-treated%2C+Langendorff-perfused+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts.</a> The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).</li>
<li>Kobashigawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+a+consensus+conference+on+primary+graft+dysfunction+after+cardiac+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).</li>
<li>Lei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+inflammatory+responses+of+the+native+left+and+right+ventricle+associated+with+donor+heart+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation.</a> Physiological Reports. 9 (17), 15004(2021).</li>
<li>Miller, A., Wright, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+murine+ventricular+balloons+for+the+Langendorff+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology+%26+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation.</a> Journal of Biotechnology & Biomaterials. 1 (101), (2011).</li>
<li>Madsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+immunology+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Advances in the immunology of heart transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (12), 1299-1305 (2017).</li>
<li>Voelkel, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+ventricular+function+and+failure%3A+report+of+a+National+Heart%2C+Lung%2C+and+Blood+Institute+working+group+on+cellular+and+molecular+mechanisms+of+right+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure.</a> Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了通过主动脉插管进行逆行灌注的朗根多夫（Langendorff）方法。via 主动脉插管。该技术可用于评估小鼠心脏在低温保存后的左心室（LV）和右心室（RV）功能。结果表明，采用本方案，供体心脏的长时间低温保存会导致左心室和右心室的心脏功能下降。
心脏移植后急性和慢性排斥反应的研究广泛集中在免疫生物学领域14。原位细胞在冷保存期间对原发性移植物功能障碍（PGD）的影响则研究较少。PGD 发生在约 10%–20% 的心脏移植病例中，占移植后 30 天内早期死亡的 66%。特别是移植后左心室（LV）与右心室（RV）受累的 PGD 发生率存在差异11。在不涉及受体细胞反应的情况下，这种离体（ex vivo）方法专注于供体心脏冷保存后原位心肌细胞对 PGD 的贡献。未来的研究可在小鼠心脏移植模型中纳入受体反应因素。
在本实验方案中，离体心脏灌注采用低温保存的供体心脏，重点研究其对温晶体溶液灌注的固有心脏反应，而不涉及细胞免疫的浸润作用。为了获得可重复的结果，多个关键步骤进行了标准化。小鼠心脏使用HTK溶液停跳，并置于冰冻HTK溶液中保存，模拟临床实践操作。每颗心脏的HTK溶液灌注体积和输注时间均通过计时器严格监控。供体心脏保存于预冷的含HTK溶液离心管中，并置于4 °C环境中冰上保存。插管时间在灌注前标准化为约3分钟。上述所有步骤确保了冷保存时间是本研究中的主要变量。
灌流开始时，通常会观察到心脏收缩力不规则的现象，持续约20分钟。这一平衡与恢复阶段得益于心肌组织的逐步升温与氧合。初始20分钟后，预期心脏活动进入相对稳定的状态。在初始平衡期结束后约18分钟，将球囊插入心室腔内。待心脏稳定约25分钟且球囊插入后，开始记录血流动力学数据。使用KH缓冲液灌流可维持心脏功能稳定约1.5至2小时。因此，我们选择在左心室和右心室中各记录20分钟的血流动力学数据。
采用逆行灌注方法研究心脏冷保存后原发性移植物功能障碍（PGD）存在若干局限性。首先，由于球囊尺寸以及每个心室腔内空间有限（尤其是右心室），将两个球囊同时插入左心室（LV）和右心室（RV）非常困难。因此，我们只能依次测量右心室和左心室的功能。需要特别注意的是，室间隔对左心室和右心室的功能均有显著贡献。室间隔贡献了右心室功能的约50%，因此存在心室间依赖性15。此外，还需注意的是，小鼠心脏在Langendorff装置中再灌注的操作耗时约3分钟，而将人类心脏植入相对温暖的手术区域则需要约45分钟。相比之下，本Langendorff系统中的小鼠心脏所经历的缺血时间更短。在考虑临床转化时，这一点必须予以充分考虑。
由于我们使用不含血液的KH缓冲液对心脏进行灌注，这可能也会导致氧气输送效率降低。然而，在初始1.5至2小时的灌注过程中，心脏功能相对稳定，因此能够进行可靠的血流动力学测量。遗憾的是，目前尚无适用于这些较小啮齿类动物心脏的有效工作心脏灌注模型，且该系统无法评估心室负荷的影响。尽管如此，该灌注系统具有高度可重复性，且相较于移植模型更省力、耗时更短。此外，其成本也低于移植研究，可能更适用于筛选不同的治疗方案及多种分子通路。通过在保存液中添加候选药物进行改良后，该平台可用于评估药物对减轻左心室和右心室原发性移植物功能障碍（PGD）的作用。

心脏移植可改善终末期心力衰竭患者的生存率和生活质量1。然而，心脏供体的短缺限制了能够从该疗法中获益的患者数量，也限制了临床医生将供体与受体进行最佳匹配的能力2,3,4。此外，自2018年以来，新的分配系统导致缺血时间延长，并显著增加了边缘供体的使用5。因此，尽管心脏保存策略已取得显著进展，心脏供体的平均年龄和缺血时间仍呈逐年上升趋势，导致原发性移植物功能障碍（PGD）的发生率升高6。
原发性移植物功能障碍（PGD）可影响左心室、右心室或双侧心室，是一种危及生命的并发症，也是心脏移植后早期死亡的首要原因。鉴于其对心脏受者可能产生的挽救生命的重要影响，研究PGD的发病机制并开发更优的心脏保存策略显得尤为重要。因此，建立能够在长时间保存后对供体心脏功能进行可靠且稳健评估的实验模型，对于深入理解PGD并推动新型治疗方法的研发至关重要。能够在小鼠心脏中准确评估心功能的技术，使得研究人员可以利用大量可用的转基因小鼠模型，从而精确识别PGD的潜在机制。
在生理学和药理学研究中，Langendorff 逆行灌注模型被广泛用于评估心脏功能7。具体而言，通过连接至压力传感器的硅胶球囊置于左心室（LV）腔内来检测心功能。原发性移植物功能障碍（PGD）的一个关键特征是心室肌收缩和舒张功能不足。以往的 Langendorff 研究主要集中在使用左心室球囊以获得可靠且可重复的左心室功能评估结果8,9,10。然而，利用球囊系统通过心腔内球囊评估右心室（RV）功能的应用尚不广泛。 
鉴于移植后右心室（RV）发生原发性移植物功能障碍（PGD）的比例较高11，建立可同时研究左心室（LV）和右心室功能的实验方法，将有助于阐明导致右心室PGD的分子与生理机制。本方案表明，心腔内硅胶球囊可在同一只小鼠心脏中可靠地评估左心室和右心室功能12。为评估Langendorff系统在PGD研究中的潜在应用价值，我们检测了不同保存时间下的心脏功能，发现随着小鼠心脏冷保存时间的延长，其收缩和舒张功能均有所下降。有趣的是，左心室的功能下降程度高于右心室。综上所述，本文所述方案可用于评估候选药物及分子通路对左心室和右心室功能的影响。该方法在小鼠心脏上的应用将有助于开展深入的机制性研究。

<table><tbody><tr><td>4-0 丝线缝合线</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUTS108</td><td></td></tr><tr><td>6-0 丝线缝合线</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUTS104</td><td></td></tr><tr><td>通用面粉</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 通用型和 PrecisionGlide 皮下注射针头 22 G</td><td>Fisher scientific</td><td>14-826-5A</td><td></td></tr><tr><td>BD 带鲁尔锁扣头的注射器（无针头）</td><td>Fisher scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>玉米糖浆</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK 溶液</td><td>Essential Pharmaceuticals LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖剪&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393/14394</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆底离心管</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>来源于猪肠黏膜的肝素钠盐&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Henseleit 缓冲液</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Nusil 有机硅分散剂</td><td>Avantor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌注系统</td><td>Radnoti</td><td>130101BEZ</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab</td><td>ADInstruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Sigma</td><td>X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

评估 离体 langendorff 模型中的小鼠双心室功能

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

原发性移植物功能障碍（PGD）仍是心脏移植后早期死亡的首要原因。冷保存期间缺血时间延长是PGD的重要危险因素，而对心脏功能进行可靠评估对于研究供体心脏在冷保存后的功能反应至关重要。随附视频介绍了一种利用小鼠评估右心室和左心室功能的技术 离体 基于Langendorff模型的灌注方法，用于评估不同冷保存时长后的心脏功能。简言之，将心脏离体后置于低温组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）溶液中保存。随后，在Langendorff模型中用Kreb缓冲液对心脏进行60分钟的灌注。将硅胶球囊分别插入左心室和右心室，记录心脏功能参数（如dP/dt、压力-容积关系）。该方案可对不同心脏保存方法后的心脏功能进行可靠评估。重要的是，该技术可特异性研究天然心肌细胞在心脏保存过程中的反应。利用体积微小的小鼠心脏，可广泛使用多种转基因小鼠模型，以深入探究原发性移植物功能障碍（PGD）的机制。

取3月龄成年C57Bl/6小鼠心脏，收获后连接至Langendorff系统。供体心脏在HTK溶液中分别保存0和8小时，随后用含氧KH缓冲液进行灌注。通过连接压力传感器的硅胶球囊测量左心室和右心室功能的收缩与舒张。
主动脉压力维持在70-80 mmHg范围内。在储存0小时和8小时的小鼠心脏中，心率具有可比性。通过测量左心室（LV）和右心室（RV）的收缩压与舒张压来评估其功能。dP/dt是用于计算压力变化率的导数，用于确定压力动力学。最大dP/dt和最小dP/dt的绝对值可代表心肌收缩与舒张的程度。在0小时储存时，左心室的收缩压高于右心室（图2C 和 图3A）。灌注0小时储存后，左心室表现出比右心室更强的心肌收缩与舒张能力（图2C 和 图3B、C）。然而，在冷保存8小时后，左心室和右心室的功能均较0小时基线水平显著下降（图2A-D 和 图3B、C）。其中，左心室的心肌收缩功能下降更为严重。在储存8小时后，左心室的收缩和舒张功能分别为0小时基线水平的25.1%和30.7%，而右心室则分别为基线水平的32.5%和29.1%（图3B、C）。这些结果表明，在长期保存后，左心室的原发性移植物功能障碍（PGD）导致的心肌收缩功能下降比右心室更为显著。
<img alt="器官灌注装置；用于研究的心脏预处理；血管连接细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：小鼠心脏的固定与插管。（A）灌注装置的整体设置。1. 灌注储液器。2. 氧合室。3. 气体捕集室。4. 心脏室。5. 用于恒定流速与压力的阀门切换开关。6 和 7. 氧气进气口。（B）已插管的心脏，右心室位于前方。（C）为打开右心室腔需进行切割的位置。（D）用插管轻敲球囊导管。缩写：RV = 右心室。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏功能图；rdp dt、灌注、压力随时间变化；0小时和8小时时的右心室、左心室数据；科学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：比较左心室与右心室的功能。（A）供体心脏在保存0小时时，右心室和左心室的最大与最小dP/dt追踪记录。（B）供体心脏在保存8小时时，右心室和左心室的最大与最小dP/dt记录。（C,D）在0小时和8小时时，左心室和右心室的dP/dt、左心室压力、心率及灌注压的详细数据。缩写：RV = 右心室；LV = 左心室；dP/dt = 压力-时间变化率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示0小时和8小时收缩期、舒张期压力和dP/dt变化的心脏功能柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：比较左心室与右心室在保存和灌注后的心脏功能。（A）左心室和右心室在保存0小时和8小时后的收缩压与舒张压。（B）最大dP/dt和（C）灌注后左心室和右心室在保存0小时和8小时后的最小dP/dt。此图引自Lei等12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在冷保存后利用离体心脏灌注系统可靠定量供体心脏左右心室功能的实验方案 离体 灌注系统

评估 离体 Langendorff 模型中的小鼠双心室功能

原发性移植物功能障碍（PGD）仍是心脏移植后早期死亡的首要原因。在冷保存期间延长的缺血时间……

通过所述方案，我们可以比较供体心脏左心室在保存前后的心室功能，并可研究在保存过程中两个心室之间保存生物学特性的差异。该技术利用离体灌注系统来评估心脏保存后的心功能，为筛选改善供体心脏保存后功能的新疗法提供了强大且可靠的工具。按照文中所述方法准备面团，并取一小块面团塑造成椭圆形，作为头部。将其固定在一根干意面的一端。将头部浸入已配制好的糖溶液中，待其表面均匀覆盖一层薄薄的溶液后，缓慢取出。然后，将意大利面 strand 悬挂在聚苯乙烯泡沫块或其他支架上，使头部形成均匀且有光泽的涂层，并过夜干燥。第二天，将模具浸入分散于二甲苯中的硅橡胶中，然后将意大利面 strand 重新放回聚苯乙烯泡沫块中，在 37 摄氏度下放置两小时或直至干燥。重复此步骤一次。然后，将模具放入水中以分离并收集球囊。将球囊保存在0.02%叠氮化钠中。现在，从22号针头截取两段钝端，将其中一钝端连接至硅胶球囊，另一钝端连接至PE导管。使用4-0丝线将球囊固定在针头上。取C57Black/6小鼠，向其腹腔内注射200单位肝素以进行抗凝。通过脚趾夹捏确认麻醉效果后，在胸骨下方做一切口。用剪刀剪开肋骨处的膈肌，打开胸腔。然后将前胸壁折叠，充分暴露胸腔，并在靠近主动脉弓的降主动脉处进行剪切。随后，将小鼠的心脏、肺和胸腺转移至冰冷的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）缓冲液中，以分离器官。通过去除周围结缔组织暴露主动脉。将主动脉末端连接至22号针头，并用6-0丝线结扎固定。确保导管位于主动脉根部上方，以免影响主动脉瓣功能。用预冷至4°C的10毫升HTK缓冲液灌注主动脉，持续约10分钟。根据实验类型，可将心脏置于含有冰冻HTK缓冲液的50毫升离心管中保存8小时，或立即进行灌注。进行灌注时，将安装在针头上的心脏连接至Langendorff装置的插管，并用丝线缝合固定。以每分钟3毫升的恒定流速模式开始灌注，随后切换至70至80毫米汞柱的恒定压力模式，并将灌注速率调整至约每分钟6毫升。接下来，将一个未充气的注水硅胶球囊通过三通阀连接至压力传感器和一个注水注射器。在前一灌注阶段结束后，经过15至20分钟的平衡期，剪开右心房（RA），并通过右心房将球囊插入右心室（RV）。使用胶带将球囊固定在右心室内，并尽量减少右心房的开放面积，以帮助将球囊限制在心室内。在采集右心室（RV）功能数据20分钟后，剪开左心房（LA），通过左心房将一个未充气的注水球囊插入左心室（LV）。使用胶带将球囊固定在左心室内。为校准压力传感器，首先用温盐水充满一个10毫升的注射器，并通过三通阀将注射器连接到传感器室。打开阀门，缓慢用盐水填充传感器室，然后关闭所有阀门并取下注射器。接着，将充满盐水的传感器室连接到压力传感器上，将压力表连接至三通阀的第三个端口。在记录软件中，从连接换能器的通道下拉菜单中选择“Bridge Amp”选项。开始记录前，单击“0”以将换能器读数校准至零毫米汞柱。记录数秒后，缓慢推动注射器，将压力逐渐升高至100。单击“停止”以结束记录。在“单位转换”对话框中，选择记录中对应0毫米汞柱的区域，然后在输入0毫米汞柱之前，单击箭头指向1。类似地，选择记录中对应100毫米汞柱的区域。点击箭头至 2 并输入 100 毫米汞柱。现在，点击“确定”以校准换能器。校准完成后，将对应带有球囊的压力换能器的通道重命名为心室压力或左心室压力（LV Pressure），并在心脏连接至系统后开始记录。将球囊插入心室后，通过三通阀使用微量注射器调节球囊内的水量，使心室舒张末期压力维持在5至10毫米汞柱。接下来，将一个空白通道重命名为dP/dt，并将导数源通道保持为心室压力。该通道用于记录心室收缩期间心腔内压力变化的速率。在进入血压模块设置之前，选择测量的稳定时间段。然后，选择LV压力作为输入通道，并在点击选择后按OK。接着，点击分类视图以去除任何异常的心动周期，并点击表格视图以生成所选时间段内最大dP/dt和最小dP/dt的平均值表格。当小鼠心脏在灌注前于HTK缓冲液中保存零小时时，左心室（LV）记录到的收缩压高于右心室（RV）。此外，与右心室相比，左心室还表现出明显更强的肌肉收缩及舒张能力。然而，在心脏经历八小时冷保存后进行灌注时，左心室（LV）和右心室（RV）的功能均较零小时阶段显著下降。其中，左心室功能下降程度较右心室更为严重。经过八小时保存后，左心室的收缩和舒张功能分别为零小时基准的25.1%和30.7%，而右心室则分别为32.5%和29.1%。这表明，在长时间保存后，左心室的原发性移植物功能障碍较右心室更为显著。保存质量在很大程度上取决于HTK的灌注效果。确保灌注的一致性对于精确比较不同处理至关重要。通过精确测量供体心脏的保存功能，该方法可易于用于筛选能够改善供体心脏功能的药物，并进一步利用异位移植模型进行验证。

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科研

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Medicine

医学

Langendorff 模型中离 体 小鼠双心室功能的评估

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