一种基于发光二极管的自制光动力治疗装置用于增强维替泊芬在二维细胞培养模型中的细胞毒性

光动力疗法（PDT）在癌症治疗中具有多项优势，其疗效依赖于光源激活光敏剂。尽管该领域已取得最新进展，但在体外模型中仍缺乏可及的、价格低廉且可重复使用的PDT设备。为满足这一需求，本研究介绍了一种新型、简单且低成本的细胞培养光动力疗法检测装置，命名为PhotoAct。

开始制作时，将三毫米厚的中密度纤维板（MDF）锯成具有以下尺寸的板材。制作两个具有以下尺寸的盒子。在较大盒子的背面钻孔，用于安装筒形插孔连接器。

同时在较大盒子的顶部，以及较小盒子的顶部和底部钻孔，以提供电线穿过的通道。用黑色墨水涂刷所有内表面，以促进光线均匀入射。在较小盒子内侧上表面并联安装三条LED灯带，每条灯带包含10个LED。

此外，在较小盒子底部内表面的中心位置安装一个亮度传感器。使用配套的3D打印文件打印控制单元的结构。将所有组件、电源按钮、电位器、时间启动触摸板、LED、亮度传感器、LCD、蜂鸣器、电源以及安装在控制单元内部的ESP-32控制器板的各个部件进行安装。

上传补充文件中提供的编程代码，并运行测试以检查所有连接是否正常工作。组装箱体并将其固定在一起，以避免出现缝隙，从而防止外部光线干扰和光线直接泄漏。将安装好的控制单元固定在原型顶部的钻孔区域。

使用相同材料制作前门，尺寸如下，并通过铰链和魔术贴将其固定在外箱上，以确保腔室密闭和实验过程不受干扰。同时安装把手，以便更方便、精确地操作前门。在原型底部安装四个橡胶脚垫，以确保操作过程中的稳定性。

在含10%胎牛血清和1%庆大霉素的低糖杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养HeLa细胞系。将培养瓶置于5%二氧化碳、37摄氏度的培养环境中。持续管理和观察细胞培养状态，直至细胞融合度达到80%至90%。

从接种步骤开始进行细胞活力检测方案。从长满 HeLa 细胞的培养瓶中移除培养基。用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶，并按照高亮显示的细节使用胰蛋白酶消化细胞使其脱离。

用血细胞计数板对重悬的细胞进行计数，并以每孔 20,000 个细胞的浓度接种至多孔微孔板中。分别准备两块微孔板用于暗处理和光照处理条件，于 37°C 培养 24 小时以使细胞贴壁。进行光敏剂处理时，吸出两块板中的培养基，每孔加入 100 µL 不同浓度的 Verteporfin 进行处理。

将细胞继续处理24小时，以使维替泊芬充分内化。孵育结束后，移除处理液，用PBS洗涤细胞，并加入不含药物的培养基。用铝箔包裹其中一块微孔板，以避免光照，并将其孵育24小时。

该微孔板将为后续的PDT结果分析提供对照数据。另一块微孔板将在PhotoAct中用于光照条件处理。操作设备时，将其插入电源插座，然后按下电源按钮启动。

将多孔微孔板放入光动力治疗室中，并用侧面的魔术贴带固定前门以关闭设备。设置设备时，使用电位器调节光发射的RGB配置。按压加/减触摸板以调整时间设置，并设定实验持续时间。

检查显示屏上是否显示了关于检测的正确信息，并在必要时进行最后调整。按下启动触摸板以开始检测。实验开始时必须听到一声蜂鸣声。

实验过程中，可在显示屏上观察到辐照度和剩余时间等进度信息。光动力治疗检测期间，请勿打开前面板或更改任何设置。检测结束时，应听到四声蜂鸣提示音，电子系统将自动关闭所有LED灯。

在显示屏上可以观察到完成的消息以及实验过程中消耗的最终能量值。根据高亮显示的公式计算最终的光通量值。盖好经过光照处理的微孔板，并进行24小时的孵育。

孵育结束后，弃去两块培养板中的培养基，用 PBS 洗涤细胞单层，加入 MTT 溶液。将两块培养板分别在避光和光照条件下孵育 4 小时，以促进甲臜晶体的形成。小心吸去 MTT 溶液，用 DMSO 和乙醇的混合溶液溶解紫色晶体。

完全溶解晶体后，使用酶标仪在595纳米波长下进行吸光度测定。最终产品由一个暗室构成，其上部内表面装有一组30个分散排列的发光二极管（LED），这些发光二极管被编程以发射不同光谱的可见光。由于内表面反射率较低且LED分布均匀，从而实现了均匀的光照入射。

该装置的操作界面友好，且稳定的实验条件具有可重复性。作为概念验证，该设备被用于在光照后增强Verteporfin在2D HeLa细胞培养中的细胞毒性作用。如图所示，在光照条件下，GI50值为3.1微摩尔。

暗条件下的浓度为13.8微摩尔。因此，光照条件下效率提升超过四倍，证实了维替泊芬可作为光敏剂，以及PhotoAct在光动力疗法（PDT）检测中的适用性。为验证本研究中所述原型装置的有效性，在相同的实验条件下（包括光敏剂、细胞和光剂量）使用了一款商用PDT设备，并对结果进行了比较。如图所示，两种装置对维替泊芬的光激活效果相当，均增强了其细胞毒性作用。

最后，通过使用DCFDA检测法进行流式细胞术分析，证实了维替泊芬在光照后通过活性氧介导的细胞死亡。总之，该装置使用市售的低成本组件即可轻松构建，总成本低于50美元。该装置的其他主要优点包括便携性、低维护需求、能够照射多种类型的培养板、每次实验可同时使用最多四个单元、照射精确且可重复、用户界面友好且设置简单，无需连接计算机或其他设备。

此外，本文提供了一个决策流程图，以系统化的问题解决方法来查找并纠正操作过程中出现的问题或错误。这些成果有助于进一步拓展 PhotoAct 的应用优势，推动光动力疗法（PDT）在科学研究中的应用，探索光敏剂的作用机制及其临床应用。