Name: 一种内部构建的基于发光二极管的光动力治疗设备，用于增强维替泊芬在 2D 细胞培养模型中的细胞毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 了解如何使用低成本PhotoAct光动力治疗设备进行HeLa细胞培养实验。该装置采用发光二极管激活维替泊芬，为癌症研究提供可重复且经济实惠的体外光动力治疗方案。

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感谢Arthur Henrique Gomes de Oliveira和Lucas Julian Cruz Gomes在拍摄过程中的协助。本项目得到了巴西研究理事会（CNPq，资助编号400953/2016-1和404286/2021-6）以及Araucária基金会-PPSUS 2020/2021（SUS2020131000003）的支持。本研究还部分由巴西高等教育人员改进协调机构（CAPES）资助，资助代码001。

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和软件的详细信息，请参见材料表。
1. 装置构建
<ol>
	<li>将厚度为 3 mm 的中密度纤维板（MDF）锯切成如图 1A所示尺寸的板材。 
	注意：使用矢量文件（补充文件 1）进行数控（CNC）切割。</li>
	<li>制作两个盒子，其尺寸（长 × 宽 × 高）分别为：大盒子 330 mm × 235 mm × 225 mm，小盒子 300 mm × 220 mm × 150 mm（图 1B）。</li>
	<li>在大盒子背面钻孔以安装筒形插孔连接器；在大盒子顶部以及小盒子的顶部和底部钻孔，以便为电线提供穿行通道（图 1C）。</li>
	<li>用黑色墨水涂刷所有内表面，以促进光线均匀入射（图 1D）。</li>
	<li>在小盒子内部上表面并联安装三条 LED 灯带，每条灯带包含 10 个 LED（图 1E）。</li>
	<li>在小盒子内部底面中心位置安装一个亮度传感器（图 1F）。</li>
	<li>使用 3D 打印文件（补充文件 2）打印控制单元的结构（图 1G）。</li>
	<li>将所有组件（电源按钮、电位器、时间/启动触摸板、LED、亮度传感器、LCD、蜂鸣器和电源）安装到固定于控制单元内部的 ESP32 控制板的对应接口上（图 2）。</li>
	<li>上传编程代码（补充文件 3、补充文件 4 和 补充文件 5），并运行测试以检查所有连接是否正常工作（图 1H）。</li>
	<li>组装两个盒子并将其牢固连接，避免出现缝隙，从而防止外界光线干扰和发射光损失。将安装好的控制单元固定在原型顶部的钻孔区域（图 1I）。</li>
	<li>使用两个小铰链在大盒子上安装一个由相同材料制成、尺寸为 330 mm × 225 mm（长 × 宽）的前门。同时，在大盒子侧面粘贴魔术贴带，以加强原型的闭合密封性（图 1J）。安装把手以便操作设备前门。</li>
	<li>在原型底部安装四个橡胶脚垫，以确保操作过程中具有更高的稳定性（图 1K）。</li>
</ol>
2. 细胞系：培养、接种与处理
<ol>
	<li>化学品
	<ol>
		<li>将卟啉溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成100 mM的溶液。 
		注意：DMSO必须小心操作（需佩戴个人防护装备并在通风良好的环境中操作）。操作原液及稀释液时均应避免强光暴露。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞系
	<ol>
		<li>在添加10%胎牛血清和1%庆大霉素的低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养 HeLa 细胞系。</li>
		<li>将培养瓶置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养。</li>
		<li>持续培养并观察细胞，直至细胞融合度达到80%–90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种过程
	<ol>
		<li>从培养瓶中移除培养基。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞单层。</li>
		<li>加入0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液，37 °C孵育5分钟以解离融合的细胞。用含10%胎牛血清和1%庆大霉素的培养基重悬细胞，以终止胰蛋白酶的消化作用。</li>
		<li>使用血细胞计数板对重悬的细胞进行计数，并以每孔2.0 × 104个细胞的密度接种至96孔板中。</li>
		<li>准备两块96孔板，分别用于暗环境和光照条件下的实验。</li>
		<li>将96孔板在培养箱中孵育24小时，使细胞充分贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理过程
	<ol>
		<li>从两块96孔板中移除培养基。</li>
		<li>向细胞中加入100 µL不同浓度的维替泊芬（0.045 至 24 µM，梯度稀释）。</li>
		<li>药物处理细胞24小时，以促进维替泊芬的细胞内化。</li>
		<li>24小时后，弃去含药培养基，用PBS（100 µL）洗涤细胞单层，然后加入不含药物的新鲜培养基（100 µL）。</li>
		<li>将其中一块微孔板用铝箔包裹，避免光照，并继续孵育24小时，作为光动力治疗结果的对照组（暗条件）。另一块微孔板则用于后续在设备中进行光照处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 设备操作
<ol>
	<li>将PDT设备插入电源插座，并按下电源按钮以开启设备。</li>
	<li>将另一块微孔板（光照条件）放入PDT设备中，并用魔术贴带固定前门以关闭设备。</li>
	<li>使用电位器调节RGB配置（本实验采用RGB 255, 255, 255），并设定发光颜色。 
	注意：每种RGB组合具有特定的发射光谱，必须根据不同的光敏剂及其相应的吸收曲线进行调整。</li>
	<li>按下(+)/(-) 触控面板，调节时间设置（本实验为60分钟），以设定实验的持续时间。 
	注意：时间设置与辐照度值共同决定处理过程中的能量密度——即实验中施加的光剂量。</li>
	<li>在显示屏上检查设置信息。</li>
	<li>按下启动按钮以开始实验。确保实验开始时听到一声蜂鸣提示音。</li>
	<li>在实验过程中，观察显示屏上的实时信息，例如辐照度和剩余时间。</li>
	<li>在PDT实验过程中，请勿打开前门或更改任何设置。</li>
	<li>实验结束后，等待四声蜂鸣提示音，并等待电子系统关闭所有LED灯。观察显示屏上显示的完成信息以及实验过程中消耗的最终能量——能量密度。 
	注意：能量密度的最终值通过公式（1）计算： 
	<img alt="能量密度公式：F=I×s；光子学研究中能量暴露量的计算示意图。" src="/files/ftp_upload/64391/64391eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> (1) 
	其中F的单位为J/cm2，I的单位为mW/cm2或mJ/s·cm2。辐照度值考虑了LED灯的功率（发射源）以及暗室中均匀照射的面积（660 cm2）（公式[2]）： 
	<img alt="辐照度计算公式 I=功率/照射面积，光学物理方程。" src="/files/ftp_upload/64391/64391eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> (2) 
	理论辐照度值在整个PDT实验过程中均显示在设备屏幕上。操作结束后，使用公式（3）计算能量密度： 
	能量密度 (F) = 辐照度 (I, 恒定值) × 操作时间 (s) (3)</li>
</ol>
4. 细胞活力检测
<ol>
	<li>光动力治疗实验后，盖好已暴露于光照下的微孔板，并于37°C孵育24小时。</li>
	<li>孵育结束后，移除两块微孔板中的培养基，用PBS（100 µL）洗涤细胞单层，然后加入MTT溶液（0.5 mg/mL，100 µL）。将处于黑暗和光照条件下的微孔板均在37°C孵育4小时，以促进甲臜晶体的形成。</li>
	<li>小心移除MTT溶液，并用DMSO/乙醇（1:1）溶液溶解紫色晶体。</li>
	<li>待晶体完全溶解后，使用酶标仪在595 nm波长下测定吸光度。 
	注意：该设备还可用于其他重要实验，例如通过流式细胞术检测光敏剂在光照后介导的活性氧诱导的细胞死亡30。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

最终的PhotoACT装置使用市售的低成本组件即可方便地构建，总成本低于50美元。其他优点包括维护需求低、能够照射多种类型的培养板、每次实验可同时使用最多四个装置单元、重量轻（2 kg）/体积小（44 cm3），便于携带，照射精确且可重复（数据未显示），以及用户友好的简易设置界面，无需连接计算机或其他设备。
在项目构思过程中，构建和操作流程中的某些关键步骤带来了改进的机会。由于PDT腔室需要均匀的光发射和一致的能量测量，因此对内部和外部箱体进行了密封，以避免外部光线干扰以及发射光的损失。在前门侧面额外固定了魔术贴带，以加强腔室的闭合，确保实验的连续性。在控制单元上安装了一个代表性LED，用于确认所需的RGB配置，指示实验过程中发射光的颜色和强度。最后，编程代码经过多次升级，以优化瞬时密度测量和最终能量评估的精度，从而保证实验的可重复性和数学一致性。其他需要特别注意的主要细节包括：（i）LED的均匀分布以及亮度传感器的中心定位，以获得具有代表性和平衡性的结果；（ii）根据电路图（图2）和编程代码（<st...

在致死性最强的非传染性疾病中，癌症是导致过早死亡的全球首要原因之一。2020年，癌症导致了近1000万人死亡，约占全球死亡总人数的六分之一1。此外，多药耐药（MDR）现象构成了重大的公共卫生威胁，因为现有的化疗方案在该临床状况下无法达到缓解阶段2。癌细胞可通过多种机制对化疗产生耐药性，但ATP结合盒（ABC）转运蛋白——即ATP依赖性外排泵——的过表达被认为是肿瘤微环境中MDR形成的主要原因3。除了MDR之外，癌症的其他并发症，如复发和转移，进一步凸显了开发和改进治疗策略以应对这一肿瘤学挑战的紧迫性。
利用光进行治疗已有数个世纪的历史4，光动力疗法（PDT）是一种临床批准用于实体瘤治疗的治疗手段。PDT通过给予光敏剂（PS），随后进行光照，从而产生活性氧（ROS），在肿瘤细胞中发挥选择性细胞毒性作用。该治疗方法优于包括手术、放疗和化疗在内的传统方法5；它是一种微创技术，对结缔组织的细胞毒性较低6。在肿瘤局部或其微环境中直接施加光照并使光敏剂富集，可实现精确定位，从而显著减少不必要的全身副作用7，并允许在同一部位重复治疗。此外，其治疗成本低于其他方法。由于具有这些良好的特性，PDT可作为单一治疗手段（尤其适用于无法手术切除的肿瘤）或辅助性癌症治疗的合适选择7，同时也是应对化疗相关多药耐药性（MDR）的一种替代方案8,9。
首次报告使用PDT显示出高客观缓解率的研究于1975年在小鼠和大鼠模型中被描述10此后，已开展多项采用光动力疗法（PDT）的研究，并取得了积极成果7 两者 体内 和 体外 使用二维细胞培养中的人类肿瘤细胞系11,12考虑到临床上批准的光敏剂（PS）具有广泛的适用性，无论其具体的富集途径和吸收峰波长范围如何，其一般过程如下：（i）光敏剂摄取，（ii）光敏剂在肿瘤或其微环境中浓度达到峰值，（iii）光照，（iv）光敏剂与光的相互作用，（v）光敏剂激发态能量向组织底物或周围氧分子的转移，（vi）活性氧（ROS）的产生，涉及单线态氧或超氧阴离子，（vii）肿瘤细胞死亡 通过，本质上包括坏死或凋亡（直接死亡）、自噬（细胞保护机制）、组织缺血（血管损伤）、免疫调节，或上述机制的综合作用7在此最后阶段，特定细胞死亡通路的激活取决于多种因素，例如细胞特性、实验设计，以及最重要的磷脂酰丝氨酸（PS）的细胞内定位和光动力治疗（PDT）相关的靶向损伤。13.
维替泊芬是一种第二代光敏剂，已获监管机构批准在挪威和中国用于治疗年龄相关性黄斑变性7。给药后，该前体药物被报道可部分积聚于线粒体14，并诱导细胞蛋白酪氨酸磷酸化和DNA片段化，从而导致肿瘤细胞凋亡15,16。在维替泊芬内化孵育24小时后，建议采用波长为690 nm的光动力疗法（PDT）方案，以实现向邻近分子有效传递电磁辐射能量7,17。
关于光动力疗法（PDT）的光源，传统的半导体二极管激光系统通常价格昂贵、技术复杂、体积庞大，因而难以便携18,19。由于其单波长特性，与基于LED的PDT设备类似，每种光敏剂的应用都需要独立的设备单元，这使得二极管激光系统的使用更加复杂且经济上不可行20,21。因此，LED设备的使用被认为是最具前景的替代方案，不仅可解决成本22和维护问题，还能提供高功率输出23，并具有更低的危害性以及更广泛的照射能力24,25,26,27。
尽管基于LED的设备可能为PDT实验带来的潜在贡献28，大多数商用方案仍然存在一些缺点，例如缺乏便携性、成本高昂，以及复杂的施工和操作过程29本研究的主要目的是提供一种简单且可靠的工具，用于 体外 光动力疗法（PDT）检测。本文介绍了一种名为PhotoACT的自研LED基PDT装置，该装置成本低、操作简便且便于携带。作为概念验证，本研究显示该设备可增强维替泊芬在二维细胞培养模型中的细胞毒性，因此可作为PDT实验中的研究工具。

<table><tbody><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA（10倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>哺乳动物细胞培养解离试剂</td></tr><tr><td>3D 打印机</td><td>Flashforge</td><td></td><td>Finder 型号</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td></td><td></td><td>非无菌、聚苯乙烯材质、平底、高结合表面的孔板，用于二维细胞培养</td></tr><tr><td>Arduino</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>亮度传感器</td><td></td><td></td><td>TSL2561 型号，检测范围为 0.1–40,000+ 勒克斯，带 I2C 接口</td></tr><tr><td>按钮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蜂鸣器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td></td><td></td><td>无菌、聚苯乙烯材质、矩形底、带组织培养（TC）处理表面、倾斜颈和通气盖的培养瓶（不同规格）</td></tr><tr><td>离心管</td><td></td><td></td><td>无菌聚丙烯材质，容量为 15/50 mL，用于实验接种步骤中的细胞培养稀释</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>控制板</td><td></td><td></td><td>ESP32</td></tr><tr><td>设计软件</td><td>Trimble</td><td></td><td>SketchUp</td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）是一种广泛使用的基础培养基，用于支持多种哺乳动物细胞的生长</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540-500ML</td><td>二甲基亚砜，&amp;ge;99.5%（GC），适用于植物细胞培养</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12657029</td><td>FBS 通过在长期传代过程中提供稳定的细胞生长表现，具有最佳使用价值</td></tr><tr><td>庆大霉素（50 mg/mL）</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td>水溶性抗生素，最初从紫色小单孢菌&amp;nbsp;Micromonospora purpurea 中纯化获得，用于防止细胞培养污染</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td>采用 Neubauer 刻度的计数室，用于实验接种步骤中的细胞计数</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>DM IL LED</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td></td><td></td><td>通过在工作区域上方维持持续单向的 HEPA 过滤空气流，保护工作环境免受污染的设备，用于细胞培养和处理过程中的多个步骤</td></tr><tr><td>LCD 显示屏</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED RGB WS2812</td><td></td><td></td><td>5050 RGB SMD 型号，内置处理器，每米 30 个 LED，长度 1 米，功率 9 瓦</td></tr><tr><td>中密度纤维板（MDF）</td><td></td><td></td><td>厚度为 3 mm 的中密度纤维板</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td></td><td></td><td>无菌聚丙烯材质，带安全盖，容量为 1.5/2.0 mL，适用于实验处理步骤中对小体积液体的操作</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>ThermoFischer</td><td></td><td>Multiskan FC 微孔板光度计，可检测较宽波长范围的吸光度（340–850 nm），用于 MTT 孵育后评估细胞活力</td></tr><tr><td>MTT 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>M6494</td><td>3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，用于细胞活力检测</td></tr><tr><td>操作系统</td><td>Real Time Engineers ltd.</td><td></td><td>FreeRTOS</td></tr><tr><td>P10 移液器</td><td></td><td></td><td>非电子式、单通道，量程为 1–10 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td></td><td></td><td>非电子式、单通道，量程为 10–1000 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td></td><td></td><td>非电子式、单通道，量程为 20–200 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>PDT 设备</td><td>LumaCare</td><td></td><td>LC-122 型号</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>用于细胞培养和实验过程中细胞洗涤的平衡盐溶液</td></tr><tr><td>电位器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td>非无菌、通用型，最大容量为 10/200/1000 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>维替泊芬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0534-5MG</td><td>维替泊芬，&amp;ge;94%（HPLC）</td></tr></tbody></table>

一种基于发光二极管的自制光动力治疗装置用于增强维替泊芬在二维细胞培养模型中的细胞毒性

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

本文介绍了一种新型、简单且低成本的装置，用于执行 体外 光动力疗法（PDT）检测，命名为PhotoACT。该装置采用一组常规的可编程发光二极管（LED）、一个液晶显示器（LCD）模块以及连接至商用微控制器板的光传感器构建而成。原型机的箱体结构由中密度纤维板（MDF）制成，内部空间可同时容纳四块细胞培养多孔微孔板。
作为概念验证，我们研究了光敏剂（PS）维替泊芬在二维（2D）培养条件下对HeLa细胞系的细胞毒性作用。HeLa细胞用浓度递增的维替泊芬处理24小时。含药物的上清培养基被弃去，贴壁细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后加入不含药物的培养基。在本研究中，维替泊芬对细胞的作用在两种条件下进行评估：一种是不进行光照，另一种是在红-绿-蓝（RGB）值为255、255、255的光线下照射1小时（平均光剂量为49.1 ± 0.6 J/cm2）。24小时后，采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测细胞活力。
实验结果表明，将经维替泊芬处理的细胞暴露于该设备的光照下，可增强药物的细胞毒性作用 通过 一种由活性氧（ROS）介导的机制。此外，通过将本研究中所述原型的结果与商用光动力治疗（PDT）设备进行比较，验证了该原型的有效性。因此，这种基于LED的光动力治疗原型是一种良好的替代方案 体外 光动力疗法研究。

最终的光动力治疗（PDT）装置名为PhotoACT，包含一个暗室，可容纳最多四个多孔微孔板，其上部内表面装有一组30个分散排列的发光二极管（LED），可编程发射不同光谱的可见光（图3 和补充文件6）。该装置由两个相互关联的箱体构成：内部箱体设计为进行PDT实验的暗室，外部箱体则用于覆盖内部暗室并容纳控制单元（图1B）。内部箱体被涂成黑色（图1D），并配备一条长度为1米（后被切割为三段）、功率为9瓦、包含30个LED的LED RGB WS2812（或WS281B）灯带，该灯带内置处理器。该装置实现了更精确的控制，从而确保更准确的颜色发射。30个LED通过三条平行灯带均匀分布在PDT暗室的整个上部内表面，每条灯带包含10个LED（图1E）。由于黑色内表面反射率低，且LED布局均匀，因此实现了光照的均匀性。内部箱体底部中央还集成了一个TSL2561亮度传感器，用于指示光照强...

本文介绍了一种新颖、简单且低成本的装置，可成功利用二维培养的HeLa细胞和维替泊芬作为光敏剂，进行体外光动力疗法（PDT）实验。

本文介绍了一种新型、简单且低成本的体外光动力疗法（PDT）检测装置，命名为PhotoACT。该装置由……构建而成。

光动力疗法（PDT）在癌症治疗中具有多项优势，其疗效依赖于光源激活光敏剂。尽管该领域已取得最新进展，但在体外模型中仍缺乏可及的、价格低廉且可重复使用的PDT设备。为满足这一需求，本研究介绍了一种新型、简单且低成本的细胞培养光动力疗法检测装置，命名为PhotoAct。开始制作时，将三毫米厚的中密度纤维板（MDF）锯成具有以下尺寸的板材。制作两个具有以下尺寸的盒子。在较大盒子的背面钻孔，用于安装筒形插孔连接器。同时在较大盒子的顶部，以及较小盒子的顶部和底部钻孔，以提供电线穿过的通道。用黑色墨水涂刷所有内表面，以促进光线均匀入射。在较小盒子内侧上表面并联安装三条LED灯带，每条灯带包含10个LED。此外，在较小盒子底部内表面的中心位置安装一个亮度传感器。使用配套的3D打印文件打印控制单元的结构。将所有组件、电源按钮、电位器、时间启动触摸板、LED、亮度传感器、LCD、蜂鸣器、电源以及安装在控制单元内部的ESP-32控制器板的各个部件进行安装。上传补充文件中提供的编程代码，并运行测试以检查所有连接是否正常工作。组装箱体并将其固定在一起，以避免出现缝隙，从而防止外部光线干扰和光线直接泄漏。将安装好的控制单元固定在原型顶部的钻孔区域。使用相同材料制作前门，尺寸如下，并通过铰链和魔术贴将其固定在外箱上，以确保腔室密闭和实验过程不受干扰。同时安装把手，以便更方便、精确地操作前门。在原型底部安装四个橡胶脚垫，以确保操作过程中的稳定性。在含10%胎牛血清和1%庆大霉素的低糖杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养HeLa细胞系。将培养瓶置于5%二氧化碳、37摄氏度的培养环境中。持续管理和观察细胞培养状态，直至细胞融合度达到80%至90%。从接种步骤开始进行细胞活力检测方案。从长满 HeLa 细胞的培养瓶中移除培养基。用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶，并按照高亮显示的细节使用胰蛋白酶消化细胞使其脱离。用血细胞计数板对重悬的细胞进行计数，并以每孔 20,000 个细胞的浓度接种至多孔微孔板中。分别准备两块微孔板用于暗处理和光照处理条件，于 37°C 培养 24 小时以使细胞贴壁。进行光敏剂处理时，吸出两块板中的培养基，每孔加入 100 µL 不同浓度的 Verteporfin 进行处理。将细胞继续处理24小时，以使维替泊芬充分内化。孵育结束后，移除处理液，用PBS洗涤细胞，并加入不含药物的培养基。用铝箔包裹其中一块微孔板，以避免光照，并将其孵育24小时。该微孔板将为后续的PDT结果分析提供对照数据。另一块微孔板将在PhotoAct中用于光照条件处理。操作设备时，将其插入电源插座，然后按下电源按钮启动。将多孔微孔板放入光动力治疗室中，并用侧面的魔术贴带固定前门以关闭设备。设置设备时，使用电位器调节光发射的RGB配置。按压加/减触摸板以调整时间设置，并设定实验持续时间。检查显示屏上是否显示了关于检测的正确信息，并在必要时进行最后调整。按下启动触摸板以开始检测。实验开始时必须听到一声蜂鸣声。实验过程中，可在显示屏上观察到辐照度和剩余时间等进度信息。光动力治疗检测期间，请勿打开前面板或更改任何设置。检测结束时，应听到四声蜂鸣提示音，电子系统将自动关闭所有LED灯。在显示屏上可以观察到完成的消息以及实验过程中消耗的最终能量值。根据高亮显示的公式计算最终的光通量值。盖好经过光照处理的微孔板，并进行24小时的孵育。孵育结束后，弃去两块培养板中的培养基，用 PBS 洗涤细胞单层，加入 MTT 溶液。将两块培养板分别在避光和光照条件下孵育 4 小时，以促进甲臜晶体的形成。小心吸去 MTT 溶液，用 DMSO 和乙醇的混合溶液溶解紫色晶体。完全溶解晶体后，使用酶标仪在595纳米波长下进行吸光度测定。最终产品由一个暗室构成，其上部内表面装有一组30个分散排列的发光二极管（LED），这些发光二极管被编程以发射不同光谱的可见光。由于内表面反射率较低且LED分布均匀，从而实现了均匀的光照入射。该装置的操作界面友好，且稳定的实验条件具有可重复性。作为概念验证，该设备被用于在光照后增强Verteporfin在2D HeLa细胞培养中的细胞毒性作用。如图所示，在光照条件下，GI50值为3.1微摩尔。暗条件下的浓度为13.8微摩尔。因此，光照条件下效率提升超过四倍，证实了维替泊芬可作为光敏剂，以及PhotoAct在光动力疗法（PDT）检测中的适用性。为验证本研究中所述原型装置的有效性，在相同的实验条件下（包括光敏剂、细胞和光剂量）使用了一款商用PDT设备，并对结果进行了比较。如图所示，两种装置对维替泊芬的光激活效果相当，均增强了其细胞毒性作用。最后，通过使用DCFDA检测法进行流式细胞术分析，证实了维替泊芬在光照后通过活性氧介导的细胞死亡。总之，该装置使用市售的低成本组件即可轻松构建，总成本低于50美元。该装置的其他主要优点包括便携性、低维护需求、能够照射多种类型的培养板、每次实验可同时使用最多四个单元、照射精确且可重复、用户界面友好且设置简单，无需连接计算机或其他设备。此外，本文提供了一个决策流程图，以系统化的问题解决方法来查找并纠正操作过程中出现的问题或错误。这些成果有助于进一步拓展 PhotoAct 的应用优势，推动光动力疗法（PDT）在科学研究中的应用，探索光敏剂的作用机制及其临床应用。

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