Name: 体外 使用纯化的重组 果蝇 半胱天冬酶进行底物筛选的切割测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习使用纯化重组果蝇半胱天冬酶Dronc和Drice进行体外切割测定的方法，用于高通量筛选潜在底物。该方案适用于细胞凋亡和生化研究，可扩展至其他生物体。

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我们感谢Elif Kamber-Kaya博士在实验室建立本实验方案过程中提供的帮助。Guy Salvesen博士慷慨提供了DriceC211A突变体9。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属国立普通医学科学研究所（NIGMS）通过资助号2R35GM118330的MIRA奖项资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

1. 在细菌中表达重组型半胱天冬酶
<ol>
	<li>使用标准方案将目的基因（Caspase 或假定底物）克隆至带有 N 端和/或 C 端标签的细菌表达载体中23。 
	注意：标签可提高重组蛋白的溶解度，并用于重组蛋白的纯化。本实验中，Dronc、Drice 及其催化突变体被克隆至 pET28a 载体中，该载体提供 N 端 6xHis 标签（pET28a-6xHis-Droncwt、pET28a-6xHis-DroncC318A、pET28a-6xHis-Dricewt、pET28a-6xHis-DriceC211A）；（引物信息见 补充表 1）。</li>
	<li>使用标准方法将含有目的基因的载体转化至感受态 BL21 (DE3) pLysS E. coli 细胞中23,24。将转化混合物涂布于含适当抗生素的 LB 琼脂平板上（pET28a 使用卡那霉素）以筛选转化菌。 （参见 补充表 2。）</li>
	<li>从平板上挑取单菌落，接种于 5 mL 含适当抗生素的 LB 培养基中，在 37 ˚C、220 rpm 条件下于摇床中过夜培养。</li>
	<li>次日，准备含抗生素的 LB 培养基 30–50 mL（每样本），并加入 1 mL 过夜培养物。使用生物分光光度计或分光光度计测定 600 nm 处的光密度（OD600），应控制在 0.1 至 0.2 之间。</li>
	<li>在 37 ˚C、220 rpm 条件下继续于摇床中培养，直至 OD600 达到 0.6。每隔 1 小时检测一次 OD600，直至达到 0.6。此过程约需 2 至 3 小时。</li>
	<li>为诱导蛋白（caspase）表达，加入 IPTG 至终浓度为 0.1–0.2 mM（从 IPTG 储存液稀释 1:1,000–1:500，参见 补充表 2）。</li>
	<li>在 30 ˚C、220 rpm 条件下继续培养 3 小时。 
	注意：诱导时间与温度取决于所表达蛋白的类型及其溶解性。若表达不同的 caspase 或底物，可能需要调整条件。</li>
	<li>培养 3 小时后，将培养物于 4 ˚C、2,000 × g 条件下在 50 mL 离心管中离心 20 分钟。弃去上清液，保留沉淀物。 
	&#8203;注意：本方案可在此步骤暂停，后续继续进行。细菌沉淀可在 -80 ˚C 冷冻保存。</li>
</ol>
2. 小规模重组半胱天冬酶提取
<ol>
	<li>从-80 ˚C冰箱中取出含有菌体沉淀的冻存管，置于冰上10分钟，使沉淀软化。</li>
	<li>10分钟后，使用移液控制器配合1 mL刻度移液管，向含有沉淀的管中加入0.6 mL细菌细胞裂解缓冲液（补充表2），该缓冲液需新鲜添加蛋白酶抑制剂、10 mg/mL溶菌酶和50 U/mL苯并核酸酶。</li>
	<li>使用同一移液枪头反复吹打，使沉淀完全溶解，直至形成无沉淀颗粒的澄清淡黄色溶液。冰上孵育30分钟。</li>
	<li>将裂解液转移至适当的离心管中，在4 ˚C条件下以17,000 x g离心40分钟。</li>
	<li>将上清液转移至1.5 mL微量离心管中。此即含有半胱天冬酶（caspases）的粗提物。</li>
	<li>将管子保持在冰上，并立即进行Ni-NTA琼脂糖纯化步骤。</li>
</ol>
3. 小规模 His标签化caspase蛋白纯化
<ol>
	<li>向步骤2.5获得的每管caspase提取物中加入0.2 mL 50% Ni-NTA琼脂糖悬液。在4 ˚C下，将各管置于翻转摇床中孵育1小时。</li>
	<li>孵育1小时后，将含有Ni-NTA琼脂糖的提取液加入装有完整柱尖的1 mL聚丙烯柱中，置于支架上，静置5分钟。</li>
	<li>5分钟后，取下层析柱的盖子，让上清液依靠重力流出。</li>
	<li>小心加入 1 mL 洗涤缓冲液（补充表 2将溶液加入Ni-NTA琼脂糖柱中，避免扰动已装填的树脂，并通过重力流洗脱。</li>
	<li>洗涤步骤重复进行三次。</li>
	<li>为洗脱胱天蛋白酶，待洗涤缓冲液完全流尽后，将1.5 mL 微量离心管置于层析柱收集喷嘴下方。</li>
	<li>向每根柱中加入0.5 mL洗脱缓冲液（使用前立即添加1×蛋白酶抑制剂），并用1.5 mL微量离心管收集洗脱液。 
	注意：精细纯化的洗脱液将呈透明状。</li>
	<li>将洗脱液置于冰上，并使用Bradford法测定蛋白质浓度25通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色确认纯化半胱天冬酶的纯度和均一性26. 
	&#8203;注意：50 mL LB 培养液的收获量为 0.5 至 1.5 mg 半胱天冬酶蛋白。由于洗脱时使用 0.5 mL 洗脱缓冲液，蛋白浓度范围为 1 至 3 mg/mL。应使用纯化的半胱天冬酶洗脱液进行后续实验 体外 裂解和纯化当天进行切割实验，因为这些半胱天冬酶制备物在过夜后会失去活性。</li>
</ol>
4. 在无细胞表达系统中表达推定的caspase底物
注意：在本方案中，Dronc 的天然底物 Drice 通过两种方法制备：一是在大肠杆菌（E. coli）中进行重组表达（见上文第 3 节），二是在兔网织红细胞裂解液（RRL）中表达，后者是一种哺乳动物无细胞表达系统（本节，见下文）。
<ol>
	<li>使用标准方法将假定底物的基因克隆至含有T7、T3或SP6启动子的表达载体中23. 
	注意：在本方案中，DriceC211A 以该基因作为模式底物，克隆至载体pT7CFE1-N-Myc中，该载体含有T7启动子以驱动基因表达，并在目标蛋白底物的N端添加Myc标签，以便通过免疫印迹进行检测。</li>
	<li>在RRL中，候选底物可通过放射性或非放射性方法合成。
	<ol>
		<li>非放射性合成：在0.5 mL微量离心管中，加入25 µL RRL、2 µL反应缓冲液、0.5 µL氨基酸混合物-不含亮氨酸（1 mM）、0.5 µL氨基酸混合物-不含甲硫氨酸（1 mM）、1 µL核糖核酸酶抑制剂（40 U/µL）、2 µL DNA模板（0.5 µg/µL）和1 µL T7-RNA聚合酶。加入无核酸酶水，将反应体系终体积调整至50 µL。用移液器吹打或用枪头轻轻搅拌使组分混匀，短暂离心。 
		注意：RRL 裂解液含有 100–200 mg/mL 的内源性蛋白质。对于 体外 翻译反应中，加入终浓度为50%的RRL（此处为25 µL/50 µL反应体系）。</li>
		<li>放射性合成：在0.5 mL微量离心管中，加入25 µL RRL裂解液、2 µL反应缓冲液、0.5 µL甲硫氨酸缺失氨基酸混合物（1 mM）、1 µL核糖核酸酶抑制剂（40 U/µL）、2 µL DNA模板（0.5 µg/µL）、2 µL S35-标记的甲硫氨酸（1000 Ci/mmol，10 mCi/mL）和1 µL T7-RNA聚合酶。加入无核酸酶水，调整反应体系终体积至50 µL。用移液枪或枪头轻轻吹打混匀，短暂离心。将枪头和离心管弃置于放射性废物容器中。 
		注意：不要添加不含亮氨酸的氨基酸混合物。pT7CFE1 载体使用 T7 启动子进行蛋白表达。其他载体可能使用 T3 或 SP6 启动子，在此情况下应使用 T3 或 SP6 RNA 聚合酶替代 T7 RNA 聚合酶。请确保 DNA 模板具有高纯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 30 ˚C 下孵育反应 90 分钟。</li>
	<li>短暂离心10秒，将试管置于冰上。通过SDS-PAGE及免疫印迹/放射自显影检测RRL中假定底物的表达水平。 
	&#8203;注意：添加到切割反应中的RRL提取物的量应根据检测方法（免疫印迹或S）能够检测到的蛋白质量来确定。35 自显影）。继续进行 体外 切割实验（下一节）或于 -80 ˚C 保存。</li>
</ol>
5. 体外 使用RRL生成的底物进行切割实验
<ol>
	<li>采用第4节所述方法制备的潜在底物。在本实验方案中，使用N-Myc-DriceC211A作为模型底物。</li>
	<li>根据潜在底物的表达水平（需通过免疫印迹或放射自显影分析单独确定，见步骤4.4），在切割反应体系中加入1–10 µL经目标蛋白编程的兔网织红细胞裂解液（RRL）。</li>
	<li>加入在第1、2和3节中纯化获得的10 µg半胱天冬酶（caspase）蛋白。</li>
	<li>用caspase检测缓冲液将总体积补至50 µL。</li>
	<li>将反应体系置于30 ˚C水浴中孵育3小时。务必在切割反应中设置适当的对照；此处使用催化失活突变体DroncC318A作为对照。</li>
	<li>孵育3小时后，将反应管转移至冰上以终止反应。</li>
	<li>加入等体积含50 mM DTT的LDS上样缓冲液。加入LDS上样缓冲液后，反应被完全终止。</li>
	<li>将样品在75 ˚C金属浴中孵育10分钟。</li>
	<li>短暂离心，轻弹混匀，每样品上样24 µL，进行SDS-PAGE电泳（见第7节），或于-20 ˚C保存样品。</li>
</ol>
6. 体外 利用细菌表达的重组底物蛋白进行切割实验
<ol>
	<li>向一个0.5 mL微量离心管中加入10 µg纯化的候选底物（此处为在第1、2和3节中制备的6xHis-DriceC211A）。</li>
	<li>加入在第1和第2节中制备的10 µg纯化caspase蛋白。用caspase活性检测缓冲液将总体积调至50 µL。</li>
	<li>按照步骤5.5至5.9进行操作。</li>
</ol>
7. SDS-PAGE 和免疫印迹
<ol>
	<li>将切割反应产物（24 µL）上样至4%-12% Tris-甘氨酸或Bis-Tris梯度凝胶（材料表）中，按照标准操作进行蛋白质电泳及免疫印迹（若使用S35标记底物，则进行放射自显影）以检测结果27,28。 
	注意：本实验方案中采用的是Bis-Tris梯度凝胶，配合Mops电泳缓冲液和LDS上样缓冲液。通常情况下，使用Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液和SDS上样缓冲液的常规Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）方案效果也良好。</li>
</ol>

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作者声明无竞争利益。

过去三十年中，关于胱天蛋白酶（caspase）及其功能的大部分知识主要来源于对细胞凋亡的深入研究。目前已有充分证据表明，起始型caspase可通过蛋白水解作用加工效应型caspase，且在细胞凋亡过程中已鉴定出数百种效应型caspase的底物蛋白5,29。相比之下，人们对caspase在非凋亡过程中的功能及其所作用的非凋亡底物了解甚少。可以推测，起始型caspase在这些过程中可能发挥关键的调控作用。在细胞凋亡中，它们通过激活效应型caspase导致细胞死亡；而在触发非凋亡过程时，它们可能激活其他不同于效应型caspase的蛋白质，从而调控相应的非凋亡过程。本实验方案旨在检测候选蛋白是否为果蝇（Drosophila）中起始型caspase Dronc的底物17,30。
切割实验中待检测的底物可通过以下两种方式制备： 体外 哺乳动物无细胞表达系统（如RRL）或通过重组表达在 E. coli. 有若干优势 体外 使用RRL表达系统相较于细菌表达系统具有优势。RRL表达方案操作简便、速度快，可平行制备多种不同底物。在多数情况下，含有目标蛋白的RRL提取物可在-80 ˚C保存，待后续用于切割实验（但每种底物需单独验证其保存条件的适用性）。该潜在底物可用S标记35-Met，可在SDS-PAGE后通过放射自显影进行简便分析。若无底物特异性抗体时，此方法尤为有用。或者，若S35若不希望使用Met标记，可将假定的底物用常见的标签（如Flag、HA或Myc标签）进行标记，从而通过免疫印迹检测caspase切割。
必须强调，本实验方案的成功取决于对重组Dronc和Drice蛋白进行仔细且一致的纯化。遗憾的是，这些蛋白无法保存，即使短期存放也不行，无论是置于冰箱还是冷冻条件下。这些蛋白在任何储存形式下过夜后均会丧失酶活性。因此，必须在进行切割实验当天新鲜制备。无论被检测的候选蛋白为何，DriceC211A 应始终用作阳性对照，以验证 Dronc 的酶活性野生型 制备（参见 图2B, C）。或者，也可以通过以下方法检测 Dronc 和 Drice 提取物的活性： 体外 荧光合成四肽底物的裂解2,9,31.
如果使用抗体来检测候选底物，则用户需要对这些抗体进行验证32,33。该要求同样适用于商业来源的抗体，例如识别Flag、HA、Myc或其他表位标签的抗体。抗体质量不佳可能会掩盖重要的实验结果。建议对候选底物在N端和C端分别使用不同的标签进行双表位标记34。如果发生切割，双标记有助于追踪两个切割产物，并有助于阐明切割是在一个位点还是多个位点发生的。
尽管该方案可轻松验证 Dronc 已知的生物学底物 Drice，但也存在一些局限性。其中一个局限性在于，这是一种体外实验体系。 体外 使用重组蛋白的实验方案。在这些检测中，caspase 的浓度远高于生理水平，这一点可通过它们能够自发地进行自加工而得到证实 E. coli 自发性自剪切通常在生理条件下不会发生。这种高浓度的caspase可能导致非特异性活性，从而产生假阳性结果。通过降低caspase浓度可消除假阳性。 体外 切割反应。此外，如下文更详细所述，还需要进行额外的检测以确认真正的底物并排除假阳性结果。
重组的caspase可能不具有其在正常细胞环境中所具备的相同特异性 体内例如，caspase 的活性可受到翻译后修饰的调节，而这些修饰并不存在于重组蛋白中。此外， 体内，起始型caspase（包括Dronc）会整合到大型蛋白质复合物（如凋亡体）中。在本方案的条件下，无法实现凋亡体的形成，这需要重组表达 黑腹果蝇 Apaf-1（又称 Dark 或 Hac-1）35-37 其自身也存在一些挑战。因此， 体外，Dronc 可能不具有其原有的特异性 体内.
同样可以设想，Dronc 可能会整合到不同的蛋白质复合物中，以参与非凋亡过程。这可能会赋予 Dronc 不同的切割特异性，这也可能解释为何 Dronc 在非凋亡条件下不会诱导细胞凋亡。与此相关的是，CasCleave 利用已知的切割共识位点来预测新的半胱天冬酶（caspase）底物。然而，目前尚不清楚相同的切割共识位点是否也用于非凋亡过程。事实上，最近的研究表明，在鸡胚听觉脑干发育的非凋亡过程中，Caspase-3 会改变其偏好的共识位点38。同样地，如果起始型半胱天冬酶（initiator caspases）被整合到不同的蛋白质复合物中，它们可能具有不同的特异性，从而在不同的共识序列上进行切割。
这些局限性表明，仅依赖于单一方法是不够的 体外 本方案中所述的切割实验。应采用其他方法进一步验证使用本方案获得的结果。理想情况下， 体内 应使用以下检测方法来回答以下问题：候选蛋白在非凋亡过程中是否发生了蛋白水解加工？ 在体？如果是，是否使用相同的切割位点 体内 和 体外如果通过突变切割位点阻断切割，其后果是什么？候选底物的加工是否依赖于caspase，如果依赖，是哪一种caspase？切割产生的片段在非凋亡过程中发挥什么作用？这些问题可在遗传模式生物中轻松加以研究，例如 秀丽隐杆线虫 和 果蝇 使用标准的遗传学和转基因方法。
综上所述，本方案描述了一种可靠且一致的方法，用于制备具有酶活性的胱天蛋白酶（caspase），特别是Drosophila的Dronc和Drice。本方案的最终目标是检测Dronc是否能在体外（in vitro）切割通过遗传学、生物化学或生物信息学方法鉴定出的候选底物蛋白。如前文所述，还需开展其他实验以验证这些蛋白在体内（in vivo）是否为胱天蛋白酶的真实底物。鉴于胱天蛋白酶基因在后生动物中的高度保守性，本方案也有望适用于其他生物来源的胱天蛋白酶。

程序性细胞死亡或凋亡由一类高度特化的细胞死亡蛋白酶——caspase 执行（详见参考文献）1）。Caspase 是一类含有半胱氨酸残基的半胱氨酸蛋白酶，其活性位点包含一个半胱氨酸残基。它们具有特定的共识切割位点，并在天冬氨酸残基之后对底物进行蛋白水解切割（尽管 果蝇 caspase Dronc 也被报道可在谷氨酸残基后发生切割2）。它们被分为起始型（也称为顶端型或上游型）和效应型（执行型或下游型）半胱天冬酶。起始型半胱天冬酶可激活效应型半胱天冬酶。例如，在哺乳动物中，起始型半胱天冬酶Caspase-9可切割并激活效应型半胱天冬酶Caspase-33同样地，在 黑腹果蝇caspase-9 的同源物 Dronc 切割并激活 caspase-3 的同源物 Drice2,4在细胞凋亡过程中，效应型半胱天冬酶会切割数百种底物，导致细胞死亡。5.
Caspase 在细胞内以无活性的前体酶（酶原）形式合成。在这种形式中，它们包含一个 N 端前结构域、一个在前体酶中部含有催化性半胱氨酸的大亚基，以及一个位于 C 端的小亚基。1 (图1）。起始型caspase与效应型caspase的激活机制不同。起始型caspase（Caspase-9、Dronc）的激活需要二聚化，该过程通过整合到一种称为凋亡体（apoptosome）的大型蛋白复合物中而实现。6在凋亡体的组装过程中，Caspase-9 和 Dronc 在其N端前结构域中均含有一个半胱天冬酶募集与活化结构域（CARD）图1。凋亡体组分Apaf-1也含有一个CARD结构域，可招募Caspase-9或Dronc 通过 CARD/CARD 相互作用进入凋亡体3,6,7尽管Caspase-9和Dronc可在凋亡体中发生蛋白水解加工，但这种加工并非其酶活性完全必需8,9.
相比之下，效应型胱天蛋白酶（Caspase-3、Drice）在其前结构域中不含有CARD结构域，也不会被整合到大型蛋白质复合物中以实现激活1它们依赖于活化的Caspase-9或Dronc的蛋白水解切割1，分别形成由两个大亚基和两个小亚基组成的四聚体活性效应半胱天冬酶，因此包含两个催化位点（图1）。对于本实验方案尤为重要的是，半胱天冬酶（caspases）的重组表达 E. coli 导致包括Drice在内的caspase发生自加工和活化10 和 Dronc2,8,9,11,12，即使在缺乏 Apaf-1 的情况下亦可进行。这种自加工使得能够执行 体外 候选底物与重组caspase蛋白的切割实验
半胱天冬酶（caspases）不仅参与细胞凋亡，还具有多种非凋亡功能，包括增殖、分化、细胞迁移、神经元修剪、先天免疫等13,14,15。目前尚不清楚细胞为何在存在活化半胱天冬酶的情况下仍能存活于非凋亡过程中。一种可能是这些细胞仅以亚致死水平激活半胱天冬酶16，或在细胞的非凋亡区室（如质膜）中隔离活化的半胱天冬酶17,18。因此，鉴定和验证非凋亡底物不仅有助于揭示半胱天冬酶如何介导非凋亡过程，还可能帮助理解细胞如何在存在活化半胱天冬酶的情况下存活。
可通过遗传学和生物化学方法鉴定可能作为caspase底物的候选蛋白。可检测已鉴定出的蛋白是否含有Dronc切割位点的一致序列。这可以通过目视检查蛋白序列&#160;或使用更复杂的在线生物信息学工具（如CasCleave（https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/））19,20来实现。这些工具利用已知的caspase一致切割位点及结构特征，预测caspase新的靶标蛋白。尽管CasCleave整合了人Caspase-1、-3、-6、-7和-8已验证底物的信息，但由于这些caspase及其一致切割位点具有高度保守性，该工具也可能适用于本文所述的研究目的。然而，由于Dronc的切割位点尚未明确定义（两项研究分别鉴定出两个不同的最优切割位点：TATD/E2和LALD9），因此还需检查候选底物是否含有其他caspase的切割位点，包括Drice的切割位点。
为了验证caspase预测底物，需要进行额外的实验。其中一项实验是证明特定caspase能够实际切割候选蛋白 体外在此，我们提供了一种便捷的实验方案 体外 caspase 切割实验。使用本方案时，候选底物以 Dronc 作为 caspase 进行测试，也可进一步验证其是否为 Drice 的底物。尽管本方案是为 Dronc 设计的 果蝇 caspases Dronc 和 Drice，该方法也可适用于其他生物体中的caspases。
Dronc和Drice的提取与纯化 体外 由于这些caspase的催化活性会迅速丧失，因此必须在同一天内完成切割实验。本实验方案是在以往发表的方法基础上修改和优化而来的。8,9,11,12,21,22在此方案中，四种不同的半胱天冬酶蛋白在大肠杆菌中进行重组表达 E. coli 菌株 BL21 (DE3) pLysS。这些蛋白质为：6xHis-Dronc野生型，6xHis-DroncC318A，6xHis-Drice野生型和6xHis-DriceC211A每种蛋白质的N端均带有6个组氨酸残基（6xHis）标签，用于纯化。Dronc野生型 和 Drice野生型 为野生型蛋白，在重组表达时可自我加工产生活性半胱天冬酶。DroncC318A 和 DriceC211A 编码Dronc和Drice的突变形式，将催化位点的Cys残基突变为Ala残基。这些构建体无催化活性，且不能发生自加工（见 图2A）。它们在切割实验中用作对照。因为 DriceC211A 无法自动处理，也可作为 Dronc 的模式底物野生型 在 体外 此处所述的切割实验。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>抗-His 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体</td><td>Cell signaling</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>抗-Myc 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记抗体</td><td>Cell signaling</td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>生物分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td>#6131</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS 感受态细胞</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>离心机转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA-25.50</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>配备成像软件的 ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II</td><td>用于化学发光成像</td></tr><tr><td>化学发光底物</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>34095</td><td>用于化学发光成像</td></tr><tr><td>切割型果蝇 ICE（drICE）（Asp230）抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9478S</td><td></td></tr><tr><td>一次性比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955128</td><td>用于测量细菌生长和蛋白质浓度</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610610</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶，1000 mL</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS49801L</td><td>用于 LB 琼脂培养基的配制和高压灭菌</td></tr><tr><td>锥形瓶，250 mL</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS4980250</td><td>用于细菌培养生长和诱导</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>凝胶槽 SDS-PAGE 系统</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>STM1001</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶抑制剂混合物（100x）</td><td>Thermofisher scientific</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>His-Drice-pET28a&amp;nbsp;</td><td>本研究</td><td>N/A</td><td>可向作者索取</td></tr><tr><td>His-DriceC211A-pET28a&amp;nbsp;</td><td>本研究</td><td>N/A</td><td>可向作者索取</td></tr><tr><td>His-Dronc-pET28a&amp;nbsp;</td><td>本研究</td><td>N/A</td><td>可向作者索取</td></tr><tr><td>His-DroncC318A-pET28a&amp;nbsp;</td><td>本研究</td><td>N/A</td><td>可向作者索取</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;szlig;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂，Miller（粉末）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤，Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>微生物平板培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>用于转化后菌落生长</td></tr><tr><td>微量离心管，0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>中量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>小型旋转混合仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>用于混合细菌裂解液和 Ni-NTA 琼脂糖</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>电动移液控制器</td><td>Gilson</td><td>F110120</td><td>用于使用刻度移液管</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP330-1</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 至 12%，Bis-Tris，1.0 mm，中型蛋白凝胶，20 孔</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>WG1402BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 上样缓冲液（4x）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液（20x）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 转膜缓冲液（20x）</td><td>Invitrogen</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>带温度控制的轨道摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25 incubator shaker</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 100 mm × 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>涂布珠</td><td>Zymo research</td><td>S1001</td><td>用于在 AmpR/KanR 平板上涂布培养物</td></tr><tr><td>聚丙烯柱（1 mL）</td><td>Qiagen</td><td>34924</td><td>用于纯化 His 标签蛋白</td></tr><tr><td>Precision Plus 蛋白标准品</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0374</td><td></td></tr><tr><td>蛋白测定染料试剂浓缩液</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td></td></tr><tr><td>pT7CFE1-NMyc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>88863</td><td>用于克隆 RRL 表达底物</td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Invitrogen</td><td>LC2007</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 聚丙烯圆底管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352029</td><td>用于质粒培养物的培养</td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19095</td><td>用于在纯化过程中固定聚丙烯柱</td></tr><tr><td>制冷高速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td></td></tr><tr><td>rRNasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N251A</td><td>用于 RRL 表达</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>无菌 Falcon 管，15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>无菌 Falcon 管，50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70903-250G</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 刻度移液管，无菌</td><td>celltreat</td><td>229001B</td><td>用于在 50 mL 管中进行细菌细胞裂解</td></tr><tr><td>TnT 偶联网织红细胞裂解物 -T7</td><td>Promega</td><td>L4611</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>2340</td><td></td></tr><tr><td>湿法转印 Western 转印夹</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>STM2001</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 使用纯化重组蛋白的切割实验 果蝇 用于底物筛选的caspase酶

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

半胱天冬酶（caspases）是一类具有高度特异性的细胞死亡相关蛋白酶，参与凋亡性及非凋亡性生物学过程。尽管半胱天冬酶在细胞凋亡中的作用已被充分阐明，并已鉴定和表征了大量凋亡相关的蛋白水解底物，但其在非凋亡过程中的功能仍不明确。特别是，目前所鉴定出的非凋亡性半胱天冬酶底物仍十分有限。本文提供了一种实验方案，旨在促进潜在半胱天冬酶底物的鉴定与表征，该方案可用于在半胱天冬酶切割实验中检测候选底物 体外 描述了该方案，包括重组caspase蛋白的制备与纯化、候选底物的制备（通过重组表达或无细胞表达系统），以及实际的酶切反应实验。 体外 切割反应，随后进行SDS-PAGE和免疫印迹。本方案专为 果蝇 caspases Dronc 和 Drice，但也可轻松适用于其他生物（包括哺乳动物）的caspases。

本方案提供了半胱天冬酶蛋白诱导的分步操作说明 E. coli，重组蛋白的纯化 果蝇 caspases Dronc 和 Drice、候选底物的合成以及 体外 使用候选底物（此处为 Drice）进行切割反应C211A以及caspase Dronc。催化突变体DriceC211A 在此项检测中被用作模型底物，因为它不具有自加工活性（图2A）并在被 Dronc 切割之前始终保持全长形式野生型. DriceC211A 应始终用作阳性对照，以验证Droncwt 制备物具有酶活性。
图 2A 提供了重组caspase表达与纯化的代表性实例。共诱导并纯化了四种不同的重组caspase：6xHis-Droncwt6xHis-DroncC318A6xHis-Drice野生型和 6xHis-DriceC211A纯化的半胱天冬酶通过SDS-PAGE电泳分离后进行免疫印迹，印迹膜使用抗His抗体（1:5,000稀释）孵育，随后使用抗小鼠IgG-HRP偶联抗体（1:10,000稀释）进行二抗杂交。未加工的6xHis-Dronc（proDronc）的相对分子质量（MW）r55 kDa（第2泳道），未加工的6xHis-Drice（proDrice）具有分子量（MW）r 35 kDa（第4泳道）。通过出现较小分子量的条带可观察到caspase的自剪切加工r 由于在N端带有His标签，代表半胱天冬酶的大亚基（图1）。对于6x-Dronc而言，其大亚基的分子量为MWr 40 kDa（第1泳道）。6x-Drice 的大亚基在 23 kDa 处（第3泳道）。催化突变体 6xHis-DroncC318A 和 6xHis-DriceC211A 无法自动处理，仅能作为全长蛋白被检测到（第2道和第4道）。
图2B 为了证明经细菌表达并纯化的6xHis-Dronc野生型 制备物具有酶活性，因此按照本方案所述进行体外切割实验。以催化失活突变体6xHis-DroncC318A作为阴性对照。底物为RRL生成的N-Myc-DriceC211A，其N端带有一个Myc标签。在 体外 切割反应后，蛋白质经SDS-PAGE分离并进行免疫印迹，印迹膜先与抗Myc抗体（1:1,000稀释）孵育，再与抗小鼠IgG、HRP标记的抗体（1:10,000稀释）孵育，以检测N-Myc-DriceC211A通过出现至少一条分子量较小的条带，可证明caspase的成功切割及其酶活性r 与底物的全长未加工形式相比。未加工的全长 N-Myc-DriceC211A 具有分子量（MW）r 40 kDa（第2和第4泳道），而加工后的N-Myc-Drice大亚基C211A 在30 kDa处出现条带（第3道）。第1道表示未编程的RRL裂解液（未添加质粒/转录本）。第2道显示 体外 Drice 的生成C211A 通过RRL表达。第3泳道包含 体外 6xHis-Dronc 切割反应wt第4泳道包含 体外 6xHis-Dronc 切割反应C318A.
图 2C 一个 体外 使用重组纯化的半胱天冬酶（6xHis-Dronc）进行的切割反应野生型 和 6x-His-DroncC318A）和底物（6xHis-DriceC211A根据本方案，通过 SDS-PAGE 和免疫印迹分析。在切割反应分析中，免疫印迹使用抗切割 Drice 抗体（1:5,000 稀释；随后使用抗兔 IgG、HRP 标记抗体，1:10,000 稀释）。抗切割 Drice 抗体可识别 6xHis-Drice 大亚基（23 kDa）中的新表位C211A 仅在经过6xHis-Dronc处理后野生型 （泳道1）。催化失活突变体6xHis-DroncC318A 无法处理 6xHis-DriceC211A 在此实验中以及全长6xHis-DriceC211A 呈现为微弱的未处理条带，大小为35 kDa（第2泳道）。
<img alt="半胱天冬酶激活示意图；Caspase-9 对 Caspase-3/9 的加工；细胞凋亡机制研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：起始型半胱天冬酶 Caspase-9 和 Dronc 以及效应型半胱天冬酶 Caspase-3 和 Drice 的结构域组成。 CARD — 半胱天冬酶激活和募集结构域；Cys — 催化性半胱氨酸残基的相对位置；L — 大亚基；S — 小亚基。图中指出了N端前结构域的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SDS-PAGE 凝胶电泳结果；蛋白质切割实验；proDronc 与 proDrice 分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2代表性结果。 (A) 使用抗His抗体对纯化的重组6xHis-Dronc和6xHis-Drice蛋白进行免疫印迹分析。箭头指示未加工形式（proDronc和proDrice）以及切割后的6xHis-Dronc和6xHis-Drice。左侧显示分子量标记（MW markers）。B) 免疫印迹分析 体外 RRL 生成的 N-Myc-Drice 与 6xHis-Dronc 蛋白酶的切割反应野生型 （第3泳道）或6x-His-DroncC318A （第4泳道）使用抗Myc抗体进行探针杂交。未编程与编程（N-Myc-Drice）C211ARRL 反应产物加样并分别置于第 1 和第 2 泳道。箭头指示未加工的（proDrice）和切割后的 N-Myc-Drice。左侧显示分子量标记（MW markers）。C) 免疫印迹分析 体外 细菌表达并纯化的重组6xHis-Drice的切割反应C211A 含caspases 6xHis-Droncwt （第1泳道）或6x-His-DroncC318A （第2道），使用抗切割Drice抗体进行探针检测。全长（proDrice）和切割后的6xHis-DriceC211A 由箭头指示。左侧标明了分子量标记（MW markers）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充表 1：本表格包含用于在 pET28a 载体中进行克隆的引物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：本表包含缓冲液和培养基的组成成分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种表达和纯化重组蛋白的实验方案 果蝇 caspases Dronc 和 Drice，及其应用 体外 切割实验。

体外 使用纯化重组蛋白的切割实验 果蝇 用于底物筛选的Caspase酶

半胱天冬酶是一类具有高度特异性的细胞死亡蛋白酶，参与凋亡性及非凋亡性过程。尽管半胱天冬酶在凋亡过程中的作用……

半胱天冬酶（caspases）是一类半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡及非凋亡过程中可切割其底物。本实验方案描述了一种体外切割实验方法，用于鉴定果蝇起始型半胱天冬酶 Dronc 的潜在底物。若严格按照本方案操作，可建立一种可靠的高通量筛选流程，用于鉴定 Dronc 半胱天冬酶或其他任何半胱天冬酶的潜在底物。尽管本实验方案是为利用果蝇caspase Dronc进行体外切割实验而设计的，但也可轻松适用于其他生物体（包括哺乳动物）的caspase。重组caspase的纯化与体外切割实验必须在同一天完成，因为这些caspase制剂的酶活性会迅速丧失。本实验操作将由本实验室的博士后研究员Dr. Prathibha Yarikipati进行演示。首先，从零下80摄氏度的冰箱中取出含有菌体沉淀的冻存管，置于冰上10分钟以软化沉淀。10分钟后，使用移液器控制器配合1毫升刻度移液管，向含有沉淀的管中加入0.6毫升细菌细胞裂解缓冲液，该缓冲液需新鲜添加蛋白酶抑制剂、10毫克/毫升溶菌酶和50单位/毫升苯并核酸酶。使用同一移液管头反复吹打，直至沉淀完全溶解，形成无沉淀颗粒的澄清淡黄色溶液，然后将样品置于冰上孵育30分钟。将裂解液转移至适当的离心管中，在4摄氏度下以17,000 G离心40分钟。将上清液转移至1.5毫升微量离心管中，此即含有半胱天冬酶（caspases）的粗提物，将管子置于冰上保存。向每管半胱天冬酶提取物中加入0.2毫升50%的镍-氮川三乙酸琼脂糖悬液，并在4摄氏度下于旋转仪上翻转孵育一小时。一小时后，将含有镍-亚氨二乙酸琼脂糖的提取物加入装有完整柱尖的1毫升聚丙烯柱中，置于支架上，静置5分钟，使镍-亚氨二乙酸琼脂糖充分沉降。5分钟后，取下柱帽，让上清液依靠重力自然流出。随后，小心加入1毫升洗涤缓冲液至柱中，避免扰动已沉降的镍-亚氨二乙酸琼脂糖树脂，并通过重力流完成洗涤。为洗脱胱天蛋白酶，待洗涤缓冲液完全流尽后，将1.5毫升微量离心管置于柱子的收集喷嘴下方。然后向每根柱子中加入0.5毫升洗脱缓冲液，并用1.5毫升微量离心管收集洗脱液。将洗脱液置于冰上保存，并通过Bradford法测定蛋白质浓度。根据假定底物的表达水平，在切割实验中使用1至10微升含有目的蛋白的兔网织红细胞裂解液，并置于冰上。加入10微克先前纯化获得的caspase蛋白，并用caspase检测缓冲液将总体积调至50微升。将反应体系在30摄氏度水浴中孵育3小时，确保切割实验中包含适当的对照组。三小时后，将试管转移至冰上以终止反应，并加入含50毫摩尔DTT的一倍体积LDS上样缓冲液。将样品在75摄氏度的加热块中孵育10分钟。短暂离心后，轻轻弹击混匀，每样品上样24微升，进行SDS-PAGE电泳，或于-20摄氏度保存样品。诱导、纯化并分析了四种不同的重组caspase，分析方法包括SDS-PAGE、免疫印迹，印迹使用抗6x-His抗体进行探针杂交。未加工的6x-His标记Dronc相对分子量为55千道尔顿，未加工的6x-His标记DRICE分子量为35千道尔顿。通过出现较小分子量的条带，可观察到caspase的自加工过程。对于切割后的Dronc，其条带为40千道尔顿。对于切割后的Drice，其条带为23千道尔顿。体外切割反应后，蛋白质通过SDS-PAGE分离，进行免疫印迹，并将印迹膜与抗Myc抗体孵育，以检测氨基末端带有Myc标签的Drice C211A。结果表明，由细菌表达并纯化的6x-组氨酸标记的Dronc野生型蛋白具有酶活性。这一点可通过与未切割的proDrice相比，出现较小分子量的切割型Drice条带来证实。该体外切割反应使用了重组caspase和底物，通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。为了分析切割反应，本免疫印迹实验使用了抗切割型 Drice 抗体。结果表明，由细菌表达并纯化的 6x-His Dronc 具有酶活性。这一点可通过观察到切割后的 Drice 出现较未切割的前体 proDrice 更小的条带而得以证实。请注意，重组的半胱天冬酶（caspases）会很快失去酶活性。它们不能储存，即使在负80摄氏度下也不行。体外切割实验必须在同一天内完成。体外切割实验中的阳性结果应在体内进行验证。这可以通过细胞实验或遗传模式生物（如黑腹果蝇或秀丽隐杆线虫）来完成。

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学习使用纯化重组果蝇半胱天冬酶Dronc和Drice进行体外切割测定的方法，用于高通量筛选潜在底物。该方案适用于细胞凋亡和生化研究，可扩展至其他生物体。

体外使用纯化重组蛋白的切割实验果蝇用于底物筛选的Caspase酶

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