堆肥微宇宙作为微生物组研究中微生物多样性高且接近自然环境的实验体系 秀丽隐杆线虫

本方案描述了如何培养线虫和堆肥微生态系统，从而在类自然环境中在实验室中探索宿主与微生物组之间的相互作用。该方法为从野外分离野生线虫或使用微生物多样性有限的合成微生物群落提供了替代方案。本方案操作简便，可在任何实验室中进行，甚至适合初学者。

首先，从任意方便的来源获取堆肥或园艺用土，并将其存放在实验室内的标准厨房用塑料容器中，容器盖上需打孔以利于通气。用脱脂棉塞住小孔，防止果蝇和其他无脊椎动物进入。向堆肥或土壤中加入切碎的农产品或多种农产品的混合物，使土壤与添加物的质量比达到2:1。

每天翻动堆肥一次，并根据需要添加M9培养基，以保持湿润但不泥泞。对于每个微宇宙系统，取10克富集堆肥加入已用锡箔纸封口的30毫升玻璃烧杯中。向每个50毫升离心管中加入30克富集堆肥。

用M9培养基充满离心管并涡旋振荡。在室温下以560 ×g离心5分钟。使用刻度移液管小心吸除上清液，避免扰动沉淀，将上清液合并至一个新的50毫升离心管中。

通过在室温下以最大速度离心15分钟来浓缩细菌提取物。将沉淀物重悬于足量的M9培养基中，使每个微生态系统有200 µL，另准备200 µL用于作为微生态系统的可视替代物的平板。向经高压灭菌的堆肥烧杯和可视替代NGM平板中各加入200 µL浓缩的微生物提取物。

向每个微型生态系统和对照平板中加入 500 至 1000 条 L1 幼虫。用滤纸衬垫圆柱形 PVC 管。该圆柱体底部应粘附一层孔径为一毫米的尼龙网，呈漏斗状。

将圆筒放入置于烧瓶中的贝尔曼漏斗中。向线虫微生态系统中加入 20 毫升 M9 溶液。振荡混合物，然后将烧杯中的混合物倒入贝尔曼漏斗装置中铺有滤纸的圆筒内。

通过添加更多的M9液体完全浸没漏斗中的腐殖质。松开夹子，使含有收获的线虫的滤液流入50毫升离心管中。然后将离心管在室温下以560 ×g离心2分钟，以浓缩线虫。如需获得更多线虫，可重复上述步骤，并收集不同轮次的滤液。

用移液管吸除上清液，保留管内15毫升。将剩余液体转移至15毫升离心管中，再次离心1分钟，以进一步浓缩线虫。用移液管吸除14毫升上清液。

同时，在处理含有环境细菌群落的土壤样品时（处理方法如文中所述），取一克剩余的微宇宙土壤放入一个1.5毫升离心管中。使用玻璃移液管将一毫升浓缩的收获线虫转移至一个1.5毫升离心管中。孵育两分钟，使线虫沉降至管底。

弃去上清液，同时保留管底约100微升的沉淀不受扰动。用1.5毫升M9加Triton X缓冲液洗涤沉淀，每次均让线虫充分沉降至管底。使用玻璃移液管将洗涤后的线虫转移至新的1.5毫升离心管中，转移体积为100微升。

为使线虫麻痹，加入100微升25毫摩尔的盐酸左旋咪唑溶液，在室温下孵育5分钟。加入200微升4%次氯酸钠溶液，孵育2分钟。去除上清液，保留最底部150微升不扰动，用含Triton X的M9缓冲液洗涤线虫沉淀物三次。这些表面消毒的线虫可于-20摄氏度保存至使用，并可用于后续实验操作。

利用基于非加权或加权UniFrac距离的主坐标分析比较蠕虫肠道微生物组与环境群落，结果显示蠕虫肠道微生物组与其相应环境中的微生物组呈现出明显的聚类分离。虽然基于非加权UniFrac距离的主坐标分析未能区分土壤与蠕虫微生物组，但基于加权距离的聚类分析则清晰地将蠕虫肠道微生物组与堆肥微生物组区分开来。本研究中，饲养于堆肥微宇宙系统中的蠕虫被用于16S测序，同时也可用于检测不同环境微生物组对宿主抵抗不良环境条件能力的影响。

或者，可以从堆肥微宇宙中采集的蚯蚓体内分离出新的细菌类群，以拓展已知的蚯蚓肠道共生菌的分类学和功能多样性。该微宇宙技术建立后，有助于评估环境因素与宿主遗传因素在塑造肠道微生物组过程中的相对贡献。