分离的成人原代心肌细胞心脏收缩力的测量

我们的方案描述了一种用于测量成人原代心肌细胞收缩力的可靠系统。我们的系统是一种中等通量、非侵入性的光学记录方法，可连续测量多个细胞的收缩力，并实现药物效应的实时跟踪。我们的方法支持发现具有最需要的特征的新型分子，用于纠正心力衰竭。

它还提供了一种用于预测药物诱导的收缩力风险的临床前方法。首先，在八孔培养板的每个孔中放置一个玻璃盖玻片。通过将 800 微升人重组层粘连蛋白 521 原液加入 7.2 毫升溶液 B 中并充分混合，制备每毫升层粘连蛋白 5 微克。

将 200 微升稀释的层粘连蛋白溶液添加到盖玻片的中心。盖上盘子，堆放在四摄氏度的冰箱里。在溶液C中将二甲基亚砜或DMSO稀释1000倍，制成0.1%DMSO载体溶液。

为了测试化合物在其0.001微摩尔治疗暴露量的1倍、10倍、1000倍和1000倍下，将化合物以1毫摩尔浓度溶解在DMSO中。用DMSO连续稀释DMSO测试化合物溶液，以产生另外三个储备液。最后，将每种测试化合物原液稀释在 50 毫升溶液 C 中 1000 旧，以获得最终测试浓度。

将载体溶液和化合物的最终微摩尔浓度的溶液加入50毫升注射器中。将注射器连接到重力流系统，然后灌注重力流系统。从冰箱中取出一个装有层压涂层盖玻片的八孔板，并将一个盖玻片放入干净的记录室中。

将盘子放回冰箱，直到下一次铺盘。从升级的小瓶中吸出溶液 B，以达到最小体积而不会丢失细胞。然后将 200 微升细胞溶液分配到安装在倒置显微镜载物台上的记录显微镜室中，让细胞在盖玻片上沉淀五分钟。

接下来，打开显微镜上的视野，确定细胞密度是否足以开始实验运行。铺板完成后，使用重力流灌注系统连续用溶液C灌注细胞，使细胞平衡五分钟。正确调节吸力，打开温度控制箱和加热板，并将它们设置为提供 35 摄氏度。

然后在场刺激器上，将一对铂丝放置在腔室的相对两侧，以一赫兹起搏频率用超阈值电压刺激细胞。将刺激脉冲的振幅设置为一伏特并增加它，直到心肌细胞开始产生收缩-松弛循环。选择具有杆状形态和清晰条纹的健康细胞，然后调整视野并专注于将尽可能多的收缩细胞带入视野。

接下来，在光学收缩力记录系统的采集软件中显示细胞的数字化图像。在选择感兴趣区域或 ROI 时，请避免失焦区域和靠近单元格边缘的区域。启动实验以评估化合物的效果。

采集软件将管理数据采集。自动显示和标记测试浓度和处理时间。如果在整个基线车辆周期内收缩保持稳定幅度，则应用测试浓度。

取消显示上升或下降的单元格的资格。使用分析软件和自定义宏执行离线分析，以对数据进行平均。该软件根据采集软件生成的肌节动力学数据计算并报告各种指标。

量化测试化合物对相对于每个心肌细胞的特定基线载体控制条件的平均收缩力振幅的影响。将平均结果表示为平均值加/减SEM，并生成绘制测试化合物浓度对收缩力振幅的影响的图表。然后将浓度响应曲线拟合到希尔方程，得出 IC50 和 EC50 值。

接下来，将后收缩确定为心肌细胞的自发性继发性二次收缩，发生在下一次规律收缩之前，并产生异常和不同步的收缩。将收缩失败识别为电刺激无法诱发收缩。可视化收缩幅度变异性的庞加莱图中的短期变异性 （STV） 和交替性。

计算每个对照和测试物品浓度周期的最后 20 个瞬态的 STV。然后将交替体识别为重复的、交替的短和长收缩力振幅瞬变。为了计算促心律失常的发生率，将STV值归一化为每个细胞的载体控制值，绘制收缩后，收缩失败，STV和交替状态，并将它们表示为表现出每个信号的细胞发生率的百分比。

完成多参数机理分析，计算达到峰值的时间、衰减到 30% 然后 90% 的弛豫、达到 90% 的松弛时间、基线肌节长度、达到 50% 峰值的时间、峰高、峰值收缩力时的肌节长度、最大收缩速度和最大松弛速度。然后表达这些参数相对于每个心肌细胞的特定基线控制条件，并将它们绘制在浓度响应图中。这项研究显示了人类心肌细胞收缩力测量验证，以及 β-肾上腺素能刺激的效果。

人心肌细胞中没有自发的收缩力瞬变，心肌细胞对具有收缩-松弛循环的外部电刺激以及β-肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素的反应。异丙肾上腺素产生收缩力的浓度依赖性增加，并且还表征了其对瞬时收缩力动力学的影响。在测量收缩力后，我们可以使用荧光指示剂测量钙瞬变。

这些数据有助于确定收缩力的变化是否需要钙动力学的变化。我们的方法为心脏研究人员更好地了解人心肌细胞的生理学和药理学，建立新型药物的结构、活性和关系，并探索其作用机制铺平了道路。