可扩展的3D工程肌肉组织中的临床前药物测试
2023年4月7日
该协议提供了生成3D工程心脏和骨骼肌组织的方法，并描述了它们在临床前药物筛选模式中的使用。所描述的方法利用磁传感系统来促进同时评估24个组织。
我们的平台使用3D工程肌肉组织和磁传感硬件同时测量24孔的收缩力。这为使用人体肌肉组织在体外评估新疗法提供了一种更高通量的方法。我们的铸造方法提高了制造3D工程肌肉组织的一致性和可重复性。
我们设计了一种耗材 24 孔铸板，配备了磁传感硬件，用于在我们的平台上进行收缩性测量和分析。这种方法可以为任何影响收缩力的肌肉疾病的体外疾病建模、药物发现和基因治疗提供有价值的见解。我们目前正在将运动神经元整合到我们的3D结构中，以创建一个神经肌肉接头模型。
首先，将预冷的组织铸造套件放在细胞培养罩内的冷块或冰上。将铸板平放在冰上。将凝血酶添加到基础培养基中以制备凝血酶溶液，并将后晶格从铸造板移动到新的无菌 24 孔板中。
将50微升凝血酶溶液移液到铸造板的每个预冷孔中，并将晶格放回试剂盒上。将铸造套件放在冰上。接下来，加入 500 毫升 RPMI 培养基、10 毫升 B27 和 2.5 克氨基己酸或 ACA，以制备心脏 EMT 培养基。
取出将用于铸造组织的EMT培养基，并向其中添加10微摩尔ROCK抑制剂。通过添加 50 毫升 F10 培养基和 0.25 克氨基己酸或 ACA 来制备骨骼 EMT 培养基，用于原发性成肌细胞。对IPSC来源的成肌细胞使用0.1克ACA。
然后，无菌过滤含有ACA的铸造介质。将细胞培养级解离试剂和等体积的EMT培养基加热至37摄氏度。这种加热的EMT培养基将用于稀释解离试剂。
用PBS洗涤细胞并加入加热的解离试剂以提升细胞。在 37 摄氏度下孵育五分钟或直到细胞抬起，并通过敲击板的侧面每两到三分钟检查一次培养物。细胞抬起后，将它们转移到50毫升锥形管中。
用 P-1000 移液器研磨以确保单细胞悬液。用额外的EMT培养基洗涤板和烧瓶以收集剩余的细胞并将它们添加到锥形管中。再次，研磨细胞以确保单细胞悬液。
加入EMT培养基以终止解离过程，然后取细胞悬液样品以进行细胞计数。使用自动细胞计数器或台盼蓝血细胞计数器进行细胞计数。以200G离心细胞四分钟，吸出上清液，然后将细胞重新悬浮在5毫升EMT基培养基中以除去残留的解离试剂。
再次离心四分钟后，吸出上清液并以适当的密度制备细胞悬液。计算构成所需组织数量所需的每种细胞溶液的体积，并将计算出的细胞体积移液到15毫升锥形管中。每个EMT向细胞悬液中加入10微升纤维蛋白原并将其放在冰上。
确保每个EMT在最终组织构建体中含有90微升细胞悬液，10微升纤维蛋白原和50微升凝血酶溶液。在细胞培养罩中，取下组织铸造套件的盖子，并将铸件板放置，柱晶格平放在冰上。混合细胞纤维蛋白原混合物，并用P-200移液管吸取100微升。
将100微升混合物加入用50微升凝血酶溶液制备的孔中，并研磨五次以充分混合。请勿将移液器推过第一挡，并在研磨后取下吸头，以免产生任何气泡。在浇注每个组织之前，将细胞悬液混合在锥形管中。
用一只手的食指和拇指同时握住晶格和铸造孔板，以避免晶格的任何移动，或者将板平放在冰上并摇动冰桶以看到铸板。对每个组织重复一个新的P-200尖端，直到所有组织都石膏固定。小心地将接种套件转移到培养箱中，并在 37 摄氏度下孵育 80 分钟。
接下来，准备一个新鲜的 24 孔板，每孔 2 毫升用于心脏组织的 EMT 培养基，并将板在 37 摄氏度下孵育以加热培养基。孵育80分钟后，将一毫升EMT培养基轻轻加入铸孔边缘，并在37摄氏度下再孵育10分钟。孵育10分钟后，小心地提起柱晶格并将组织从铸造板转移到带有加热培养基的准备好的24孔板中。
最后，将装有组织的板返回到37摄氏度的细胞培养箱中。不成功的EMT生产范围从灾难性故障（例如组织从柱子上脱落）到更微妙的结构缺陷（如气泡和两个柱子周围的不等组织沉积）。此处显示了铸造后一天的EMT结构。
将骨骼肌组织转移到细胞融合和水凝胶压实的第零天开始的分化培养基中。从第7天到第28天，相同的EMT显示两个柱子之间的总长度略短，并且在通过EMT的中间部分测量时显示宽度较小。在21天内跟踪四块组织板，比较整个压实过程中的EMT直径。
时间点显示板之间的EMT大小一致。随着基质重塑的稳定，在第 21 天达到最大压实度。此处描述了EMT的免疫组织化学。
EMTs在培养的第10天固定并嵌入石蜡中。在成像前，用针对肌球蛋白重链和肌营养不良蛋白的抗体染色薄横截面。这些图形图像表示心脏 EMT 和骨骼 EMT 随时间测量的平均绝对抽搐力。
此处显示了工程心脏组织中的急性和慢性阿霉素治疗。在27天内，三种不同剂量浓度的Dox以推注方式或连续施用到工程心脏组织。工程骨骼肌组织中对BDM的剂量反应如图所示。
当EMT暴露于该化合物时，心跳率或抽搐频率以剂量依赖性方式停止，同时收缩力停止表明心脏毒性。铸造组织时要记住的最重要的事情是始终保持所有东西的低温，包括细胞悬液和试剂，并在铸造开始后保持晶格完全静止。
概述
本协议概述了利用磁感应系统用于药物筛选的3D工程心脏和骨骼肌组织的生成。该方法允许同时评估24个组织，提高了临床前研究的通量。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏和骨骼肌工程
- 临床前药物筛选
- 组织建模
背景
- 3D工程肌肉组织为研究肌肉疾病提供了相关的体外模型。
- 磁感应技术能够进行高通量的收缩性测量。
- 组织制造的改进一致性对于可靠的实验结果至关重要。
- 包含运动神经元旨在创建神经肌肉接头模型。
研究目的
- 开发一种生成一致的3D肌肉组织的方法。
- 利用人体肌肉组织促进药物发现和疾病建模。
- 提高体外收缩性评估的通量。
使用的方法
- 制备组织形成的铸模板和凝血酶溶液。
- 细胞离解和计数以确保适当的细胞密度。
- 使用纤维蛋白原和凝血酶溶液铸造肌肉组织。
- 组织的孵育和转移到分化培养基。
主要结果
- 成功生成具有一致收缩性的3D工程肌肉组织。
- 在第21天观察到组织的最大压缩。
- 免疫组织化学分析确认了肌肉特异性蛋白的存在。
- 实现了对多个组织的高通量收缩性评估。
结论
- 所开发的协议允许高效生成和评估肌肉组织。
- 该方法可以显著帮助药物发现和肌肉疾病建模。
- 未来的工作将专注于将运动神经元整合到构造中。
常见问题
Executive Industry Relevance
Scalable 3D engineered muscle tissue platforms address a critical gap in preclinical drug testing by enabling reproducible, quantitative assessment of contractile function in both healthy and disease models. This technology enhances predictive confidence for cardiotoxicity and myotoxicity, supporting earlier de-risking and more informed portfolio decisions. Integration of high-throughput, label-free contractility assays positions these models as pivotal tools for translational continuity from discovery through preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in disease-relevant muscle systems.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying contractile responses to candidate compounds.
- Facilitates functional target validation through direct measurement of muscle force and kinetics.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible 3D muscle constructs for compound screening workflows.
- Delivers quantitative, high-throughput contractility readouts across 24 tissues simultaneously.
- Reduces assay variability and supports scalable screening for cardiotoxic and myotoxic liabilities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro contractility metrics with translational biomarkers for cardiac and skeletal muscle safety.
- Enables longitudinal analysis of acute and chronic drug effects in engineered tissues.
- Supports risk-adjusted advancement by modeling clinically relevant toxicities, such as those seen with BMS-986094.
Pipeline & Workflow Integration
This platform bridges early discovery, lead identification, and preclinical safety assessment by providing a unified, scalable system for functional muscle evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in engineered muscle models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative contractility data for compound triage.
- Analytics: Enables dose-response and longitudinal measurement of force and kinetics.
- Translational Research: Facilitates alignment with clinical safety endpoints for muscle function.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, automation-friendly platform adaptable to diverse cell sources and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence for muscle-related drug safety and efficacy.
- Operational Value: Standardizes tissue fabrication and measurement, reducing failure rates and manual intervention.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative safety data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and reduces late-stage attrition due to unforeseen muscle toxicities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D tissue culture and contractility assay operation.
- Needs access to magnetic sensing hardware and compatible 24-well casting plates.
- Demands cross-team standardization for data analysis and tissue fabrication protocols.
- Adaptable to various cell sources, including iPSC-derived and primary myoblasts.
- Limitations include potential for tissue detachment, air bubbles, and structural inconsistencies if protocols are not rigorously followed.
