可扩展的3D工程肌肉组织中的临床前药物测试

我们的平台使用3D工程肌肉组织和磁传感硬件同时测量24孔的收缩力。这为使用人体肌肉组织在体外评估新疗法提供了一种更高通量的方法。我们的铸造方法提高了制造3D工程肌肉组织的一致性和可重复性。

我们设计了一种耗材 24 孔铸板，配备了磁传感硬件，用于在我们的平台上进行收缩性测量和分析。这种方法可以为任何影响收缩力的肌肉疾病的体外疾病建模、药物发现和基因治疗提供有价值的见解。我们目前正在将运动神经元整合到我们的3D结构中，以创建一个神经肌肉接头模型。

首先，将预冷的组织铸造套件放在细胞培养罩内的冷块或冰上。将铸板平放在冰上。将凝血酶添加到基础培养基中以制备凝血酶溶液，并将后晶格从铸造板移动到新的无菌 24 孔板中。

将50微升凝血酶溶液移液到铸造板的每个预冷孔中，并将晶格放回试剂盒上。将铸造套件放在冰上。接下来，加入 500 毫升 RPMI 培养基、10 毫升 B27 和 2.5 克氨基己酸或 ACA，以制备心脏 EMT 培养基。

取出将用于铸造组织的EMT培养基，并向其中添加10微摩尔ROCK抑制剂。通过添加 50 毫升 F10 培养基和 0.25 克氨基己酸或 ACA 来制备骨骼 EMT 培养基，用于原发性成肌细胞。对IPSC来源的成肌细胞使用0.1克ACA。

然后，无菌过滤含有ACA的铸造介质。将细胞培养级解离试剂和等体积的EMT培养基加热至37摄氏度。这种加热的EMT培养基将用于稀释解离试剂。

用PBS洗涤细胞并加入加热的解离试剂以提升细胞。在 37 摄氏度下孵育五分钟或直到细胞抬起，并通过敲击板的侧面每两到三分钟检查一次培养物。细胞抬起后，将它们转移到50毫升锥形管中。

用 P-1000 移液器研磨以确保单细胞悬液。用额外的EMT培养基洗涤板和烧瓶以收集剩余的细胞并将它们添加到锥形管中。再次，研磨细胞以确保单细胞悬液。

加入EMT培养基以终止解离过程，然后取细胞悬液样品以进行细胞计数。使用自动细胞计数器或台盼蓝血细胞计数器进行细胞计数。以200G离心细胞四分钟，吸出上清液，然后将细胞重新悬浮在5毫升EMT基培养基中以除去残留的解离试剂。

再次离心四分钟后，吸出上清液并以适当的密度制备细胞悬液。计算构成所需组织数量所需的每种细胞溶液的体积，并将计算出的细胞体积移液到15毫升锥形管中。每个EMT向细胞悬液中加入10微升纤维蛋白原并将其放在冰上。

确保每个EMT在最终组织构建体中含有90微升细胞悬液，10微升纤维蛋白原和50微升凝血酶溶液。在细胞培养罩中，取下组织铸造套件的盖子，并将铸件板放置，柱晶格平放在冰上。混合细胞纤维蛋白原混合物，并用P-200移液管吸取100微升。

将100微升混合物加入用50微升凝血酶溶液制备的孔中，并研磨五次以充分混合。请勿将移液器推过第一挡，并在研磨后取下吸头，以免产生任何气泡。在浇注每个组织之前，将细胞悬液混合在锥形管中。

用一只手的食指和拇指同时握住晶格和铸造孔板，以避免晶格的任何移动，或者将板平放在冰上并摇动冰桶以看到铸板。对每个组织重复一个新的P-200尖端，直到所有组织都石膏固定。小心地将接种套件转移到培养箱中，并在 37 摄氏度下孵育 80 分钟。

接下来，准备一个新鲜的 24 孔板，每孔 2 毫升用于心脏组织的 EMT 培养基，并将板在 37 摄氏度下孵育以加热培养基。孵育80分钟后，将一毫升EMT培养基轻轻加入铸孔边缘，并在37摄氏度下再孵育10分钟。孵育10分钟后，小心地提起柱晶格并将组织从铸造板转移到带有加热培养基的准备好的24孔板中。

最后，将装有组织的板返回到37摄氏度的细胞培养箱中。不成功的EMT生产范围从灾难性故障（例如组织从柱子上脱落）到更微妙的结构缺陷（如气泡和两个柱子周围的不等组织沉积）。此处显示了铸造后一天的EMT结构。

将骨骼肌组织转移到细胞融合和水凝胶压实的第零天开始的分化培养基中。从第7天到第28天，相同的EMT显示两个柱子之间的总长度略短，并且在通过EMT的中间部分测量时显示宽度较小。在21天内跟踪四块组织板，比较整个压实过程中的EMT直径。

时间点显示板之间的EMT大小一致。随着基质重塑的稳定，在第 21 天达到最大压实度。此处描述了EMT的免疫组织化学。

EMTs在培养的第10天固定并嵌入石蜡中。在成像前，用针对肌球蛋白重链和肌营养不良蛋白的抗体染色薄横截面。这些图形图像表示心脏 EMT 和骨骼 EMT 随时间测量的平均绝对抽搐力。

此处显示了工程心脏组织中的急性和慢性阿霉素治疗。在27天内，三种不同剂量浓度的Dox以推注方式或连续施用到工程心脏组织。工程骨骼肌组织中对BDM的剂量反应如图所示。

当EMT暴露于该化合物时，心跳率或抽搐频率以剂量依赖性方式停止，同时收缩力停止表明心脏毒性。铸造组织时要记住的最重要的事情是始终保持所有东西的低温，包括细胞悬液和试剂，并在铸造开始后保持晶格完全静止。