体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

我们开发的表观遗传沉默技术属于更广泛的一类基因沉默技术。在我们开始开发表观遗传沉默技术之前，该领域主要有两种替代方案：一种是通过RNA干扰实现的基因敲低，另一种是通过人工核酸酶实现的基因破坏。

人工核酸酶介导的基因破坏作用于DNA水平。当你有一个需要失活的目标基因时，可将某些人工核酸酶递送至细胞内，从而诱导DNA双链断裂。这类双链断裂可引发移码突变，最终导致非功能性蛋白的产生，或同时引发转录本的降解。

另一方面，表观遗传沉默是通过向细胞内递送所谓的工程化转录抑制子（ETRs）来实现的。这些小型蛋白质能够结合目标DNA，并在目标基因上建立所谓的表观遗传标记。这些化学修饰一旦沉积在DNA上，便可导致染色质压缩。

染色质压缩会显著引起转录抑制，从而使目标基因不再表达。尤为重要的是，这种转录抑制状态可在细胞中长期遗传。为确定表达待沉默目标基因的细胞系，可在《人类蛋白质图谱》（The Human Protein Atlas）中检索目标基因，并浏览“细胞系”部分，以鉴定代表感兴趣体组织的细胞系。

从鉴定出的细胞系中，优先选择已有高效瞬时基因递送方案的细胞系。接下来，打开基因浏览器，确定目标基因中用于整合荧光报告基因表达盒的区域。然后使用CHOPCHOP工具识别并选择将在目标区域切割的gRNA。在本例中，目标区域为B2M基因的第一个内含子。

接着，设计针对gRNA切割位点的供体模板，该模板包含左同源臂、无启动子的转基因表达盒以及右同源臂。根据制造商说明书，通过核转染将CRISPR Cas9核酸酶系统和供体模板递送至K-562细胞系中。将K-562细胞培养至少14天。

利用流式细胞仪随时间监测荧光报告基因的表达水平。激活藻红蛋白通道以检测tdTomato报告基因的荧光强度。在UCSC基因组浏览器中检索目标基因，并提取可能调控其转录活性的区域的核苷酸序列，例如CpG岛以及H3K27乙酰化富集位点。

将选定的序列粘贴至CHOPCHOP在线工具中，并选择“抑制”作为待检索gRNA的目的。CHOPCHOP将提供一份映射到目标基因序列上的gRNA列表，并根据脱靶匹配数量和预测的靶向效率评分进行排序。每个目标序列至少选择10条gRNA。

尽量选择覆盖整个目标区域的gRNA，且在整个基因组中无完全匹配的其他基因间序列。在将编码ETRs的质粒转化至化学感受态E.coli细胞后，通过限制性酶切和Sanger测序筛选含有ETRs编码质粒的菌落。为将gRNA克隆至phU6 gRNA骨架中，首先使用分子生物学设计软件设计寡核苷酸。

在原间隔序列上游添加五核苷酸序列，并将此长度为25个核苷酸的寡核苷酸标记。类似地，在原间隔序列的反向互补序列上添加五核苷酸序列，并在其下游添加一个胞嘧啶，以生成另一条长度为25个核苷酸的寡核苷酸并进行标记。将这些寡核苷酸合成为无盐单链DNA，溶于水中，浓度为100微摩尔。

将每种寡核苷酸各取1微升加入2微升退火缓冲液和16微升水中。通过将溶液置于热循环仪中95摄氏度加热10分钟进行寡核苷酸退火，随后在45分钟内逐渐冷却至25摄氏度。

取1微升退火后的寡核苷酸，用99微升无核酸酶水稀释。然后，取1微升该稀释液与50纳克先前经BsaI限制性内切酶消化的phU6 gRNA质粒进行连接反应。将2微升连接产物转化至20微升化学感受态E.coli细胞中。

挑取多个菌落进行质粒DNA制备，并通过Sanger测序确认原间隔序列的克隆成功。为在报告细胞系中以阵列形式递送gRNA和基于CRISPR/dCas9的ETRs，首先准备多个独立离心管，每管加入500纳克各质粒，并加入125纳克不同gRNA编码质粒进行测试。设置不含gRNA和ETRs的核转染条件作为模拟处理对照样本。

每个样本至少设置三个技术重复。每管收集5 × 10⁵个B2M tdTomato K-562细胞，进行核转染并加入质粒混合物。将细胞重悬于200微升预热的RPMI 1640哺乳动物细胞培养基中，放入培养箱培养。

利用流式细胞术在ETRs递送后的不同时间点检测沉默细胞的百分比。使用不含tdTomato编码序列的野生型细胞设定报告基因阴性细胞的阈值。

使用模拟处理样本设定报告基因阳性细胞的门控范围。根据长期沉默效率筛选出表现最佳的三条gRNA。利用FACS分选出在这些样本中稳定维持的报告基因阴性亚群。

同时，在相同条件下对模拟处理样本进行FACS分选，以便在后续分析中进行恰当比较。通过CRISPR/Cas9介导的同源定向修复，将tdTomato荧光报告基因整合至人类B2M基因的第一个内含子中。整合后，处理样本中出现报告基因阳性的K-562细胞。

在瞬时递送三联ETRs组合及gRNA后，进行纵向流式细胞术分析，以评估荧光报告基因的表达情况。急性期分析中观察到报告基因抑制的峰值，但随着时间推移，由于ETRs编码质粒在有丝分裂中被稀释，抑制效果部分恢复。ETRs与gRNA组合在目标位点有效沉积CpG甲基化，表现为处理细胞中有相当比例的细胞实现了报告基因的持久抑制。不同gRNA表现出不同的长期沉默效率。

实现持久且高效表观遗传沉默的关键步骤之一是鉴定高效的gRNA。为此，无论何种应用，均需首先识别最敏感的序列，包括启动子、增强子及其他转录调控位点。

一旦确定了最敏感且有效的区域，应设计不同的gRNA并单独或组合测试其效果。表观基因组编辑最明显的一个应用是治疗由功能获得性突变引起的疾病。此外，我们仍需牢记，特异性改变特定启动子表观遗传调控的能力，对于转化医学和基础科学研究而言，都可能成为一种极为有用的工具。