体外研究 用于靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子的选择

我们开发的表观遗传沉默技术属于一个更大的技术领域，即基因沉默技术。在我们开始开发表观遗传沉默需求之前，该领域有两种选择。一种是RNA干扰导致的基因敲低，另一种是人工核酸酶对基因的破坏。

人工核酸酶对基因的破坏在DNA水平上起作用。所以你有你想要灭活的靶基因，你向细胞输送一些人造核酸酶，诱导双链断裂。这种双弦断裂可能会执行退行性总和，即移码突变，最终导致非功能性蛋白质的变性，或同时发生转录降解。

因此，表观遗传沉默通过递送细胞起作用，即所谓的工程转录抑制因子。这些是一些小蛋白质，能够与你的靶DNA结合，然后只施加在你的目标基因上，即所谓的表观遗传马克思。这些是一些化学修饰，一旦沉积在DNA上，就会导致染色质压缩。

染色质压缩会导致转录抑制，因此您不再有靶基因的表达。非常重要的是，这种转录抑制状态可以被细胞长期结合。要识别表达待沉默靶基因的细胞系，请浏览人类蛋白质图谱中的靶基因，并浏览细胞系部分以识别代表目标体细胞组织的细胞系。

从已鉴定的细胞系中，优先考虑具有高效瞬时基因递送方案的细胞系。接下来，打开基因查看器并确定靶基因的区域以整合荧光团表达盒。然后使用 CHOPCHOP 识别和选择 GNRA，它将切割 Beta-2M 基因第一个内含子的靶区。

接下来，为 GNRA 切割位点设计供体模板，该模板由左同源臂、无启动子转基因表达盒和右同源臂组成。根据制造商的说明，通过核转诊将 CRISPR Cas9 核酸酶系统和供体模板递送至 K-562 细胞系内。将 K-562 细胞培养至少 14 天。

使用流式细胞仪监测荧光报告基因随时间变化的表达水平。激活FICO醚蛋白通道以测量tdTomato报告基因的荧光强度。在UCSC基因组浏览器中浏览靶基因，并提取可能调节其转录活性的区域的核苷酸序列，例如CpG岛和富集H3K27乙酰化的位点。

将选定的序列粘贴到 CHOPCHOP 在线工具中，然后选择抑制作为要检索的 GNRA 的目的。CHOPCHOP 将提供映射在目标基因序列上的 GNRA 列表，并根据分数列出，同时考虑脱靶匹配的数量和预测的靶向效率。每个靶标序列至少选择 10 个 GNRA。

尝试选择跨越整个区域的GNRA进行整合，与整个基因组中的其他基因间序列没有完全匹配。在化学感受态大肠杆菌细胞中转化编码ETRS的质粒后，通过限制性内切酶消化和Sanger测序筛选菌落中是否存在携带ETR的质粒。要克隆 phU6 GNRA 骨架内的 GNRA，首先使用分子生物学设计软件生成寡核苷酸。

在原始间隔区上游附加一个五核苷酸序列，并标记这个 25 个核苷酸长寡核苷酸。类似地，将原间隔区反向补体的五个核苷酸序列及其下游的胞嘧啶附加，以产生 25 个核苷酸长寡核苷酸并标记它。让这些寡核苷酸合成为无盐单链 DNA 寡核苷酸，重悬于 100 微摩尔的水中。

将每种寡核苷酸加入 2 微升退火缓冲液和 16 微升水中。通过将溶液置于 95 摄氏度的热循环仪中 10 分钟来进行寡核苷酸退火。然后在 45 分钟内逐渐冷却至 25 摄氏度。

用 99 微升无核酸酶水稀释 1 微升退火寡核苷酸。然后用 50 ng phU6 GNRA 质粒连接该稀释液的 1 微升，该质粒先前用 Bsa1 限制性内切酶消化。用 2 微升连接产物转化 20 μL 化学感受态大肠杆菌细胞。

选择多个菌落用于质粒 DNA 生产，并通过 Sanger 测序确认成功克隆原始间隔区。为了在阵列报告细胞系中递送基于 GNRA 和 CRISPR dCas9 的 DTR，首先，制备含有 500 纳克每种质粒的单独试管，并添加 125 纳克不同的 GNRA 编码质粒进行测试。包括无 GNRA 和 ETR 的核转染条件作为模拟处理样品。

每个样品至少准备三个技术重复。每管将 10 次沉淀到第五个 Beta-2M tdTomato K-562 细胞的 5 次，并用质粒混合物对它们进行核感染。将细胞重悬于200微升先前加热的RPMI 1640哺乳动物细胞培养基中，并将其置于培养箱中。

使用流式细胞术测量 ETR 递送后不同时间点沉默细胞的百分比。使用不含 Flora 4 包被序列的野生型细胞。设置报告阴性细胞的阈值。

使用模拟处理的样品为报告阳性细胞设置门。确定长期沉默效率排名前三的GNRA。使用事实来选择在这些样本中稳定维持的报告者负亚群。

此外，在同一处理下对模拟处理过的样品进行事实处理，以便在随后的分析中进行适当的比较。通过CRISPR Cas9诱导的断层学定向修复，将tdTomato荧光报告基因整合到人类Beta-2M基因的第一个内含子中。整合后，报告阳性的 K-562 细胞出现在处理过的样品中。

在瞬时递送三重 ETR 组合和 GNRA 后，进行纵向流式细胞术分析以评估荧光报告基因的表达。在急性分析中观察到报告基因抑制的峰值，由于ETR编码质粒的有丝分裂稀释，随着时间的推移，报告基因抑制被部分重吸收。ETR 的 GNRA 组合在靶位点上有效沉积 CpG 甲基化，通过在相当一部分处理细胞中永久抑制报告基因座而明显。

不同的GNRAs表现出不同的长期沉默效率。实现永久和有效的表观基因组沉默的最关键步骤之一是鉴定有效的单个gRNA。要做到这一点，任何类型的应用都需要从鉴定反应最灵敏的序列开始，包括转录调节因子的任何其他位点的启动子和答案。

一旦确定了哪个区域可能是反应最灵敏和最有效的区域，任何人都应该设计不同类型的单个 gRNA 测试作为单个或单个 gRNA 的组合。表观基因组编辑最明显的应用之一是在任何功能突变的获得中肯定的临床前翻译，其中该基因的沉默可能有助于治愈特定疾病。或者，无论如何，我们都应该记住，特异性改变给定启动子的表观遗传调控的能力可能是临床和基础转化科学的超级有用的工具。