用于类器官培养和 3D 成像的高通量平台

该协议展示了一种微质构细胞培养皿，专为数百种具有材料知识并与显微镜完全兼容的类器官的生长而设计。我们的技术可以有效地生成数千个类器官，与长期成像和长期细胞培养完全兼容。该协议对生物医学应用（如药物筛选管道和癌症研究领域）具有浓厚的兴趣。

该协议中介绍的技术在具有实验室程序和光学显微镜经验的任何人尝试几次后都很容易掌握。首先，将PDMS模具的一小部分切割成最终设备所需的尺寸。平行于阵列的 XY 方向切割它们。

将准备好的PDMS模具骰子之一面朝下放在平面PDMS部分上。然后使用移液器在模具的一侧加入约0.1至0.2毫升紫外线固化粘合剂。使用倒置光学显微镜在10X放大倍率下跟踪腔内液体的进展。

将粘合剂暴露在紫外线下以固化。根据文本手稿中所述的紫外线源的功率密度调整曝光时间。在一边缘使用过量的粘合剂，用手指轻轻按压将固化的粘合剂固定在平坦的PDMS基材上。

同时，使用镊子将模具的一角捏住被压住的同一边缘，然后慢慢剥落模具，同时确保纹理薄膜不被抬起。使用剃须刀片修剪多余的粘合剂和 PDMS 基材，使固化、纹理和粘合剂层平放在 PDMS 上，多余的基材仅在一个边缘上。用短氧等离子体工艺处理干净的盖玻片，以提高其亲水性。

等离子活化后，通过将盖玻片放在标准旋涂机的真空卡盘上并在盖玻片的中心倒入一小滴粘合剂，对薄层的UV固化粘合剂进行旋转涂覆。按照文本手稿中的说明运行旋涂工艺。如果没有旋涂，请使用移液管将大约 0.1 毫升紫外线固化粘合剂滴在干净的盖玻片上。

取第二张盖玻片并将其放在第一张盖玻片的顶部，使液体粘合剂均匀地散布在两个盖玻片之间。一旦粘合剂到达盖玻片的边缘，通过将一个滑过另一个来轻轻地将它们分开。分离后，两个盖玻片将完全涂上一层薄薄的液体粘合剂。

旋涂后，通过暴露于紫外线对粘合剂进行预固化。根据所用紫外线源的功率密度调整曝光时间。取其中一层带纹理的薄膜，并将其与涂有粘合剂的盖玻片接触。确保部分固化的粘合剂和纹理薄膜之间的接触尽可能均匀。

在这个阶段，盖玻片上的粘合剂应足够牢固，以避免再流，并且可以通过轻轻按压盖玻片来优化接触。将盖玻片暴露在紫外线下，直到涂层粘合剂层完全固化。这将密封盖玻片上的纹理薄膜，并在周边空腔之间提供防漏隔离。

然后使用镊子将PDMS捏在修剪后留下多余材料的边缘，并剥离PDMS平坦的基板。此步骤使带纹理的薄膜层能够粘附在盖玻片上，并在顶部开放通道以进行细胞接种。在细胞接种之前，在手稿中所述的用生物识别共聚物钝化的设备上，将一毫升无菌PBS分配到35毫米细胞培养培养皿中。

使用真空室用无菌PBS对培养皿进行脱气10分钟，然后进行几轮移液以去除所有气泡。用无菌培养基替换PBS，并在细胞培养罩下用紫外线对板进行30分钟的灭菌。按照文本手稿中所述的针对目标细胞的胰蛋白酶消化或细胞悬液制备建议制备细胞悬液。

在推荐的细胞培养基中计数并将细胞浓度调整至每毫升500， 000个细胞。从35毫米细胞培养皿中取出PBS缓冲液，然后分配一毫升调整后的细胞悬液。将细胞培养皿放回细胞培养箱中10分钟。

大约 80 到 100 个细胞将进入每个周边腔。孵育约10分钟后，从培养箱中回收细胞培养皿并轻轻吸出细胞悬液以去除未捕获的细胞。向培养皿中加入一毫升培养基，然后将其放回细胞培养箱中。

或者，要在类器官在孔中生长后取回类器官，请使用镊子将纹理粘合剂层捏在切割边缘，然后将其从玻璃盖玻片上轻轻剥离，但将其浸入培养基中。增加生物识别共聚物的浓度增加了涂层厚度。细胞培养皿的完全脱气对于去除困在周边腔中的气泡至关重要。

类器官在培养的第2天和第15天后形成。旋转盘共聚焦显微镜显示了类器官的代表性图像和3D重建。在准备培养皿时，重要的是要注意模具或基材堆叠的组装，并确保纹理薄膜和盖玻片之间的良好接触。

我们的微腔提供的遏制和没有材料损失引起了有兴趣研究微重力对类器官稳态影响的空间生物学研究人员的注意。