Name: 用于类器官培养和 3D 成像的高通量平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习微纹理细胞培养皿技术，用于高通量类器官培养与长期显微成像。该方法支持药物筛选和癌症研究中的生物医学应用，为研究人员提供标准化的类器官培养方案。

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本研究由新加坡国家研究基金会（NRF）、总理办公室下属“卓越研究与科技企业园区”（CREATE）计划资助的CALIPSO项目支持。V.V. 感谢NRF研究员项目（NRF-NRFI2018-07）、教育部三级项目（MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005）、MBI种子基金以及ANR ADGastrulo的资助。A.B. 和 G.G. 感谢MBI核心资金的支持。A.B. 感谢Andor Technologies公司出借BC43显微镜。

注意：本方案的第一部分详细介绍了细胞培养装置的微加工制造过程。带有锥体形空腔的原始主模具可由实验室自行制备（若具备微加工设备）或外包给外部公司。本研究所使用的主模具为实验室自制，其制备工艺步骤在其他文献中已有描述11,13。模具微加工的基本方案详见补充文件1。关键提示：步骤1至6的操作必须在无尘环境中进行，优先使用层流罩或洁净室（如有）。在整个操作过程中，必须佩戴个人防护装备（PPE），例如手套、实验服和护目镜。
1. PDMS模具的切割
<ol>
	<li>根据最终器件所需尺寸，从PDMS模具上切下小块（例如 1 cm x 1 cm [图1B]）。切割方向应与阵列的XY方向平行。 
	&#8203;关键步骤：在将PDMS模具切割为1 cm x 1 cm的小方块时，应一次性完成切割；使用单面剃刀片，施加压力并一步完成切割。此举旨在防止产生微小的PDMS颗粒，这些颗粒可能沉积在模具表面，影响后续复制步骤（步骤3）的质量。</li>
</ol>
2. 平面PDMS基底的制备
<ol>
	<li>称取约 15–20 g PDMS 基体树脂和 1.5–2 g 交联剂（即质量比为 10:1），充分混合后，在真空干燥器中脱气约 20 分钟。</li>
	<li>将脱气后的 PDMS 缓慢倒入一个直径为 15 cm 的塑料培养皿中。</li>
	<li>将培养皿置于 65 °C 的烘箱中固化 2 小时。待固化完成后，即可得到一块厚度约为 1.5 mm 的平整 PDMS 薄膜（保留在培养皿中），可供后续使用（图 2A）。</li>
	<li>使用锋利刀片从 PDMS 薄膜上切割出 2 cm × 2 cm 的正方形样品（图 2B-D）。 
	&#8203;注意：该 PDMS 薄片的确切厚度并非关键，厚度在约 1–2 mm 范围内均可接受。切割尺寸应略大于纹理化模具，但不宜过大，以免造成材料浪费。</li>
</ol>
3. 紫外光固化胶粘剂制成的纹理层的制备
<ol>
	<li>将一块PDMS模具块（按步骤1制备）倒置放置在平整的PDMS切片上（按步骤2制备）（图3A，B）。 
	注意：确保模具中的锥形凸起朝向平整的PDMS基底，且仅截顶金字塔的顶面与基底接触。使用光学显微镜检查放置是否正确（图3C，D）。</li>
	<li>在模具的一侧，使用移液器滴加少量紫外光固化胶粘剂（两滴，约0.1–0.2 mL）（图4A）。 
	注意：当液体接触到模具边缘时，毛细作用将驱动液体填充模具与作为基底的平整PDMS切片之间的空腔。
	<ol>
		<li>例如，使用10倍物镜的倒置光学显微镜观察液体在空腔内的推进过程（图4B，C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将紫外光固化胶粘剂暴露于紫外光下以使其固化。根据所用紫外光源的功率密度调整照射时间（例如，使用功率密度为35 mW/cm2的紫外LED箱，在本方案中以50%功率照射2分钟即可完全固化胶粘剂）。</li>
	<li>利用一侧多余的胶粘剂，用手指轻轻按压固定已固化的胶粘剂与平整PDMS基底（图5A，B）。同时，使用镊子夹住模具同一侧边缘的一个角，缓慢剥离模具，并确保纹理化薄膜未被一同掀起。 
	注意：图5C显示了正确脱模操作的结果；图5E–G显示了错误的操作方式。</li>
	<li>使用剃刀刀片修剪多余的胶粘剂和多余的PDMS基底，使固化的纹理化胶层平整地保留在PDMS上，仅在一侧边缘保留部分多余PDMS（图5D），该部分将在步骤5中使用。</li>
</ol>
4. 盖玻片基底的制备
注意：最终器件的基底采用标准的圆形 1.5H 盖玻片，直径为 25 mm。在使用前，需要对其进行清洗，以去除表面的灰尘和/或有机残留物。
<ol>
	<li>盖玻片清洗
	<ol>
		<li>将盖玻片浸入肥皂水中，同时施加超声处理（40 kHz，110 W 超声功率），持续 5 分钟。</li>
		<li>用去离子水（DI 水）清洗盖玻片，先浸洗，最后用自来水管中流动的 DI 水冲洗。用 N2 气体吹枪</li>
		<li>将盖玻片浸入丙酮溶液中5分钟；随后立即转移至2-丙醇（IPA）溶液中继续浸泡5分钟。</li>
		<li>使用挤压瓶中的洁净异丙醇冲洗盖玻片。用氮气吹干盖玻片2 气吹枪 
		注意：使用本方法清洗的盖玻片可存放于密闭容器中，待用时取出。应将其置于干燥柜中，避免湿气在表面凝结。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当准备使用时，用短时间的O处理一块干净的盖玻片2 等离子体处理以提高其亲水性：O2 20 sccm，3 mbar 压力，射频功率发生器功率 60 W，持续 60 秒。</li>
	<li>等离子活化后，立即将盖玻片置于标准旋涂仪的真空卡盘上，取少量紫外光固化胶滴于盖玻片中心，开始旋涂形成薄层图6）进行旋涂：先以500 rpm转速扩散5秒，再以3,000 rpm转速涂覆45秒（加速度与减速度均设为100 rpm/s）。
	<ol>
		<li>若无法进行旋涂，可采用以下替代方法在盖玻片上制备一层紫外固化胶薄膜：
		<ol>
			<li>在洁净的盖玻片上，用移液器滴加约 0.1 mL 紫外光固化胶图7A).</li>
			<li>取第二块盖玻片，将其放置在第一块盖玻片之上，使液体粘合剂在两块盖玻片之间均匀分布（图7B- D).</li>
			<li>当铺展的粘合剂到达盖玻片边缘时，轻轻滑动一片盖玻片使其与另一片分离。分离后，两片盖玻片表面均被一层薄薄的液态粘合剂完全覆盖。图7E). 
			注意：如果分离操作未以平稳且连续的动作进行，涂层可能无法均匀且平滑。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>UV固化胶的预固化
	<ol>
		<li>旋涂后，通过紫外光照射对胶粘剂进行预固化。根据所用紫外光源的功率密度调整照射时间（此处使用功率密度为35 mW/cm²的紫外LED箱）。2 以50%功率超声处理1分钟。 
		关键：此处使用的粘合剂为光学胶。有关其固化所需能量剂量的关键要点，请参见讨论部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 将具有纹理的薄膜转移至最终基底
<ol>
	<li>取一片纹理薄膜（按步骤3制备），将其与涂有胶粘剂的盖玻片（按步骤4制备）接触。确保盖玻片上部分固化的胶粘剂与纹理薄膜之间的接触尽可能均匀（图8A-C）。 
	关键步骤：在此阶段，盖玻片上的胶粘剂应已足够固化，以避免发生再流动，否则在接触时会填充纹理薄膜的金字塔形空腔；但同时仍需保持一定的可塑性和粘附性，以便通过轻轻按压纹理薄膜来优化接触效果。</li>
	<li>将盖玻片暴露于紫外光下，直至盖玻片上涂覆的胶粘剂层完全固化。此步骤可将纹理薄膜牢固密封在盖玻片上，并实现各金字塔形空腔之间的无泄漏隔离。</li>
	<li>最后，剥离PDMS平面基底（图8D-F）。使用镊子夹住PDMS一角边缘处（即步骤3.5中裁剪后留有余料的位置）。通过此方法，可使纹理薄膜层牢固粘附于盖玻片上，且顶部保持开放，便于后续接种细胞。关键步骤：剥离平面PDMS时，纹理薄膜应牢固附着于盖玻片。若在最终紫外照射后无需施力即可将纹理薄膜从盖玻片上剥离，则表明粘附失败。</li>
</ol>
6. 细胞培养盖玻片用于细胞培养的长期钝化
注意：通过生成一种仿生共聚物的共形且连续涂层实现钝化，该共聚物结构类似于细胞膜中磷脂的极性基团。这种共形涂层可防止细胞黏附于细胞培养装置。
<ol>
	<li>将仿生共聚物以0.5%（w/v）的比例溶解于纯乙醇中，配制溶液。将该溶液于4 °C保存，以备后续使用。</li>
	<li>将细胞培养盖玻片放入35 mm的培养皿中，并用仿生共聚物溶液完全覆盖。</li>
	<li>5分钟后，从容器中取出浸有仿生共聚物溶液的细胞培养盖玻片，置于最终的培养皿中，在生物安全柜内室温下干燥（&#62;1 h）。 
	注意：通过提高包被溶液中仿生共聚物的浓度可获得更厚的涂层；更厚涂层的效果可在明场显微镜下观察到（图9A）。</li>
</ol>
7. 细胞接种
<ol>
	<li>脱气与灭菌
	<ol>
		<li>在接种细胞前，将无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）加入细胞培养皿中（通常35 mm培养皿加入1 mL）。使用超声设备对含有无菌PBS的培养皿进行约10分钟的脱气处理，随后反复吹打以去除所有气泡。 
		关键点：若金字塔形微腔内部滞留空气，将阻碍细胞进入。为确保接种细胞前微腔内无空气滞留，建议在体视明场显微镜下（10×或20×放大倍数）目视检查确认这些微腔中无气泡存在（图10）。</li>
		<li>用无菌培养基替换PBS，并在细胞培养罩内用紫外光对培养板灭菌30分钟。 
		注意：从本步骤开始，应将培养皿视为无菌状态，并采用无菌操作技术进行处理。另一种去除细胞培养装置中滞留空气的方法是使用真空泵连接真空罐进行抽气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞悬液制备 
	注意：细胞可作为单细胞或小细胞聚集体接种，并通过顶部孔口进入样品孔。随着时间推移，进入孔内的细胞会聚集并在样品孔内生长形成尺寸大于孔口的球状体。经验证的细胞系模型可选用HCT116（CCL-247 ATCC）或MCF7（HTB-22 ATCC）癌细胞，使用推荐的培养基（ATCC指南）进行维持培养。
	<ol>
		<li>制备细胞悬液（例如，按照ATCC指南进行胰酶消化处理）。根据目标细胞类型，遵循相应的胰酶消化/细胞悬液制备建议。</li>
		<li>计数并调整细胞浓度至推荐培养基中0.5 × 106 个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞加样
	<ol>
		<li>从35 mm细胞培养皿中移除PBS缓冲液，然后加入1 mL调整好浓度的细胞悬液。有关细胞接种过程中细胞密度和均一性良好的光学显微镜图像，请参见图11A。</li>
		<li>将细胞培养皿放回细胞培养箱（37 °C、5% CO2、100%湿度）中孵育10分钟。每个金字塔形微腔大约可进入80–100个细胞。 
		注意：可通过提高细胞浓度或延长细胞悬液停留时间来增加每块培养皿中的细胞数量。通常，在细胞接种后数小时内（取决于细胞类型）开始形成球状体，可通过明场显微镜（4×至40×物镜；图11）进行观察。此后，可根据典型的分化方案（可持续数天、数周或数月），更换或添加培养基、细胞外基质及分化生长因子至含有球状体的培养皿中。</li>
		<li>孵育10分钟后，从培养箱中取出细胞培养皿，轻柔地吸除细胞悬液以去除未被捕获的细胞。向35 mm培养皿中加入1 mL培养基，然后放回细胞培养箱。 
		关键点：此阶段由于球状体尚未形成，必须避免强力吸液或加样操作，以防细胞丢失。强烈建议在此步骤中使用体视明场显微镜进行视觉监控。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 免疫染色与成像
<ol>
	<li>固定与染色 
	注意：不同的经典固定和免疫染色方法均可完全兼容该细胞培养皿。此处描述一种典型方案。
	<ol>
		<li>在室温下，用4%多聚甲醛对细胞培养皿中的类器官/球状体固定20分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下，使用含1%表面活性剂的无菌PBS溶液，在旋转摇床上对类器官透化处理24小时，并在封闭缓冲液（含2%牛血清白蛋白[BSA]和1%表面活性剂的无菌PBS）中，于4 °C在旋转摇床上孵育24小时。</li>
		<li>将样品在抗体稀释缓冲液（含2% BSA和0.2%表面活性剂的无菌PBS）中，与目标一抗以1/50至1/200的稀释比例（或根据制造商建议）在4 °C下孵育48小时。</li>
		<li>在旋转摇床上用洗涤缓冲液（含3% NaCl和0.2%表面活性剂的无菌PBS）清洗样品3次，随后在抗体稀释缓冲液中加入相应的二抗（稀释比例为1/100至1/300，或根据制造商建议）、0.5 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）以及0.2 µg/mL Alexa Fluor 647或488鬼笔环肽，在4 °C下于旋转摇床上孵育24小时，之后用PBS清洗五次。可选步骤：使用预热至37 ˚C的水溶性透明剂封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像 
	注意：在此阶段，微孔板中的类器官可视为含有已固定和染色样品的常规培养皿，可直接用于成像，无需任何调整或修改标准成像流程。图12展示了使用转盘共聚焦显微镜（配备40倍空气物镜，数值孔径0.75）获得的代表性图像及三维重建结果。
	<ol>
		<li>使用成像系统配套软件进行自动图像采集，设置如下：曝光时间 = 50 ms，通过电动Z轴载物台采集Z层序列图像（Z步进1 µm，总高度70 µm）。</li>
		<li>使用图像分析软件进行三维重建。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 类器官的释放与收集
注意：在固定之前，可将细胞培养皿的纹理粘附层从盖玻片上分离，以释放出位于金字塔形微腔内的活体球状体/类器官，用于后续其他分析步骤，如RNA测序、组学方法等。 体外 实验，以及 体内 移植
<ol>
	<li>将样本仍置于培养皿中，并在生物安全柜内，使用刀片（如手术刀）切割纹理化粘附层的一角。</li>
	<li>用镊子夹住已切开边缘的纹理化粘附层，轻轻将其从玻璃盖玻片上剥离，但需保持其浸没在培养基中（部分类器官可能仍附着在粘附层上，图13）。</li>
	<li>用培养基清洗3次，并通过移液收集类器官。</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+materials+for+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li>
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<li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+past+learning+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li>
<li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72(2020).</li>
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<li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+organoids%3A+a+bright+future+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li>
</ol>

一项国际专利申请已公布，公布号为 WO 2021/167535 A1。

本文描述了一种微孔培养皿的制备方法，该培养皿可实现类器官的高密度培养与分化。由于微腔的几何形状和排列方式，可在单个培养板上长期（数周或更长时间）培养和染色数千个类球体，且材料损失几乎可以忽略不计。作为对比，细胞培养板上4 mm × 2 mm的区域所能容纳的类球体数量，相当于一个面积为12 cm × 8 cm的384孔板的容量。
微腔的规则分布以及用作基底的平整标准盖玻片，使得能够在三维条件下同时监测数千个活体或固定的类器官，而无需在培养容器与成像载体之间进行复杂且耗时的样品操作。由于微腔呈锥形结构，顶部面积小于底部，因此在换液、添加细胞外基质或染色等移液操作过程中不会造成类器官丢失。所有这些操作均可像处理二维细胞单层一样直接进行，无需额外防护措施，这与传统的类器官生成技术（如悬滴法、低吸附培养板、Aggrewell）不同。
此外，与这些现有技术相比，该微孔阵列专为高分辨率3D成像而设计，可兼容各类浸没物镜（空气、水、油和硅油物镜）。类器官长期紧贴平面玻璃盖玻片的培养方式，使细胞培养盖玻片可直接用于高分辨率光学显微镜观察，而现有...

在器官型三维细胞培养中，下文简称&#160;类器官是指干细胞分化并自组织形成在形态和功能上均与真实器官高度相似的空间结构。类器官为在体外研究人类生物学和发育过程提供了有价值的模型1,2,3越来越多的模型正在被开发出来，用以模拟肝脏、大脑、肾脏、肺脏以及许多其他器官。2,4,5类器官的分化通过按精确时间顺序添加可溶性生长因子和细胞外基质来引导。然而，与真实器官相比，类器官的发育具有显著的异质性。
除了众多的生物学挑战6,7之外，类器官培养在细胞培养方法、转录组学表征和成像方面也带来技术上的挑战。In vivo（体内）的器官发育发生在特定的生物环境中，导致细胞排列高度刻板化的自我组织。任何表型改变均可作为诊断疾病状态的间接指标。相比之下，类器官在体外（in vitro）发育时所处的微环境控制极为有限，仅需满足细胞培养条件即可，这导致每个个体类器官在发育路径和形态形成上存在较大变异。
最近一项研究8表明，将类器官形态的定量成像（表型描述符）与少数遗传标志物的检测相结合，可构建出表型发育图谱。可以认为，将类器官中基因组表达的多样性与其表型行为相关联的能力，是充分释放类器官培养物全部潜力的重要一步。因此，迫切需要开发专用的高内涵成像方法，以在亚细胞、多细胞和整个类器官的三维尺度上对类器官特征进行表征9,10。
我们开发了一种多功能的高内涵筛选（HCS）平台，可实现从分离的人胚胎干细胞（hESCs）、人诱导多能干细胞（hIPSCs）或原代细胞到三维、多细胞、分化的类器官的标准化类器官培养，并支持快速、非侵入性的三维成像。该平台整合了一种下一代微型化三维细胞培养装置，称为JeWells芯片（下文简称芯片），其包含数千个排列有序的微孔，每个微孔两侧设有45°反射镜，可通过单物镜光片显微镜实现快速、三维、高分辨率成像11。该系统兼容任何标准商用倒置显微镜，可在&#60;1小时内以亚细胞分辨率对300个类器官进行三维成像。
细胞培养装置的微加工始于一个已有的微结构模具，该模具包含数百个微金字塔（图1A），其底面为正方形，侧壁与底面成45°角。图1C展示了此类结构的电子显微镜（EM）图像。该模具本身由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，可通过标准软光刻工艺，以具有相应特征（作为凹腔）的原始模具复制而成（此处未显示）。原始模具可通过多种方法制备，本方案所用的原始模具是采用硅湿法刻蚀技术制备的，如Galland等.11所述；但原始模具的制备方法对本方案并非关键。这些金字塔呈方形阵列排列，在X和Y方向上具有相同的间距（本例中间距为350 µm）。
例如，已有概念验证实验12发表，证明该芯片可在精确设定每个孔中初始细胞数量的同时，支持长期培养（数月）和分化方案。大量类器官的个体发育过程可通过标准明场显微镜和3D光片荧光显微镜进行自动活细胞实时监测。此外，类器官可被回收用于进一步的生物学研究（如转录组学分析）。本文详细阐述了细胞培养盖玻片的制备、荧光显微镜观察所需的接种与染色步骤，以及类器官回收的具体方案。

<table><tbody><tr><td>2-丙醇</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AA19397K7</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AA19392K7</td><td></td></tr><tr><td>BC43 台式共聚焦显微镜</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>转盘共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>缓冲氧化物刻蚀液</td><td>Merck</td><td>901621-1L</td><td></td></tr><tr><td>CEE 旋涂仪</td><td>Brewer Science</td><td>200X</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>显影液 AZ400K</td><td>Merck</td><td>18441223164</td><td></td></tr><tr><td>去离子超纯水</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Marienfled</td><td>117650</td><td>1.5H，圆形，直径 25 mm</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>BitPlane</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>倒置透射光学显微镜</td><td>Nikon</td><td>TSF100-F</td><td></td></tr><tr><td>Labsonic M</td><td>Sartorius Stedium Biotech</td><td></td><td>超声波均质器</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF America</td><td>CM5206</td><td>生物模拟共聚物</td></tr><tr><td>NOA73</td><td>Norland Products</td><td>17-345</td><td>紫外光固化胶粘剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽</td><td>Thermofisher scientific&amp;nbsp;</td><td>A12379</td><td>Alexa Fluor</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermofisher scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>光刻胶 AZ5214E</td><td>Merck</td><td>14744719710</td><td></td></tr><tr><td>Pico Plasma 工具</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Pico Plasma</td><td>用于 O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 等离子体处理</td></tr><tr><td>RapiClear 1.52</td><td>Sunjin lab</td><td>RC 152001</td><td>水溶性透明剂</td></tr><tr><td>RCT 加热板/搅拌器</td><td>IKA (MY)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反应离子刻蚀设备</td><td>Samco Inc. (JPN)</td><td>RIE-10NR</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>HCT116 细胞培养基</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>聚二甲基硅氧烷，简称 PDMS</td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>表面活性剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>Thermofisher scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Bransonic</td><td>CPX2800</td><td></td></tr><tr><td>UV-KUB 2</td><td>KLOE</td><td></td><td>紫外 LED 光源，波长 365 nm，功率密度 35 mW/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>紫外掩模对准器</td><td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td><td>MJB4</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于类器官培养与三维成像的高通量平台

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

目前，标准成像方法限制了在不同分辨率尺度上对大量三维（3D）类器官培养物（类器官）进行表征的能力。本方案描述了一种制备微加工类器官培养芯片的方法，该芯片可在用户友好的仪器上实现多尺度、三维活体成像，操作简便，成像通量可达每小时300个类器官。这些培养芯片兼容空气和浸没物镜（空气、水、油和硅油），并适用于多种常见显微镜（例如转盘共聚焦、点扫描共聚焦、宽场和明场显微镜）。此外，它们还可用于光片成像模式，例如单物镜单平面照明显微镜（SPIM）技术（soSPIM）。
本文所述方案详细介绍了微加工培养芯片的制备以及类器官的培养与染色步骤。操作人员只需较短时间即可掌握该技术，且所需耗材和设备在普通生物实验室中均易于获取。本方案将仅使用商用标准显微镜演示三维成像能力（例如，采用转盘共聚焦显微镜进行三维重建，以及宽场显微镜进行常规监测）。

图8F 显示了成功制备后细胞培养盖玻片的典型外观。紫外光固化胶粘剂层表面平整，并与盖玻片良好粘附。若盖玻片上的胶层过度固化，或移除平坦的PDMS基底操作不当（如图8G、H所示），则可能导致胶粘剂层在盖玻片上的转移失败。在这两种情况下，失败的表现明显：无纹理薄膜被转移到盖玻片上。
为了使微孔发挥作用，所制备的微结构薄膜（如方案步骤3所述）必须确保金字塔结构的顶部和底部均处于开放状态，以保证在步骤7接种细胞时，细胞能够进入空腔，并在类器官开始形成后被有效限制在其中。图9展示了随着包被液中仿生共聚物浓度的增加，涂层厚度的提升情况。图10展示了对细胞培养皿进行脱气处理的结果，以确保金字塔形空腔内无空气滞留。图10A、B显示了完全...

本文介绍了一种新型培养基底的制备方案，该基底每平方毫米含有数百个微容器2，其中可培养类器官并利用高分辨率显微镜进行观察。还详细描述了细胞接种和免疫染色方案。

在不同分辨率尺度下对大量三维（3D）类器官培养物（类器官）进行表征的能力目前受限于……

本方案展示了一种用于培养数百个类器官的微结构细胞培养皿，该培养皿基于材料学设计，且完全兼容显微成像。我们的技术能够高效地生成数千个类器官，适用于长期活细胞成像和长期细胞培养。该方案在生物医学应用领域具有重要意义，例如药物筛选流程和癌症研究领域。本方案中介绍的技术对于任何具备实验室操作和光学显微镜使用经验的人员而言，只需经过几次尝试即可掌握。首先，将PDMS模具切割成所需最终装置尺寸的小块，切割方向应平行于阵列的XY方向。将一块制备好的PDMS模具芯片背面朝下放置在平整的PDMS区域上。然后使用移液器，在模具的一侧加入约0.1至0.2毫升的紫外光固化胶。在10倍放大倍率的倒置光学显微镜下观察液体在腔体内的流动过程。将胶粘剂暴露于紫外光下进行固化。根据文稿中所述的紫外光源功率密度调整照射时间。利用一端多余的胶粘剂，用手指轻轻按压，将已固化的胶粘剂固定在平坦的PDMS基底上。同时，使用镊子夹住与固定边缘相邻的模具一角，缓慢剥离模具，同时确保纹理薄膜不被抬起。使用剃刀刀片修剪多余的粘合剂和PDMS基底，使固化后的纹理粘合层平整地保留在PDMS上，仅在一侧边缘保留多余的基底。对洁净的盖玻片进行短暂的氧气等离子体处理，以提高其亲水性。等离子活化后，将盖玻片置于标准匀胶机的真空卡盘上，于盖玻片中心滴加少量紫外光固化胶，然后旋涂一层薄胶。匀胶过程按照文稿中所述方法进行。若无法进行旋涂，可使用移液器在洁净的盖玻片上滴加约 0.1 毫升紫外光固化胶。取第二块盖玻片，将其放置在第一块盖玻片之上，使液体粘合剂在两块盖玻片之间均匀铺展。当粘合剂扩散至盖玻片边缘后，轻轻滑动其中一块盖玻片，使其与另一块缓慢分离。分离后，两块盖玻片表面均会均匀覆盖一层薄薄的液体粘合剂。旋涂后，通过紫外光照射对胶粘剂进行预固化。根据所用紫外光源的功率密度调整照射时间。取一片纹理薄膜，使其与涂有胶粘剂的盖玻片接触。确保部分固化的胶粘剂与纹理薄膜之间的接触尽可能均匀。此时，盖玻片上的粘合剂应已足够固化，以避免重新流动，可通过轻轻按压盖玻片来优化接触效果。将盖玻片暴露于紫外光下，直至涂覆的粘合剂层完全固化。这将密封盖玻片上的微结构薄膜，并在周边腔室之间提供防漏隔离。然后使用镊子夹住修剪后边缘残留多余材料的PDMS，将PDMS平面基底剥离下来。此步骤可使带有微结构的薄膜层贴附于盖玻片上，同时顶部保持开放，便于后续细胞接种。在细胞接种前，对于已按照文中所述使用生物相容性共聚物进行表面钝化处理的装置，向35毫米细胞培养培养皿中加入1毫升无菌PBS。使用无菌 PBS 在真空腔室中对培养皿脱气 10 分钟，随后通过多次移液操作去除所有气泡。将 PBS 更换为无菌培养基，并在细胞培养罩内用紫外光对培养板灭菌 30 分钟。根据文中所述针对目标细胞的胰蛋白酶消化或细胞悬浮液制备建议，制备细胞悬液。用推荐的细胞培养基将细胞浓度调整

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用于类器官培养和 3D 成像的高通量平台

利用此处所述的单细胞分辨率三维成像方案，可完整捕获类器官的整个三维结构、细胞组成及其与原始组织的表型相似性。该方案适用于来源、大小和形状各异的多种类器官。...

单细胞分辨率下完整类器官的三维成像

本文提供了详细、可靠且互补的实验方案，用于对厚度从100...

三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像

高度准确的 体外 高通量检测系统被开发用于评估基于患者来源肿瘤类器官（PDOs）的抗癌药物，这类类器官类似于癌组织，但不适合用于 体外...

高通量 体外 使用患者来源肿瘤类器官的检测方法

本方案描述了一种用于中高通量类器官药物筛选的半自动化方法，以及一种不依赖显微镜型号的自动化图像分析软件，可用于定量和可视化分析多参数的单个类器官药物反应，以捕捉肿瘤内异质性。...

利用宽场活细胞成像进行大规模及单肿瘤类器官分析的多参数类器官药物筛选

本研究描述了在多功能装置内，使类球体和类器官保持在水凝胶中完整状态的情况下，对其进行培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记以及在各种显微镜下观察的方法学。...

在水凝胶中完整培养、冻存、处理及成像类器官与球状体

本方案详细记录了SPOT（一种基于支架的高通量培养平台）在96孔和384孔板格式中的制备与组装过程。同时，还介绍了SPOT的接种流程，包括手动操作以及使用 commercially available liquid...

可重复制造SPOT作为高通量基于支架的培养平台

我们介绍了一种利用低相干全息层析技术对类器官进行高分辨率、无标记、三维成像的逐步操作方案。本方案详细说明了类器官培养制备、成像采集以及计算图像分析的全过程，可实现对活体类器官结构动态变化及药物反应的实时可视化观察。...

无标记、高分辨率三维成像结合低相干全息层析与机器学习分析肠道类器官

我们开发了一种新型的多区室神经元共培养微系统平台，用于体外研究中枢神经系统中轴突与胶质细胞的相互作用。该平台能够并行开展多达六项独立实验，并采用新开发的宏/微混合制造方法加工而成。...

一种多区室中枢神经系统神经元-胶质细胞共培养微流控平台

展示了无需透镜的片上细胞成像与表征技术。这种片上细胞成像方法为医学诊断和高通量细胞生物学应用提供了一种紧凑且成本效益高的工具，特别适用于资源匮乏的环境。...

无透镜片上细胞成像技术为高通量细胞生物学与医学诊断提供了新工具

我们介绍了用于研究Caenorhabditis elegans脂质储存的可靠生化与显微方法。一种快速、简便的固定-染色法可利用亲脂性染料尼罗红（Nile...

秀丽隐杆线虫中脂肪含量的生化与高通量显微评估

学习微纹理细胞培养皿技术，用于高通量类器官培养与长期显微成像。该方法支持药物筛选和癌症研究中的生物医学应用，为研究人员提供标准化的类器官培养方案。

一种用于类器官培养与三维成像的高通量平台

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