颗粒稳定乳液的细胞亲和力促进抗原内化

我们开发了PLGA纳米颗粒稳定的皮克林乳液。Pickering乳液改善了细胞与抗原蛋白细胞的亲和力，诱导抗原的有效内化。纳米颗粒稳定的皮克林乳液易于制备和高效递送抗原。

此外，还使用一种方法来监测乳液对细胞的亲和力并详细说明内化。该协议为设计具有高细胞效率和高效抗原内化的新型制剂提供了见解，为开发高效疫苗提供了平台。首先，将100毫克聚乳酸-乙醇酸以4比1的比例加入10毫升丙酮和乙醇混合物中，作为油相。

将20毫升PVA水溶液置于通风橱下，并以每分钟400转的速度磁力搅拌。使用注射泵将五毫升油相逐滴添加到PVA溶液中。然后在通风橱中搅拌混合物，直到有机溶剂完全蒸发。

有机溶剂挥发后，将混合物以15， 000 G离心，洗涤三次或更多次，直到最终洗涤水清澈透明。将洗涤后的PLGA纳米颗粒重新悬浮在两毫升去离子水中，并将混合物在80摄氏度下冷冻24小时。为了表征PLGA纳米颗粒的大小和zeta电位，将10微升PLGA纳米颗粒加入一毫升去离子水中以获得稀释剂溶液并将稀释剂溶液转移到DTS1070细胞中。

打开计算机和动态光散射分析仪。然后将 DTS1070 单元放入 DLS 系统。单击 Zetasizer 软件并创建一个新的测量文件以设置测定程序。

然后开始测定程序以获得粒度和 zeta 电位分布。为了制备PLGA纳米颗粒稳定的Pickering乳液或PNPE，将冻干PLGA纳米颗粒以每毫升4毫克的浓度添加到去离子水中，然后加入角鲨烷作为油相。在水浴超声仪中以 100 瓦的一步超声处理制备 PNPE 五分钟。

稀释20微升PNPE和1毫升去离子水。将20微升乳液滴在载玻片上。使用40倍放大倍率的光学显微镜观察乳液的形态和均匀性并获得照片。

按下电源按钮打开旋涂机。按下控制按钮并设置涂布时间和速度。将氮气管连接到旋涂机，并将气瓶的分馏调整为 0.4 千帕。

将干净的切屑放在旋涂机的吸盘上。将100微升聚-l-赖氨酸滴加到二氧化硅传感器的中心，并关闭旋涂机的顶盖。按下开始按钮开始涂覆样品，完成后停止机器。

关闭真空泵，关闭电源和控制按钮，并取下聚-L-赖氨酸改性二氧化硅传感器。要确定仿生细胞外囊泡对PNPE的粘附，请打开计算机，电子单元和蠕动泵，并激活软件右下角的温度控制，以确保设定温度比室温低约一摄氏度。根据操作说明将聚-L-赖氨酸改性二氧化硅传感器放入流通池中，并连接流通池和流量泵之间的测量线。

将流通池放置在流动模块系统内。单击"采集"工具栏并选择"设置测量"，在所用通道中搜索芯片的 1、3、5、7、9 和 11 倍频程。要更正基线，请单击"开始测量"以允许空气进入流量模块，直到空气基线平滑为止。

在流动去离子水10至15分钟以再次使溶液基线平衡后，将制备的PNPE溶液以每分钟50微升的流速泵入流动模块，以在二氧化硅传感器上实现平衡吸附。将制备的仿生细胞外囊泡溶液以每分钟50微升的流速泵入流动模块中，以跟踪bEV粘附到PNPE表面的过程。将骨髓树突状细胞与 1640 完全培养基孵育 7 天，然后将它们接种到小共聚焦激光培养皿中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳培养箱下以每孔 1 倍 10 至 6 倍过夜。

将0.5毫升花青5标记的卵清蛋白与0.5毫升PNPE混合1小时，并以5， 000 G离心20分钟除去流体抗原以开发疫苗制剂。用200微升去离子水重悬后，将10微升制剂加入超洁净工作台下的小型共聚焦激光培养皿中，并与骨髓树突状细胞共培养6小时。从细胞中取出培养液后，用预热的磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。

在室温下用4%甲醛溶液和PBS固定细胞10分钟。用PBS在室温下洗涤细胞两到三次，每次10分钟。在室温下用100微升0.5%Triton X-100溶液透化细胞5分钟。

用PBS再次洗涤细胞后，用200微升异硫氰酸荧光素共轭鬼笔环肽工作溶液覆盖小共聚焦激光培养皿的玻璃底培养皿上的细胞，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。用PBS洗涤细胞三次后，每次五分钟，用200微升DAPI溶液重新染色细胞核约30秒。对于图像分析，请依次打开共聚焦显微镜硬件，包括激光、共聚焦、显微镜和计算机。

单击软件并选择尼康共聚焦进入测试系统。在共聚焦显微镜系统中，按记下的顺序打开各个单元。首先，设置FITC，DAPI和Cy5通道，并调整相应的高压和偏移。

然后在选择100倍油透镜并将一滴雪松油放在顶部后，将装有染色骨髓树突状细胞的小共聚焦激光培养皿放在显微镜载物台上。单击扫描按钮。在荧光显微镜下，通过移动x轴，y轴和z轴来定位感兴趣的细胞。

调整激光强度、图像大小和其他参数，以便扫描高质量的共聚焦图像。最后，点击 捕获 按钮并保存图像。使用QCM-D跟踪仿生细胞外囊泡对PNPE的粘附。

频率立即降低，表明在遇到后仿生细胞外囊泡与PNPE的快速粘附。此外，delta F随着仿生细胞外囊泡浓度的增加而降低，反映了浓度依赖性效应。PLGA微粒和表面活性剂稳定的纳米乳液与仿生细胞外囊泡的结合较弱，即使在每毫升80微克的高浓度下也是如此，这可能是由于缺乏与免疫细胞的接触位点。

花青-5卵清蛋白荧光信号表明，PNPE处理组内化到细胞中的抗原总量明显高于PLGA微粒和表面活性剂稳定的纳米乳液处理组。细胞摄取的定量分析显示，用PNPE处理的荧光和骨髓树突状细胞的相对强度明显高于用PLGA微粒和表面活性剂稳定的纳米乳液处理的荧光和骨髓树突状细胞。结果表明，PNPE促进了抗原内化，并有效地将抗原递送到细胞内。

为了获得均匀的乳液，必须在超声处理过程中连续摇动混合物。