Name: 颗粒稳定乳液的细胞亲和力促进抗原内化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 了解PLGA纳米颗粒稳定的皮克林乳液技术，用于增强抗原递呈细胞的细胞亲和力和促进抗原高效内化。该方法为疫苗开发提供了创新平台。

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本工作得到以下项目资助：中国国家重点研发计划（2021YFE020527、2021YFC2302605、2021YFC2300142）；中国科学院基础前沿科学研究计划“从0到1”原始创新项目（ZDBS-LY-SLH040）；国家自然科学基金创新研究群体项目（批准号：21821005）。

本方案中描述的所有方法均已获得中国科学院过程工程研究所的批准。所有动物实验均严格遵循《实验动物管理和使用条例》以及《动物伦理审查指南》（中国，GB/T35892-2018）。
1. PLGA 纳米颗粒的制备与表征
<ol>
	<li>PLGA 纳米颗粒（PNPs）的制备
	<ol>
		<li>将 0.5 g 聚乙烯醇（PVA）加入 120 mL 去离子水中，在 90 °C 下搅拌至完全溶解，以制备 PVA 溶液。冷却至室温后，将溶液储存于冰箱（4 °C）中。</li>
		<li>将 100 mg PLGA 加入 10 mL 丙酮与乙醇混合溶剂（比例为 4:1）中，作为油相。</li>
		<li>将 20 mL PVA 水溶液置于通风橱内，以 400 rpm/min 的速度磁力搅拌。使用注射泵将 5 mL 油相逐滴加入 PVA 溶液中。然后在通风橱中持续搅拌，直至有机溶剂完全挥发。 
		注意：随着油相中颗粒浓度的增加，水相溶液逐渐变为澄清透明的淡蓝白色或乳白色。</li>
		<li>待有机溶剂挥发完全（2–3 h）后，在 15,000 x g 条件下离心混合物。洗涤三次或更多次，直至最后一次洗涤液清澈透明。 
		注意：此步骤的主要目的是洗去颗粒表面残留的 PVA，以防止其影响后续 Pickering 乳液的制备。</li>
		<li>将洗涤后的 PNPs 重新悬浮于 2 mL 去离子水中，在 -80 °C 下冷冻 24 h，随后在冻干机中冻干 48–72 h。所制备的 PNPs 呈白色絮状。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PNPs 的表征
	<ol>
		<li>为表征 PNPs 的粒径与Zeta电位，取 10 µL PNPs 加入 1 mL 去离子水中，得到稀释液，并将稀释液转移至 DTS1070 样品池中。开启计算机与动态光散射分析仪（DLS），然后将 DTS1070 样品池放入 DLS 系统中。</li>
		<li>点击 Zeta Size Software，创建新的测量文件并设置测定程序。随后点击 Start 开始测定，获得颗粒粒径与Zeta电位分布。</li>
		<li>为观察 PNPs 的形貌，将 0.1 mL PNPs 溶液（稀释 40 倍）均匀涂布于一张 5 cm × 5 cm 的锡箔纸上，并在通风良好的通风橱中自然晾干过夜。</li>
		<li>剪下一小块锡箔，用导电胶带固定在样品台上，在 10 mA 电流下喷金 120 s。随后使用扫描电子显微镜（SEM）观察样品的表面形貌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PNPE 的制备与表征
<ol>
	<li>为制备PNPE，将冻干的PNPs加入去离子水中，使其浓度为4 mg/mL（水相），然后加入角鲨烯作为油相。制备PNPE 通过 在水浴超声仪中以100 W功率进行一步超声处理5分钟。油水相比例为1:9。</li>
	<li>制备的PNPE的表征
	<ol>
		<li>打开 Mastersizer 2000 软件，然后依次点击激光器。点击 测量 打开预设程序并设置样品名称。点击 开始 开始测量样品的背景信号，然后使用滴管向激光粒度分析仪的样品池中加入1 mL PNPE，平行测定乳液的粒径三次。</li>
		<li>稀释 20 µL 1 mL 去离子水中。滴加 20 µL 观察载玻片上乳液的形态和均一性，使用40倍光学显微镜观察并拍摄照片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原加载效率
	<ol>
		<li>溶解 200 µg 将卵清蛋白（OVA）溶于500 mL去离子水中，然后与500 mL已制备的PNPE混合，在室温下振荡反应1小时。通过5000 × g离心去除液相抗原 g 20 分钟。</li>
		<li>使用二辛可宁酸（BCA）法测定流体抗原浓度27抗原负载效率的计算公式如下： 
		抗原加载效率 = <img alt="抗原定量方程公式，用于免疫分析中游离抗原百分比的计算。" src="/files/ftp_upload/64406/64406eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
		采用相同的方法测定作为对照组的SSE的抗原负载效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PNPE的稳定性
	<ol>
		<li>将6 mL制备好的PNPE均分为六等份，每份1 mL，并将其中三份分别储存于 4 °C 和 25 °C分别。稀释 20 µL 在第0、3、6天，将储存的PNPE按1:50比例溶于1 mL去离子水中。随后，测定在不同温度下保存的PNPE储备溶液的粒径和zeta电位。 
		注意：设置不同的储存温度旨在比较不同温度对PNPE稳定性的影响，从而优化其高稳定性和长保质期的储存条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PLGA微粒（PMPs）的制备
	<ol>
		<li>将500 mg PLGA溶于5 mL二氯甲烷中作为油相，然后倒入含有1.5% PVA的50 mL外部水相中，得到油/水混合物。使用匀浆机以3000 rpm均质1分钟，得到粗乳液。</li>
		<li>通过膜乳化法保持微球中PLGA颗粒大小的均一性（由粗乳液决定）。安装一个 5.2 µm 膜置于膜管中。将压力调节至800 kPa并保持稳定。</li>
		<li>打开排气阀和进料阀，将粗乳液加入样品罐后，关闭排气阀和进料阀，打开出料阀和入口阀，用200 mL烧杯收集膜后乳液。重复该过程三次，得到预双乳液。</li>
		<li>在室温下搅拌预双乳液，使二氯甲烷挥发，从而固化微球。使用去离子水在7741 × g条件下洗涤微球。 g 3 分钟，重复 5 次。在 -80 °C 冰箱中预冷冻80 °C 最后冻干以获得干燥的微球。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PMPs 的表征
	<ol>
		<li>打开 Mastersizer 2000 软件，然后依次点击激光器。点击 测量 打开预设程序并设置样品名称。点击 开始 开始测量样品的背景值。然后，用滴管向激光粒度分析仪的样品加样罐中加入1 mL PMPs，并平行测量微粒粒径三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>柔软度分析 
	注意：PNPE 已涂覆到 SiO2 传感器用于测量柔软度。
	<ol>
		<li>清洁 SiO2 石英传感器芯片经紫外臭氧处理10分钟，用5 mL乙醇（75% v/v）冲洗两次，并用N₂吹干2. 安装空的 SiO₂ 芯片2 将石英传感器芯片放入流动池中。</li>
		<li>打开计算机，启动软件右下角的温度控制功能，以确保设定温度约为 1 °C 低于室温。</li>
		<li>点击 采集 工具栏中的按钮，然后选择 设置测量 搜索所用通道中芯片的第1、3、5、7、9和11倍频。单击 采集 工具栏中的按钮并选择 开始测量.</li>
		<li>用空气校正基线，当基线平衡后，选择停止并将文件保存为空白。</li>
		<li>清洗芯片并进行旋涂 10 µg/mL 芯片上PNPE的处理。简而言之，打开匀胶机并设置运行参数。连接N2 将管道连接至旋涂仪，调节气体钢瓶的分压至0.4 kPa，将洁净芯片置于旋涂仪的吸盘上。加入 100 µL 将PNPE逐滴加入SiO中心2 传感器并关闭匀胶机的顶盖以完成涂覆。</li>
		<li>将PNPE包被的芯片安装到流动池中。重复步骤2.7.3-2.7.4，并将文件保存为PNPE。打开空白和PNPE两个文件，点击拼接（Stitch）按钮，获得耗散（ΔD）相关数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分离并培养骨髓来源的树突状细胞（BMDCs） 28
注意：确保所有试剂和样品均置于冰上，这有利于保持细胞活性。为保持无菌状态，所有操作均须在超净工作台中使用无菌器具进行。
<ol>
	<li>处死 C57BL/6（雌性，6-8 周龄）小鼠 通过 一氧化碳2 吸入并在70% (v/v) 乙醇中浸泡以进行短暂消毒。</li>
	<li>浸泡3-5分钟后，将小鼠转移至超净工作台。使用不锈钢剪刀去除腿部肌肉以暴露股骨和胫骨，随后分离股骨与胫骨。</li>
	<li>将70%（v/v）乙醇倒入培养皿中，将洁净的骨骼浸泡其中5-10秒，以完成外部消毒。将所有骨骼清洁后放入无菌离心管中，并在管周放置冰块。</li>
	<li>用剪刀将股骨和胫骨在靠近关节处剪去。将注射器针头插入骨骼中，用预冷的 RPMI 1640 培养基冲洗出骨髓至离心管中。</li>
	<li>冲洗两到三次，直至骨骼完全变白。用移液器反复吹打骨髓数次，以充分分散所有细胞团块。使用滤器将细胞悬液过滤至15 mL离心管中 40 µm 直径筛</li>
	<li>离心 4 °C 和 500 x g 5 分钟。弃去上清液，向沉淀中加入 2 mL 红细胞裂解液，作用 4 分钟。</li>
	<li>洗涤两到三次后，将细胞重悬于2 mL完全培养基中（含1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清、20 ng/mL IL-4和10 ng/mL GM-CSF）。随后稀释 10 µL 将细胞重悬于1 mL PBS中，将手持式自动细胞计数仪的芯片插入细胞稀释液中进行细胞计数。最后，以1 x 10⁶细胞/mL的密度接种细胞。6 细胞/mL 接种至含完全培养基的 10 mm 培养皿中。</li>
	<li>在含5% CO₂的细胞培养箱中培养细胞2 在 37 °C每隔2天更换一次培养基。第7天时，将细胞转移至50 mL离心管中，于450 x g 5 分钟以收集细胞。</li>
</ol>
4. 仿生细胞外囊泡（bEVs）的制备
<ol>
	<li>按照制造商的说明依次组装微型挤出器。使用前确保注射器外壳无裂纹。每次实验前检查所有O型圈是否完好，及时更换磨损或损坏的O型圈。磨损或损坏的O型圈在操作挤出器时可能导致突然的压力释放。</li>
	<li>反复吹打吸出BMDCs，并转移至离心管中。在450 x g离心以收集细胞。 g 5 分钟 4 °C. 通过加压使细胞悬液穿过 10 µm, 5 µm，以及 1 µm 使用微型挤出器对聚碳酸酯膜进行30次挤出29. 
	注意：为了确保bEV大小的均一性，将BMDC悬液通过 10 µm, 5 µm，以及 1 µm 聚碳酸酯膜进行30次推注。此外，在操作过程中，确保均匀施加力量，并保持施力方向沿注射器轴线。</li>
	<li>将汇集的上清液在1000 x g下离心5分钟 g 和 4 °C 去除细胞。收集上清液，并在3000 x g 5 分钟 4 °C 以去除残留的细胞和细胞碎片。</li>
	<li>收集上清液，并在 100,000 x g 90 分钟 4 °C弃去上清液，将bEVs重悬于2 mL HEPES缓冲盐水（HBS）中。纯化bEVs 通过 通过过滤 0.45 µm 膜并将在−80 °C下保存纯化的bEVs80 °C.</li>
</ol>
5. bEVs 与 PNPE 结合
注意：SiO₂2 传感器经过修饰 通过 旋涂法
<ol>
	<li>用聚-L-赖氨酸（PLL）修饰的 SiO2 传感器。
	<ol>
		<li>使用紫外臭氧处理仪对 SiO2 石英传感器芯片清洗 10 分钟，用乙醇冲洗两次，并用 N2 吹干。</li>
		<li>按下电源按钮启动旋涂仪，再按下控制按钮，设置涂覆时间和转速。初始转速为 400 rpm，随后稳定升至 5000 rpm。</li>
		<li>将 N2 气管连接至旋涂仪，并将气瓶的减压阀调节至 0.4 kPa。将清洗后的芯片放置在旋涂仪的吸盘上。在 SiO2 传感器中心逐滴加入 100 µL 的 PLL 溶液，然后关闭旋涂仪的上盖。</li>
		<li>按下启动按钮开始样品涂覆，完成后停止设备。关闭真空泵，关闭电源和控制按钮，取下经 PLL 修饰的 SiO2 传感器。 
		​注意：在按下启动按钮前，需确认已设定好涂覆时间和转速；确保 SiO2 传感器位于吸盘中心位置；运行前必须关闭盖子，以防发生意外。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定 bEVs 在 PNPE 表面的黏附
	<ol>
		<li>开启计算机、电子单元、蠕动泵，并在软件界面右下角启动温度控制功能，确保设定温度比室温低约 1 °C。</li>
		<li>根据操作说明将经 PLL 修饰的 SiO2 传感器放入流通池中，并连接流通池与流泵之间的测量管路。将流通池置于流控模块系统内，实验开始前先用超纯水冲洗。</li>
		<li>点击采集工具栏，选择设置测量，搜索所用通道中芯片的第 1、3、5、7、9 和 11 倍频。为校正基线，点击开始测量，使空气进入流控模块，直至空气基线平稳。随后以去离子水冲洗 10–15 分钟，使溶液基线重新达到平衡。</li>
		<li>以 50 µL/min 的流速将配制好的 PNPE 溶液泵入流控模块，使 PNPE 在 SiO2 传感器表面达到吸附平衡。 
		注意：当再次泵入 PNPE 时，若 ΔF 不再发生变化，表明 SiO2 传感器表面已被 PNPE 完全覆盖。</li>
		<li>以 50 µL/min 的流速将配制好的 bEVs 溶液泵入流控模块，以监测 bEVs 在 PNPE 表面的黏附过程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 抗原摄取的共聚焦激光扫描显微镜分析
<ol>
	<li>将PNPE-OVA与BMDCs共培养
	<ol>
		<li>用完全1640培养基（含1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清、20 ng/mL IL-4和10 ng/mL GM-CSF）孵育BMDCs 7天，随后将细胞以每孔1 × 106的密度接种于小型共聚焦激光培养皿中，在37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。</li>
		<li>将0.5 mL Cy5标记的OVA（400 µg/mL）与0.5 mL PNPE混合，室温孵育1小时，然后在5000 × g条件下离心20分钟以去除游离抗原，获得疫苗制剂。用200 µL去离子水重悬后，在超净工作台中向小型共聚焦激光培养皿中加入10 µL制剂（OVA终浓度为10 µg/mL），与BMDCs共培养6小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞骨架染色
	<ol>
		<li>移除细胞培养液，用预热的磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）洗涤细胞两次。</li>
		<li>在室温下用含4%甲醛的PBS溶液固定细胞10分钟。固定过程中避免使用含甲醇的固定液，以免破坏肌动蛋白结构。</li>
		<li>在室温下用PBS洗涤细胞2至3次，每次10分钟。加入100 µL 0.5% Triton X-100溶液，在室温下透化5分钟，再用PBS在室温下洗涤2至3次，每次10分钟。</li>
		<li>在小型共聚焦激光培养皿的玻底培养孔中加入200 µL异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鬼笔环肽工作液，室温避光孵育30分钟。为降低背景信号，可在FITC标记的鬼笔环肽工作液中添加1%牛血清白蛋白。此外，孵育期间应盖上小型共聚焦激光培养皿的盖子，防止溶液蒸发。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。加入200 µL DAPI溶液（浓度：100 nM）复染细胞核，染色约30秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>依次开启共聚焦显微镜硬件，包括激光器、共聚焦系统、显微镜和计算机。点击NIS-Elements AR 5.20.00 软件，选择Nikon Confocal 进入检测系统。</li>
		<li>在共聚焦显微镜系统中按顺序开启各组件。首先设置FITC、DAPI和Cy5通道，并调节相应的增益（HV）和偏移量（offset）。然后选择100倍油镜，并在其顶部滴加一滴杉木油。将含有染色BMDCs的小型共聚焦激光培养皿置于显微镜载物台上。</li>
		<li>点击Scan 按钮。在荧光显微镜下通过调节X轴、Y轴和Z轴定位目标细胞。调节激光强度、图像尺寸等参数，以获取高质量的共聚焦图像。最后点击Capture 按钮并保存图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

我们开发了聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒稳定的油/水乳液，作为一种增强抗原内化的递送系统。所制备的PNPE具有致密排列的表面，可为结合位点提供支持，同时具备独特的柔软性和流动性，从而实现与免疫细胞膜的有效接触。此外，油/水界面可实现高载量抗原负载，而两亲性PLGA赋予PNPE高度稳定性，有利于抗原向免疫细胞的运输。PNPE能够快速黏附于细胞表面，表明PLGA纳米颗粒稳定的乳液对细胞膜具有强亲和力，可促进细胞摄取。此外，PNPE具有良好的安全性，因为角鲨烯和PLGA均为美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的成分30，有望推动其安全地向临床转化。
PLGA的分子量以及连续相和分散相的类型影响了PNPE的性质，包括稳定性和疏水性。在本研究中，选择分子量为17 kDa的PLGA纳米颗粒作为稳定剂，角鲨烯作为分散相，从而提高了稳定性。此外，以去离子水作为连续相简化了配方的组成。在此条件下，PNPE能够有效组装抗原并促进抗原向免疫细胞的递送。此外，采用一步超声法来制备PNPE，消除了繁琐的操作步骤并避免了污染的可能性。需要特别注意...

为了应对流行性、慢性及传染性疾病，开发用于预防性和治疗性疫苗的有效佐剂至关重要1,2。理想的佐剂应具备优良的安全性和免疫激活能力3,4,5。抗原呈递细胞（APCs）对抗原的有效摄取和加工被认为是下游信号级联反应及免疫应答启动的关键阶段6,7,8。因此，深入理解免疫细胞与抗原相互作用的机制，并设计可增强抗原内化的佐剂，是提高疫苗效力的有效策略。
具有独特性质的微米/纳米颗粒此前已被研究作为抗原递送系统，用于介导抗原的细胞摄取以及细胞与病原体相关分子模式的相互作用9,10。当递送系统与细胞接触时，会开始与细胞外基质和细胞膜相互作用，从而引发内化及后续的细胞反应11,12。以往的研究表明，颗粒的内化过程始于细胞膜与颗粒之间的黏附13，随后发生细胞膜的柔性变形以及受体向膜表面的扩散14,15。在这些条件下，递送系统的特性取决于其与抗原呈递细胞（APCs）的亲和力，进而影响抗原的摄取量16,17。
为了深入了解递送系统的设计以增强免疫应答，大量研究工作集中于探讨颗粒特性与细胞摄取之间的关系。本研究源于以下观察：尽管具有不同电荷、尺寸和形状的固态微/纳米颗粒常被广泛研究，但流体性质在抗原内化过程中的作用却鲜有探讨18,19。事实上，在黏附过程中，软质颗粒能够表现出动态曲率变化和侧向扩散，从而增加多价相互作用的接触面积，而这一特性难以通过固态颗粒实现20,21。此外，细胞摄取位点的细胞膜为磷脂双分子层（含鞘脂或胆固醇），疏水性物质可改变脂质的构象熵，从而降低细胞摄取所需的能量22,23。因此，增强递送系统的流动性并促进其疏水性，可能是强化抗原内化以提升免疫应答的有效策略。
由固体颗粒在两种不相混溶液体界面处组装而稳定的皮克林乳液，已在生物领域得到广泛应用24,25。事实上，聚集在油/水界面的颗粒决定了多层级结构的形成，从而促进多层级递送系统与细胞之间的相互作用，并进一步诱导药物递送中多功能的理化特性。由于皮克林乳液具有可变形性和侧向流动性，预期其可与免疫细胞发生多价态细胞相互作用，并被膜蛋白识别26。此外，由于皮克林乳液中的油性胶束核心并未被固体颗粒完全覆盖，因此在油/水界面的颗粒之间存在不同尺寸的间隙，导致更高的疏水性。因此，探索皮克林乳液对抗原提呈细胞（APCs）的亲和性，并阐明其后续的内化过程，对于开发高效的佐剂至关重要。
基于这些考虑，我们设计了一种由PLGA纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE），作为一种流体疫苗递送系统，同时有助于深入了解PNPE与骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的亲和性及其细胞内化过程。通过模拟生物的细胞外囊泡（bEVs；作为BMDCs的替代物）实时监测其与PNPE的黏附过程 通过 一种基于石英晶体微天平并结合耗散监测（QCM-D）的无标记方法。在表征PNPE与骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的亲和性之后，采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测抗原摄取情况。结果表明PNPE对BMDCs具有更高的亲和力，并能有效促进抗原的内化。我们预期PNPE对抗原呈递细胞（APCs）具有更高的亲和性，可能更有效地促进抗原内化，从而增强免疫应答。

<table><tbody><tr><td>AddVax</td><td>InvivoGen</td><td>Vac-adx-10</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-CS</td><td>70 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）</td><td>Nikon</td><td></td><td>A1</td></tr><tr><td>Cy3 NHS 酯</td><td>YEASEN</td><td>40777ES03</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 染色液</td><td>碧云天</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>FITC 鬼笔环肽</td><td>Solarbio</td><td>CA1620</td><td></td></tr><tr><td>Mastersizer 2000 粒径分析仪</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>膜乳化设备</td><td>中科森晖微球科技</td><td></td><td>FM0201/500M</td></tr><tr><td>微型挤出器</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NANO ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td>JSM-6700F</td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26780-50-7</td><td>分子量 7,000–17,000</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>Solarbio</td><td>P2100</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇（PVA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>QSense 二氧化硅传感器</td><td>Biolin Scientific</td><td>QSX 303</td><td>表面粗糙度 &amp;lt; 1 nm RMS</td></tr><tr><td>石英晶体微天平</td><td>Biosharp</td><td></td><td>Q-SENSE E4</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基基础液</td><td>Gibco</td><td>C22400500BT</td><td>含 L-谷氨酰胺，25 mM HEPES</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>JEOL</td><td></td><td>JSM-6700F</td></tr><tr><td>角鲨烯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-02-4</td><td></td></tr></tbody></table>

提高抗原内化的颗粒稳定乳液对细胞亲和性

Cellular Affinity of Particle-Stabilized Emulsion to Boost Antigen Internalization

微/纳米颗粒的细胞亲和力是细胞识别、细胞摄取和激活的前提条件，这些过程对于药物递送和免疫应答至关重要。本研究源于一个观察：尽管固体颗粒的电荷、尺寸和形状对细胞亲和力的影响通常被广泛考虑，但我们却很少意识到柔软性、动态重构现象以及复杂界面相互作用在细胞亲和力中的关键作用。在此，我们开发了由聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE），克服了刚性结构的局限性，并模拟了病原体的柔韧性和流动性。我们建立了一种方法，用于检测PNPE与细胞表面的亲和力，并阐明免疫细胞对其后续的内化过程。采用石英晶体微天平结合耗散监测技术（QCM-D）测定了PNPE与生物模拟的细胞外囊泡（bEVs，作为骨髓来源树突状细胞BMDCs的替代物）之间的亲和力，该技术可实时监测细胞与乳液之间的黏附过程。随后，利用PNPE递送抗原（卵清蛋白OVA），并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察BMDCs对抗原的摄取情况。代表性结果表明，当PNPE接触bEVs时，频率立即下降（ΔF），提示PNPE与BMDCs之间发生快速黏附并具有高亲和力。与PLGA微粒（PMPs）及AddaVax佐剂（记为表面活性剂稳定的纳米乳液[SSE]）相比，PNPE与细胞膜的结合能力显著更强。此外，由于通过动态曲率变化和侧向扩散增强了免疫细胞的细胞亲和力，PNPE在抗原摄取方面也显著优于PMPs和SSE。该实验方案为设计具有高细胞亲和力和高效抗原内化的新型制剂提供了理论依据，为高效疫苗的开发提供了一个可行平台。

采用简单的一步超声处理法制备PNPE。首先，我们制备了均匀的PNPs，用作固体稳定剂（图1A）。通过SEM观察PNPs的形态，显示其大多均匀且呈球形（图1B）。采用动态光散射法测定各制剂的流体动力学粒径和Zeta电位 通过 DLS结果显示，PNPs的直径为187.7 ± 3.5 nm，zeta电位为-16.4 ± 0.4 mV（图1C 和 补充表1）。制备PNPE时，将PNP溶液（0.4%，w/v）与角鲨烯混合物简单地在100 W功率下超声处理5分钟（图1D）。在优化连续相后，所得的 PNPE 内部含有角鲨烯，外部吸附有 PNPs（补充图1）。采用光学显微镜观察乳液液滴，使用Mastersizer粒度分析仪测定粒径分布。PNPE的颗粒数量既不会过少而无法阻止乳液聚结，也不会过多而在连续相中过量导致形成更大的聚集体。<...

为了合理设计高效的佐剂，我们开发了聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE）。该PNPE具有独特的柔软性和疏水界面，可实现强烈的细胞接触，同时提供高含量的抗原负载，从而增强递送系统对抗原呈递细胞的亲和力，并促进抗原的有效内化。

微/纳米颗粒的细胞亲和力是细胞识别、细胞摄取和激活的前提条件，这些过程对于药物递送至关重要。

我们开发了由PLGA纳米颗粒稳定的皮克林乳液。该皮克林乳液增强了细胞对抗原蛋白细胞的亲和力，有效促进抗原的内化。这种纳米颗粒稳定的皮克林乳液制备简便，且能高效递送抗原。此外，采用了一种方法来监测乳剂与细胞的亲和力，并阐明其内化过程。本方案为设计具有高效细胞摄取和有效抗原内化的新型制剂提供了指导，从而为高效疫苗的开发建立了平台。首先，将100毫克聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入10毫升丙酮与乙醇按4:1比例配制的混合溶液中，作为油相。在通风橱中，将20毫升PVA水溶液置于磁力搅拌器上，以每分钟400转的速度搅拌。使用注射泵将5毫升油相逐滴加入PVA溶液中。然后在通风橱中持续搅拌混合物，直至有机溶剂完全蒸发。有机溶剂挥发后，将混合物在15,000 G条件下离心。洗涤三次或更多次，直至最终洗涤水清澈透明。将洗涤后的PLGA纳米颗粒重新悬浮于两毫升去离子水中，并在零下80摄氏度下冷冻24小时。为表征PLGA纳米颗粒的粒径和zeta电位，取10微升PLGA纳米颗粒加入一毫升去离子水中，制成稀释液，然后将稀释液转移至DTS1070样品池中。打开计算机和动态光散射分析仪，然后将DTS1070样品池放入DLS系统中。点击Zetasizer软件，创建新的测量文件以设置测定程序。然后启动测定程序，以获得粒径和泽塔电位分布。为制备由PLGA纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE），将冻干的PLGA纳米颗粒以每毫升4毫克的浓度加入去离子水中，随后加入角鲨烷作为油相。使用水浴超声仪，通过一步超声法在100瓦功率下超声处理5分钟，制备PNPE。取20微升PNPE与1毫升去离子水稀释。取20微升乳液滴于载玻片上。使用光学显微镜在40倍放大倍数下观察乳液的形态和均一性，并拍摄照片。按下电源按钮开启匀胶仪。按下控制按钮，设置涂覆时间和转速。将氮气管连接至匀胶仪，并调节气体钢瓶的减压阀至0.4千帕。将洁净的芯片放置在匀胶机的吸盘上。将100微升多聚-L-赖氨酸逐滴加至二氧化硅传感器的中心位置，然后关闭匀胶机的顶盖。按下启动按钮开始涂覆样品，完成后停止机器。关闭真空泵，关闭电源和控制按钮，取下经多聚-L-赖氨酸修饰的二氧化硅传感器。为测定仿生细胞外囊泡与PNPE的黏附性，启动计算机、电子单元和蠕动泵，在软件界面右下角激活温度控制功能，确保设定温度比室温低约1摄氏度。按照操作说明将经多聚-L-赖氨酸修饰的二氧化硅传感器放入流动池中，并连接流动池与流泵之间的测量管路。将流动池放入流动模块系统中。单击采集工具栏，选择“设置测量”以在所用通道中搜索芯片的1、3、5、7、9和11个倍频程。为校正基线，单击“开始测量”，使空气进入流动模块，直至空气基线平滑。用去离子水冲洗 10 至 15 分钟，使溶液基线重新达到平衡后，以 50 微升/分钟的流速将制备好的 PNPE 溶液泵入流动模块，使硅 dioxide 传感器表面实现平衡吸附。以 50 微升/分钟的流速将制备好的仿生细胞外囊泡（bEV）溶液泵入流动模块，以追踪 bEV 黏附至 PNPE 表面的过程。将骨髓来源的树突状细胞用 1640 完全培养基孵育 7 天，随后在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中，以每孔 1 × 10⁶ 细胞的密度接种至小型共聚焦激光培养皿中过夜培养。将0.5毫升Cy5标记的卵清蛋白与0.5毫升PNPE混合，孵育1小时，然后在5,000 ×g条件下离心20分钟以去除液相抗原，从而制备疫苗制剂。用200微升去离子水重新悬浮后，在超净工作台中将10微升该制剂加入小型共聚焦激光培养皿中，并与骨髓来源树突状细胞共培养6小时。移除细胞培养液后，用预热的磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。用 4% 甲醛溶液与 PBS 在室温下固定细胞 10 分钟。在室温下用 PBS 洗涤细胞两到三次，每次 10 分钟。用 100 微升 0.5% Triton X-100 溶液在室温下对细胞进行透化处理，持续 5 分钟。用 PBS 再次洗涤细胞后，向小共聚焦激光培养皿的玻璃底部分加入 200 微升荧光素异硫氰酸酯标记的鬼笔环肽工作液，覆盖细胞，在室温避光条件下孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟，随后用 200 微升 DAPI 溶液对细胞核复染约 30 秒。进行图像分析时，依次开启共聚焦显微镜的硬件设备，包括激光器、共聚焦系统、显微镜和计算机。点击软件并选择尼康共聚焦显微镜以进入测试系统。在共聚焦显微镜系统中，按照指定顺序开启各个单元。首先，设置 FITC、DAPI 和 Cy5 通道，并调节相应的增益电压（HV）和偏移量。然后选择100倍油镜，在镜头上滴一滴雪松油，将含有染色骨髓树突状细胞的小型共聚焦激光皿置于显微镜载物台上。点击扫描按钮。在荧光显微镜下，通过调节x轴、y轴和z轴移动来定位目标细胞。调节激光强度、图像大小及其他参数，以获取高质量的共聚焦图像。最后，点击采集按钮并保存图像。使用QCM-D追踪仿生细胞外囊泡与PNPE的黏附情况。频率立即下降，表明仿生细胞外囊泡在与PNPE接触后迅速发生黏附。此外，随着仿生细胞外囊泡浓度的增加，ΔF逐渐降低，反映出浓度依赖性效应。即使在80微克/毫升的高浓度下，PLGA微粒和表面活性剂稳定的纳米乳液与仿生细胞外囊泡的结合也较弱，这可能是由于缺乏与免疫细胞的接触位点所致。氰基-5标记的卵清蛋白荧光信号表明，与PLGA微粒和表面活性剂稳定的纳米乳液处理组相比，PNPE处理组细胞内化抗原的总量显著更高。细胞摄取的定量分析显示，经PNPE处理的骨髓树突状细胞的荧光相对强度显著高于经PLGA微粒和表面活性剂稳定的纳米乳液处理的细胞。实验结果表明，PNPE可促进抗原的内化，并有效将抗原递送至细胞内。为了获得均匀的乳液，在超声处理过程中必须持续摇动混合物。

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颗粒稳定乳液的细胞亲和力促进抗原内化

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本文描述了抗原性脂质体纳米颗粒的制备方法及其在体外和体内刺激B细胞活化的应用。in vitro 和 in vivo...

用于产生疾病特异性抗体的抗原性脂质体

在此，我们介绍一种可快速、可重复地制备具有可调控大小、形状及表面蛋白呈递能力的仿生可降解人工抗原呈递细胞（aAPC）的实验方案，用于T细胞扩增。 离体 或 体内.

各向异性聚合物人工抗原呈递细胞的制备及其在CD8+ T细胞活化中的应用

由于抗原特异性T细胞频率极低，因此难以对其进行表征或用于治疗。本文中，我们提供了一种磁性微粒的制备方案，该微粒可结合抗原特异性T细胞，用于富集这些细胞，并将其扩增数百倍，从而用于后续的表征与治疗应用。...

利用磁性纳米颗粒富集并扩增稀有抗原特异性T细胞

本方案描述了外膜囊泡的生物工程化，以构建“即插即用”型疫苗平台，包括其制备、纯化、生物偶联及表征。...

基于展示SARS-CoV-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

该方案详细介绍了评估纳米乳剂麦冬皂苷D佐剂是否能够促进有效细胞免疫反应的方法。...

体外 细胞活性评价纳米乳疫苗佐剂麦冬皂苷D

为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化症的动物模型），需用含有自身抗原和完全弗氏佐剂的油包水乳剂对小鼠进行免疫。尽管目前已存在多种乳剂制备方案，本文介绍了一种快速、简便且标准化的乳剂均质化制备方法。...

一种快速、简单且标准化的匀浆方法用于制备抗原/佐剂乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎

本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内...

评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫应答

在本方案中，我们开发了一种阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸（RA），用作佐剂以促进抗原特异性的全身和黏膜免疫应答。通过将美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的视黄酸添加到纳米乳剂中，在肌肉注射该纳米乳剂后，可促进阴道和小肠中的抗原特异性分泌型IgA（sIgA）产生。...

阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进OVA特异性全身及黏膜免疫应答

了解PLGA纳米颗粒稳定的皮克林乳液技术，用于增强抗原递呈细胞的细胞亲和力和促进抗原高效内化。该方法为疫苗开发提供了创新平台。

提高抗原内化的颗粒稳定乳液对细胞亲和性

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