Name: 噬菌体介导的莱姆病螺旋体伯氏疏螺旋体的遗传操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解利用φBB-1噬菌体介导的DNA转导技术对伯氏疏螺旋体进行遗传操作的方法。该技术为电转化效率低的菌株提供了替代方案，有助于深入研究莱姆病病原体的分子致病机制。

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作者感谢Shawna Reed、D. Scott Samuels和Patrick Secor提供的有益讨论，以及Vareeon (Pam) Chonweerawong提供的技术支持。本工作由昆尼皮亚克大学健康科学学院生物医学科学系以及Christian H. Eggers获得的教员研究基金资助。

所有涉及重组DNA和生物安全等级2级生物体的实验均经过昆尼皮亚克大学机构生物安全委员会审查并批准。
1. 准备伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）培养物以产生φBB-1
<ol>
	<li>制备添加了6.6%热灭活正常兔血清的Barbour-Stoenner-Kelly培养基（BSK）15。配制1 L的1x BSK时，将表1中所列组分加入900 mL水中，用1 N氢氧化钠调节pH至7.6，并在4 °C下缓慢搅拌混合2–4小时。混合完成后，必要时再次检查并调整pH至7.6，然后加水定容至1 L。使用0.22 µM滤器（见材料表）过滤除菌，新鲜使用或于4 °C保存不超过2个月。</li>
	<li>在开始转导实验前3至5天，将适量的B. burgdorferi克隆（150 µL）接种至15 mL 1x BSK培养基中，使用带紧密盖子的无菌锥形离心管（见材料表）。根据B. burgdorferi克隆的需求，在培养基中添加适当浓度的抗生素或抗生素组合，用于外源DNA的筛选与维持（表2）。 
	注意：B. burgdorferi属于生物安全二级病原体。操作时应采取所有适当的防护措施。所有涉及活B. burgdorferi培养物的操作均须在经过认证且正确消毒的II级生物安全柜中进行。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）指南，妥善处理所有接触过B. burgdorferi的材料及细菌本身34。</li>
	<li>将培养物置于33 °C条件下静置培养，直至螺旋体密度达到≥5 × 107 个·mL−1，此过程大约需要3–5天。</li>
</ol>
2. 测定 B. burgdorferi 菌液的密度（改良自 Samuels）15
<ol>
	<li>对于预计密度高于 5 × 106 个细胞·mL−1 的样品，使用分光光度法测定细胞密度。
	<ol>
		<li>取 1 mL 培养物转移至 1.7 mL 微量离心管中，在室温下以 8,000 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4 和 1.8 mM KH2PO4）中。将全部细胞悬液转移至半微量紫外透明比色皿中。</li>
		<li>在波长 600 nm 处测定重悬样品的光密度（A600）。使用 PBS 对分光光度计（参见材料表）进行调零。</li>
		<li>为计算原始培养物中螺旋体·mL−1 的浓度，将 A600 处的光密度值乘以 1.4 × 109。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于预计密度介于 5 × 104 个细胞·mL−1 至 5 × 106 个细胞·mL−1 之间的样品，使用 Petroff-Hausser 计数板（参见材料表）直接计数螺旋体数量。对于更高密度的样品，经适当稀释后也可采用此方法。 
	注意：活体螺旋体的观察需要配备暗视野聚光镜的显微镜。
	<ol>
		<li>取 10 µL 样品加入计数板中，并盖上合适的盖玻片。若样品密度高于 1 × 107，需用 PBS 稀释样品，使每视野含有 50–100 个螺旋体。</li>
		<li>使用暗视野显微镜在 200x–400x 放大倍数下计数细胞。计数所有焦平面内共 25 组、每组 16 个小方格的全部区域。</li>
		<li>将计得的细胞数乘以稀释倍数（如有）和 5 × 104，得到原始培养物中的细胞·mL−1 数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 诱导 B. burgdorferi 噬菌体 φBB-1
注意：所有玻璃器皿和塑料器皿均需通过高压灭菌法进行灭菌；所有溶液需通过高压灭菌或经0.22 µM滤膜过滤进行灭菌。以下步骤基于15 mL体积进行描述，但该方法可根据实验的具体需求按比例放大或缩小体积。
<ol>
	<li>对于将产生噬菌体的 B. burgdorferi 培养物（供体），使用步骤 2 中任一方法计算出的浓度，确定获得 4 mL 浓度为 2 × 108 螺旋体·mL−1 所需的起始培养物体积。在恢复阶段（下文步骤 3.6），这将使 15 mL 体系中的最终浓度达到 5 × 107 螺旋体·mL−1。</li>
	<li>将步骤 3.1 计算出体积的培养物在 6,000 × g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 4 mL 新鲜 BSK 培养基中。将样品转移至可容纳样品且顶部空间最小的无菌管中。</li>
	<li>根据 4 mL 培养体积，加入适量诱导剂至推荐浓度（表 3），以诱导噬菌体产生。 tightly 封盖试管并充分混匀。</li>
	<li>将样品在 33 °C 下孵育 2–4 小时。</li>
	<li>孵育结束后，将样品转移至 15 mL 离心管中。在 6,000 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 15 mL 1× BSK 中。 
	注意：在噬菌体诱导后，转导实验有两种不同的后续操作方法。这些方法在 图 1 以及步骤 4 和步骤 6 中展示。</li>
</ol>
4. 供体细胞经诱导剂处理后，在共培养期间进行转导（图1A）
注意：该实验方案仅在噬菌体产生菌株（供体）对某种特定抗生素具有抗性，且待转导菌株（受体）对另一种抗生素具有抗性的条件下方可使用。
<ol>
	<li>按照上述步骤1中所述方法，准备用于转导实验的受体菌B. burgdorferi培养物。根据步骤2中测定的密度，计算获得15 mL浓度为1 × 107 螺旋体·mL−1所需的培养物体积。</li>
	<li>将步骤4.1中计算出的培养物体积在6,000 x g条件下离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于1 mL步骤3.6中的培养物（重悬的噬菌体供体）中，然后将重悬的受体菌重新加入含供体菌的培养物中。不添加抗生素。两种培养物混合后的总体积为15 mL。</li>
	<li>在33 °C下孵育72–96小时。</li>
	<li>共培养后，按照步骤7所述方法通过固体平板培养进行转导子筛选。</li>
</ol>
5. 聚乙二醇（PEG）沉淀法回收噬菌体用于转导实验
注意：本方案适用于噬菌体产生菌株（供体）对某种抗生素具有抗性，而待转导菌株（受体）不具有抗生素抗性或对另一种抗生素具有抗性的场合。
<ol>
	<li>向第 3.6 步的培养物中加入适当抗生素，抗生素浓度参见表 2。将样品在 33 °C 下孵育 72–96 小时。</li>
	<li>准备用于 PEG 沉淀的溶液。
	<ol>
		<li>配制 500 mL 的 5 M NaCl 溶液。通过高压灭菌进行灭菌，并在使用前冷却。室温保存。</li>
		<li>通过将 200 g PEG8000 溶解于 400 mL 水中配制 500 mL 的 40% PEG 溶液；边搅拌边轻轻加热，直至溶液充分混合。加水定容至 500 mL。为完全溶解 PEG8000 并对溶液进行灭菌，需进行高压灭菌，使用前冷却。室温保存。</li>
		<li>配制 100 mL 悬浮培养基（SM；100 mM NaCl、10 mM MgSO4 和 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]）。通过高压灭菌进行灭菌。4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对来自供体 B. burgdorferi 克隆（第 3.6 步）的噬菌体进行 PEG 沉淀：在孵育 72–96 小时后，于 4 °C 下以 8,000 × g 离心 20 分钟。</li>
	<li>将上清液倾入干净的 50 mL 锥形管中；弃去细胞沉淀。加入 5 M NaCl，使终浓度为 1 M。充分混匀。室温下轻轻摇动 1 小时。</li>
	<li>于 4 °C 下以 8,000 × g 离心 10 分钟。将上清液倾入干净的 50 mL 锥形管中；沉淀可能较小或不存在。向上清液中加入 40% PEG8000 溶液，使终浓度为 10%。充分混匀后置于冰上超过 1 小时，最长可过夜。 
	注：更长的沉淀时间似乎并未显著提高噬菌体回收率。</li>
	<li>于 4 °C 下以 8,000 × g 离心 20 分钟。弃去上清液，并尽可能去除多余的液体，但不要丢失含有噬菌体颗粒的沉淀。</li>
	<li>用最小体积的 SM 溶液重悬沉淀，使用 SM 冲洗瓶壁以收集可能存在的噬菌体颗粒。推荐比例为每 10 mL 原始上清液使用 400 µL SM，但根据沉淀大小，可能需要更多或更少的 SM 以实现完全重悬。</li>
	<li>根据重悬体积，用等体积的氯仿处理回收的噬菌体样品。充分混匀后，于 8,000 × g 离心 10 分钟。小心移取水相（上层）至干净试管中，避免接触厚实的界面层。 
	注：φBB-1 是一种无包膜的噬菌体，对氯仿处理不敏感25。此步骤旨在进一步破坏任何膜结合结构（如细胞或膜泡），并杀死潜在的细胞污染物。氯仿为挥发性有机溶剂，仅可在通风良好的通风橱中使用；含氯仿的废弃物应作为有机废物处理。</li>
	<li>测定第一次氯仿处理后的回收体积，并加入相当于该体积 10% 的氯仿再次处理样品。充分混匀后，于 8,000 × g 离心 10 分钟。小心移取水相（上层），避免接触界面层或有机相。将水相转移至干净试管中。</li>
	<li>立即使用噬菌体（如第 6 步所述），或于 4 °C 保存。 
	&#8203;注：不建议冷冻保存 φBB-1 噬菌体样品。尽管 φBB-1 在 4 °C 下的稳定性尚未经过严格研究，但回收后于 4 °C 保存长达 1 个月的样品在转导实验中仍可成功使用。</li>
</ol>
6. φBB-1 经 PEG 沉淀后的转导实验（图1B）
<ol>
	<li>按照上述步骤1中所述方法，准备用于转导实验的受体菌株 B. burgdorferi 培养物。根据步骤2测定的密度，计算获得15 mL浓度为1 × 107 螺旋体·mL−1 所需的受体菌培养物体积。</li>
	<li>将步骤6.1中计算出的培养物体积在6,000 × g 条件下离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于14.5 mL新鲜BSK培养基中。</li>
	<li>向受体克隆培养物中加入≤500 µL的PEG沉淀噬菌体样品（来自步骤5）。充分混匀后，在33 °C下孵育72–96小时。 
	&#8203;注意：PEG沉淀过程中回收的噬菌体量可能因多种因素而存在差异。然而，从15 mL诱导后的 B. burgdorferi 菌株CA-11.2A培养物中，通常500 µL样品含有50–1,000个有活力的噬菌体28。若噬菌体回收体积≥500 µL，可能会对 B. burgdorferi 的生长产生不利影响，可能是由于SM与BSK的比例升高所致。</li>
	<li>在与PEG沉淀的噬菌体混合后，按照步骤7所述方法通过固相平板法筛选转导子。</li>
</ol>
7. 转导子的筛选
注意：对潜在转导子的固体培养基平板培养采用的是Samuels首次描述的方案的单层改良法15。B. burgdorferi菌落在琼脂内部生长，因此在倒平板时必须将样品加入培养基中，以实现通过固体培养基平板法筛选转导子。先前已有报道使用96孔板稀释法筛选转化子的替代方法35。该技术也可能适用于转导子的筛选，但尚未在此目的上进行尝试。
<ol>
	<li>根据转导实验和对照样品的数量，确定筛选转导子所需的平板数量。 
	注意：通常每个样品制备两个平板，一个相当于培养物体积的约10%，另一个包含剩余的全部培养物。此外，还需制备作为阴性对照的平板，分别用于检测在筛选过程中使用的抗生素存在下，噬菌体制备物和/或用作供体与受体的亲本克隆是否能够生长。建议额外准备至少两个平板的铺板材料。例如，如果待铺板的样品和对照总数为8个，则应准备足够用于10个平板的铺板混合液。</li>
	<li>按以下说明准备铺板溶液。 
	注意：每个平板体积为30 mL，由20 mL 1.5x BSK和10 mL 2.1%琼脂糖组成（比例为2:1），最终得到含1x BSK和0.7%琼脂糖的平板。例如，若需制备10个平板，则总共需准备300 mL铺板混合液，其中包含200 mL 1.5x BSK和100 mL 2.1%琼脂糖。
	<ol>
		<li>按照步骤1.1中所述方法配制1 L 1.5x BSK，使用表1中列出的各组分对应1.5x BSK的用量。储存方式与1x BSK相同。</li>
		<li>将2.1%琼脂糖溶于水中并进行高压灭菌。琼脂糖溶液可新鲜使用或室温保存。若室温保存，在铺板前需加盖松开的盖子，用微波炉加热至完全熔化。</li>
		<li>根据整个铺板混合液的总体积，确定所需抗生素的体积，以达到适当的终浓度（表2）。 
		注意：如果最终铺板溶液的总体积为300 mL，则将200 mL 1.5x BSK与适量抗生素混合，确保300 mL总体积中抗生素浓度正确。如果转导实验中的供体和受体具有不同的抗生素抗性基因，则铺板混合液中应同时包含两种抗生素。如果来自供体的PEG沉淀噬菌体（如步骤5所制备）编码一种抗生素抗性标记而受体无任何抗性基因，则铺板混合液中仅需加入该一种抗生素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需倒制的平板数量，将适量的1.5x BSK和抗生素转移至一个足够大的无菌瓶中，以容纳全部铺板混合液。在56 °C水浴中平衡至少15分钟。</li>
	<li>将来自高压灭菌器或微波炉熔化的琼脂糖置于56 °C水浴中平衡至少15分钟。</li>
	<li>平衡完成后，将已确定量的2.1%琼脂糖加入含有1.5x BSK（含抗生素）的瓶中，并将铺板溶液重新放回42 °C水浴中平衡10–15分钟。 
	注意：较高温度可能损伤或杀死螺旋体36。若使用同一水浴，开始计时前应先将水温冷却至42–45 °C。铺板溶液在42 °C下平衡时间不得超过20分钟，否则在倒板过程中会开始凝固。</li>
	<li>在平衡期间，准备待铺板的B. burgdorferi样品。将待铺板的体积转移至一个新的无菌50 mL锥形离心管中（见材料表）。
	<ol>
		<li>若铺板体积小于1.5 mL（&#60;最终30 mL平板体积的5%），将样品转移至新管，并在铺板时直接将铺板混合液加入样品中。</li>
		<li>对于较大体积，将所需体积的培养物转移至新管，然后在室温下以6,000 x g离心10分钟。弃去上清液，仅保留100–500 µL，用于在铺板前完全重悬沉淀。</li>
		<li>对于共培养后的对照平板，向无菌50 mL锥形离心管中加入≥107个供体或受体克隆细胞。若体积超过1.5 mL，则按步骤7.6.2进行离心并重悬沉淀。若转导实验使用了PEG沉淀的噬菌体，除受体克隆外，还需将100–250 µL噬菌体样品加入无菌50 mL锥形管中用于铺板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当铺板溶液在42–45 °C平衡10–15分钟后，取30 mL铺板溶液加入含有相应样品的管中；立即将铺板混合液与样品分配至已标记的平板中。每份样品使用新的移液器重复操作。</li>
	<li>让平板静置固化15–20分钟，然后将其置于33 °C、补充5% CO2的培养箱中。倒制后至少48小时内不得翻转平板。</li>
	<li>根据受体克隆的背景，在培养10–21天后检查选择性平板中琼脂糖内部是否出现菌落。使用无菌棉塞的5.75英寸硼硅酸盐移液管（见材料表），挑取至少5–10个在两种抗生素存在下生长的菌落，并接种至含适当抗生素的1.5 mL 1x BSK培养基中。</li>
	<li>在33 °C下培养接种的菌落，如步骤1.3所述，培养3–5天，或直至在200倍暗视野显微镜下观察到每视野约20–40&#160;个螺旋体。 
	&#8203;注意：一旦完成筛选（见步骤8），可通过将等体积培养物与经0.22 µm滤器过滤除菌的60%甘油和40% 1x BSK混合液混合，于−80 °C长期冷冻保存螺旋体。</li>
</ol>
8. 潜在转导子的验证
注意：应筛选在含有两种抗生素的平板上生长的克隆，以确认其为预期（受体）遗传背景中的真实转导子。这些方法基于通过聚合酶链式反应（PCR）对特定区域进行扩增，可能还包括测序。有关在 B. burgdorferi 中进行 PCR 的详细方案与操作实践，可参见其他文献（近期示例见 Seshu 等人37）。应根据所使用的菌株选择用于筛选转导子的引物。以下将介绍一些筛选转导子的建议方法。
<ol>
	<li>为PCR筛选制备 B. burgdorferi 裂解物。 
	注意：以下方案用于从步骤7.9中培养的细胞制备经洗涤的 B. burgdorferi 裂解物，以便立即通过PCR分析DNA。该方法旨在尽量减少BSK中潜在抑制物的干扰，但不推荐用于制备高质量DNA以用于测序或长期保存。如需此目的，请使用全基因组提取方案或试剂盒（见材料表）。强烈建议同时制备亲本克隆（包括供体和受体菌株）的裂解物，并在每次分析中一并使用。
	<ol>
		<li>将步骤7.10中筛选并培养的每种潜在转导子各500 µL转移至洁净的微量离心管中。</li>
		<li>在室温下以8,000 × g 离心10分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将每份沉淀重悬于500 µL TE缓冲液（10 mM Tris Cl，pH 8.0；1 mM EDTA，pH 8.0）中，在室温下以8,000 × g 离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将每份沉淀重悬于50 µL PCR级水中。将样品煮沸10分钟，短暂冷却后，在室温下以8,000 × g 离心10分钟。</li>
		<li>进行每项PCR时，立即取离心后样品上清液顶部的2 µL使用；避免扰动沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用PCR对潜在转导子中编码抗生素抗性的特定基因进行筛选。用于筛选转导实验中常用抗生素抗性标记物的引物见表4。 
	注意：尽管在我们的经验中极为罕见，但在 B. burgdorferi 中仍可能发生自发突变，导致对用于外源DNA筛选的氨基糖苷类抗生素产生抗性。</li>
	<li>同时使用其他菌株或克隆标记对潜在转导子进行筛选，以确认其遗传背景确为受体菌株。在这些分析中应包括供体和受体亲本克隆。根据所用菌株及各实验室确定菌株完整性的标准操作流程，利用特异性序列对菌株特异性标记进行检测。</li>
	<li>若计划将转导应用于具有致病性的克隆，以用于蜱媒介或哺乳动物宿主中，或与另一克隆直接比较，则需测定转导子及其亲本克隆的完整质粒组成。此举旨在确保其质粒组成与对照菌株一致，或含有在自然传播循环中增殖所必需的遗传元件，具体说明见其他文献18,19,37,38,39。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

转导的使用可能代表了一种克服与电转化相关的部分生物学和技术障碍的方法 B. burgdorferi1,4,13,37在许多系统中，噬菌体可通过普遍性转导或特异性转导将宿主（非原噬菌体）DNA在细菌细胞间转移。22,23,24,49,50在特异性转导中，少数宿主基因会与前噬菌体DNA一起被包装进噬菌体衣壳内49,50例如，φBB-...

螺旋体细菌遗传操作工具的开发 Borrelia burgdorferi 极大地增进了对莱姆病本质的理解1,2,3,4. B. burgdorferi 具有一个异常复杂的基因组，由一条小型线性染色体以及线性和环状质粒组成5,6自发性质粒丢失、基因内重排（同一生物体内基因从一个质粒转移到另一个质粒）以及水平基因转移（HGT，DNA在两个生物体之间的转移）导致了不同生物之间极为复杂的遗传异质性 B. burgdorferi （例如，参见 Schutzer 等人）7）。所得基因型（或 &#34;菌株&#34;属于同一物种，但其遗传差异影响了它们向不同哺乳动物宿主传播和感染的能力8,9,10,11在本报告中，术语 &#34;菌株&#34; 将用于指代 B. burgdorferi 具有特定的天然遗传背景；该术语 &#34;克隆&#34; 将用于指代为特定目的或因实验操作而经过基因改造的菌株。
可用于的分子工具箱 B. burgdorferi 包括可选择标记、基因报告系统、穿梭载体、转座子诱变、诱导型启动子以及反向选择标记（综述见 Drektrah 和 Samuels）12）。有效运用这些方法需要将异源（外源）DNA人工导入目标细胞 B. burgdorferi 目标菌株。在 B. burgdorferi，异源DNA的导入几乎完全通过 通过 电穿孔，一种利用电脉冲使细菌膜短暂通透，从而允许引入培养基中的小片段DNA进入的方法1绝大多数细胞（估计≥99.5%）被电脉冲杀死，但存活的细胞中保留外源DNA的频率较高13尽管电穿孔法被认为是将DNA导入细菌的最高效方法之一，但其转入频率仍受多种因素影响。 B. burgdorferi 非常低（每 5 × 10 中仅有 1 个转化子）4 至 5 × 106 细胞13转化频率提高所面临的障碍似乎既有技术层面的，也有生物学层面的。成功进行电穿孔的技术障碍包括 B. burgdorferi 包括DNA的量（&#62;10 μg）是必需的，且螺旋体必须处于确切的生长阶段（对数中期，介于 2 × 107 细胞·mL⁻¹−1 和 7 × 107 细胞·mL−1制备电转感受态细胞时12,13然而，这些技术障碍可能比生物屏障更容易克服。
莱姆病研究人员意识到 B. burgdorferi 根据其遗传操作能力，克隆可分为两大类13,14高传代实验室适应株通常易于转化，但往往已丢失对感染性至关重要的质粒，生理行为异常，无法感染哺乳动物宿主或在蜱媒介中持续存在12,13尽管这些克隆株在实验室中对研究螺旋体的分子生物学具有重要作用，但在研究螺旋体在自然疫源循环中的生物学背景时价值有限。相比之下，低传代的感染性分离株能够表现出反映感染状态的生理特性，并可完成整个感染循环，但通常难以导入外源DNA，因此在研究中不易进行遗传操作。12,13低传代分离株转化困难与至少两个不同因素有关：（i）低传代分离株通常紧密聚集，尤其在电穿孔所需的高密度条件下更为明显，从而阻碍了大量细胞充分接触电脉冲或接触到培养基中的DNA13,15；以及（ii） B. burgdorferi 编码至少两种不同的质粒携带的限制-修饰（R-M）系统，这些系统可能在高传代分离株中丢失14,16限制-修饰系统（R-M系统）已进化出使细菌能够识别并清除外源DNA的功能17确实，已有几项研究在 B. burgdorferi 已证明，当DNA来源为 B. burgdorferi 而不是 大肠杆菌13,16遗憾的是，从电穿孔所需的高浓度DNA中获取足够量存在困难 B. burgdorferi 是一种昂贵且耗时的过程。在进行电穿孔并筛选低传代分离株时，另一个潜在问题是该过程似乎更倾向于获得已丢失关键毒力相关质粒 lp25 的转化子14,18,19因此，对低传代进行基因操作这一行为本身 B. burgdorferi 分离株 通过 电穿孔可能会筛选出不适合在自然疫源循环中进行生物学相关分析的克隆20鉴于这些问题，亟需建立一种可将异源DNA电转化至高传代 B. burgdorferi 通过电穿孔以外的方法将克隆导入低传代感染性分离株，将为伯氏疏螺旋体这一莱姆病病原体日益丰富的分子工具库增添有力工具。
除了转化（吸收裸露DNA）外，细菌摄取异源DNA还有另外两种机制：接合，即处于直接物理接触的细菌之间的DNA交换；以及转导，即由噬菌体介导的DNA交换。21事实上，利用噬菌体介导水平基因转移的能力已被作为一种实验工具，用于解析多种细菌系统中的分子过程。22,23,24. B. burgdorferi 不能天然摄取裸露DNA，且几乎没有证据表明 B. burgdorferi 编码促进成功接合所必需的装置。然而，先前已有报道描述了φBB-1的鉴定及其初步表征，该噬菌体是一种温和型芽孢杆菌噬菌体。 B. burgdorferi25,26,27,28φBB-1 包装了一类存在于其内的 30 kb 质粒家族 B. burgdorferi25；该家族成员已被命名为cp32s. 与φBB-1在介导种间水平基因转移中的作用一致 B. burgdorferi 菌株，Stevenson 等报道在两株其他 cp32 序列差异较大的菌株中发现了一致的 cp32，提示该 cp32 近期在这两株菌之间发生了共享，很可能 通过 转导29也有证据表明存在显著的重组现象 通过 cp32间在 otherwise 相对稳定的基因组中的水平基因转移30,31,32,33最后，此前已证明φBB-1能够在同一种菌株的细胞之间以及两种不同菌株的细胞之间转导cp32s和异源穿梭载体DNA。27,28鉴于这些发现，φBB-1 被提议作为研究分子生物学机制的另一种工具 B. burgdorferi
本报告旨在详细阐述一种从 B. burgdorferi 诱导并纯化噬菌体 φBB-1 的方法，同时提供在 B. burgdorferi 克隆之间进行转导实验的操作方案，以及潜在转导子的筛选与鉴定方法。

<table><tbody><tr><td>1 L 滤器单元（PES，0.22 &amp;micro;m 孔径）</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>12 mm × 75 mm 管（双位置盖，聚丙烯）</td><td>USA Scientific</td><td>1450-0810</td><td>可容纳 4 mL，死体积低（用于诱导）</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管（聚丙烯）</td><td>USA Scientific</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>1-甲基-3-亚硝基-硝基胍（MNNG）</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>注意：潜在致癌物；目前不易获得，未测试替代品</td></tr><tr><td>5.75&quot; 帕斯特移液管（棉塞、硼硅酸盐玻璃、非无菌）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管（聚丙烯）</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低电渗琼脂糖（Agarose LE）</td><td>Dot Scientific inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨（Bacto Neopeptone）</td><td>Gibco</td><td>DF0119-17-9</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物（Bacto TC Yeastolate）</td><td>Gibco</td><td>255772</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（血清替代级）</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>700-104P</td><td></td></tr><tr><td>氯仿（分子生物学用）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>注意：挥发性有机物；仅可在化学通风橱中使用</td></tr><tr><td>CMRL-1066 培养基（不含 L-谷氨酰胺，粉末）</td><td>US Biological</td><td>C5900-01</td><td>细胞培养级</td></tr><tr><td>红霉素</td><td>Research Products International Corp</td><td>E57000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素试剂溶液</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（无水右旋糖）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS 滤器（0.22 &amp;micro;m 孔径）</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGSM33SS</td><td>用于抗生素及其他小体积溶液的过滤除菌</td></tr><tr><td>丝裂霉素 C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25312</td><td>注意：潜在致癌物；仅可在化学通风橱中使用</td></tr><tr><td>N-乙酰-D-葡萄糖胺</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>100068</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸（PCR 引物）</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OmniPrep 基因组总提取试剂盒</td><td>G Biosciences</td><td>786-136</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 mm &amp;times; 15 mm）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser 计数室</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-3900</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser 计数室盖玻片</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-5051</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 8000（PEG）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>非无菌微量溶血兔血清（NRS）</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31119-3</td><td>按制造商说明进行热灭活</td></tr><tr><td>半微量紫外透明比色皿</td><td>USA Scientific</td><td>9750-9150</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素溶液</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1804-500G</td><td>用于 BSK 培养基的柠檬酸钠</td></tr></tbody></table>

噬菌体介导的莱姆病螺旋体 borrelia burgdorferi 遗传操作

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

将外源DNA导入螺旋体Borrelia burgdorferi几乎完全依赖于通过电穿孔进行的转化。与其它特征更明确的革兰氏阴性细菌相比，该过程在莱姆病螺旋体中的效率显著较低。 转化成功率在很大程度上取决于能否获得来自特定背景的高质量、高浓度DNA，并且存在明显的菌株间差异。开发将外源DNA（例如穿梭载体、荧光报告基因和抗生素抗性标记）导入B. burgdorferi的替代方法，可能为莱姆病螺旋体遗传操作工具箱的重要补充。噬菌体已被广泛认可为在细菌间转移DNA的天然机制，这一过程称为转导。本研究建立了一种利用普遍存在的伯氏螺旋体噬菌体φBB-1在相同或不同遗传背景的B. burgdorferi细胞之间进行DNA转导的方法。所转导的DNA包括伯氏螺旋体自身的DNA以及以小型穿梭载体形式存在的异源DNA。该结果表明，噬菌体介导的转导有望作为电穿孔之外的补充手段，用于莱姆病螺旋体的遗传操作。本文报道了从B. burgdorferi中诱导和纯化噬菌体φBB-1的方法、该噬菌体在转导实验中的应用，以及潜在转导子的筛选与鉴定方法。

利用噬菌体在更易转化的 B. burgdorferi 菌株或难以进行电转化的克隆之间转移 DNA，是持续研究莱姆病决定因子的另一种工具。本文所述的转导实验可根据需要进行调整，以使用一种或两种抗生素筛选潜在转导子，从而促进任意目标克隆之间的 DNA 转移。此前已有研究证明，可在高传代菌株 CA-11.2A 克隆与高传代菌株 B31 克隆以及毒力较强的低传代菌株 297 克隆之间，转导前噬菌体 DNA 和异源的 E. coli/B. burgdorferi 穿梭载体28。下文结果展示了在两个高传代、无毒力的克隆之间前噬菌体 DNA 的转移。供体克隆 c1673 是 B. burgdorferi 菌株 CA-11.2A 的一个克隆，其前噬菌体 DNA 上携带卡那霉素抗性基因27,28；受体为 B. burgdorferi 菌株 B31 的克隆 c1706，其染色体上带有庆大霉素抗性标记<su...

噬菌体在细菌细胞间转移DNA的能力使其成为对其宿主细菌进行遗传操作的有效工具。本文介绍了一种诱导、回收和使用φBB-1噬菌体的方法，该噬菌体是 Borrelia burgdorferi，用于在莱姆病螺旋体的不同菌株之间转导异源DNA。

噬菌体介导的莱姆病螺旋体 Borrelia burgdorferi 遗传操作

将外源DNA导入螺旋体伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）几乎完全通过电穿孔转化法实现。这种……

本方案具有重要意义，因为它描述了另一种用于解析莱姆病病原体伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）分子生物学的重要工具。该技术的主要优势在于，通过使用噬菌体转导，提供了一种无需电穿孔中电脉冲处理即可将DNA导入伯氏疏螺旋体的替代方法。该方法可用于进一步揭示伯氏疏螺旋体在其自然疫源循环中持续存在并最终导致人类莱姆病的分子机制。首先，将150微升适当浓度的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）克隆接种于15毫升BSK培养基中，使用带紧密盖子的无菌锥形离心管进行转导实验。然后，在培养基中添加适当浓度的抗生素或多种抗生素组合，用于在伯氏疏螺旋体克隆中筛选并维持外源DNA，并将样品在33摄氏度下培养。待培养物生长至适当浓度后，取适量培养液在6,000 G条件下离心10分钟。倒出上清液后，将沉淀物重悬于4 mL新鲜BSK培养基中，并将样品转移至可容纳样品且顶部空间最小的最小无菌管中。随后，根据4 mL培养体积，加入适量诱导剂至推荐浓度，以诱导噬菌体产生，盖紧管盖并充分混匀。将样品在33°C下孵育2至4小时。然后，将样品转移至15毫升离心管中。以6,000 G离心10分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于15毫升BSK培养基中。将制备好的培养物补充文中所述的适当浓度的抗生素，并在33摄氏度下孵育样品72至96小时。为制备PEG沉淀所需的溶液，按照文中所述配制500毫升5摩尔氯化钠溶液、500毫升40% PEG溶液以及100毫升悬浮培养基。为实现灭菌，需对溶液进行高压蒸汽灭菌，使用前冷却，并于室温或4摄氏度保存。对于从供体伯氏疏螺旋体克隆中进行噬菌体的聚乙二醇沉淀，在培养72至96小时后，于4摄氏度下以8,000 G离心20分钟。将上清液倾入干净的50毫升锥形管中，并弃去细胞沉淀。加入五摩尔氯化钠，使其终浓度为一摩尔。充分混匀后，在室温下轻轻摇动一小时。在4摄氏度条件下，以8,000 G离心10分钟。按照之前的方法，将上清液倾入干净的50毫升锥形管中，然后向上清液中加入40% PEG-8000溶液，使其终浓度为10%。充分混匀后置于冰上，静置超过一小时，可长达过夜。以8,000 G在4°C条件下离心样品20分钟，操作如前所述。弃去上清液，并尽可能去除多余的液体，但不得丢失含有噬菌体颗粒的沉淀。用少量悬浮液重悬沉淀，并用悬浮液冲洗瓶壁，以收集可能存在的噬菌体颗粒。根据重悬体积，向回收的噬菌体样品中加入等体积的氯仿。充分混匀样品后，在8,000 G条件下离心10分钟。随后，将水相转移至洁净的离心管中，注意避免触及较厚的界面层。确定第一次氯仿处理后回收的体积，再次用等于该体积10%的氯仿处理样品。转移水相至洁净的离心管中，注意避免混入任何界面或有机相。立即使用噬菌体，或将其储存在4°C条件下。在制备用于转导实验的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）培养物作为受体后，如前所述，将培养物体积在 6,000 G 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 14.5 毫升新鲜 BSK 培养基中。向受体克隆的培养物中加入不超过 500 微升的聚乙二醇（PEG）沉淀的噬菌体样品。充分混匀后，在33摄氏度下孵育72至96小时。按照文中所述，与经PEG沉淀的噬菌体混合后，通过固相平板法筛选转导子。根据受体克隆的背景情况，在选择性平板上孵育10至21天后，检查菌落在琼脂糖内部的形成情况。使用无菌的5.75英寸硼硅酸盐吸管，挑取至少5至10个在含两种抗生素的平板上生长的菌落，并将其接种到1.5毫升含有适当抗生素的BSK培养基中。对编码卡那霉素和庆大霉素抗性的10个克隆进行基因的PCR扩增。卡那霉素抗性基因可从供体c1673和潜在的转导子中扩增出来，但在受体c1706中无法扩增。同样，庆大霉素抗性基因可从受体菌c1706和潜在的转导子中扩增出来，但无法从供体菌中扩增，表明发生了转导事件。为证明卡那霉素抗性盒是由噬菌体5BB1从供体菌转导至受体菌，利用菌株特异性标记确定了转导子的遗传背景。克隆c1673和CA-112A背景含有特异性扩增子四、五和六，而具有高传代B31背景的c1706则不含这些扩增子。同样，转导子一和二缺失扩增子四、五和六，表明这些克隆具有c1706背景，并从c1673获得了卡那霉素抗性基因。对于噬菌体的PEG沉淀，应谨慎执行所有步骤以最大化噬菌体产量，并在噬菌体使用和储存前，用氯仿充分处理重悬的噬菌体，以尽可能去除PEG和培养基中的污染物。一旦转导实验成功完成且转导子得到验证，这些克隆即可用于回答需要基因改造的伯氏疏螺旋体所涉及的科学问题。该技术的建立有望使研究人员能够对目前通过电穿孔难以导入DNA的伯氏疏螺旋体菌株进行遗传操作。

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免疫学与感染

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