Name: 定量肽对白色念珠菌的抗真菌活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 了解利用光密度测量法定量评估肽类抗真菌药物对白色念珠菌Candida albicans的抑制效果。该方法通过高通量筛选实现快速检测，显著减少实验时间与塑料消耗，为抗真菌药物研发提供可靠技术支持。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院（R03DE029270、T32AI089621B）、美国国家科学基金会（CBET 1511718）、美国教育部（GAANN-P200A180093）以及马里兰大学跨校区种子基金的资助。

已获得马里兰大学帕克分校机构生物安全委员会（IBC）对开展以下工作的批准 C. albicans 在此方案（PN 274）中。 C. albicans 菌株 SC5314（参见 材料表在本研究中使用了）；然而，也可使用其他任何菌株。
1. 缓冲液、无菌水和培养基的制备
<ol>
	<li>制备无菌的 0.1 M 磷酸钠缓冲液（NaPB）26，pH 7.4，并用无菌水稀释至 2 mM 和 1 mM。为本方案的大多数应用，各制备 100 mL 的 2 mM NaPB 和 1 mM NaPB 已完全足够。</li>
	<li>制备无菌液体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD，见材料表）培养基（10 g/L 酵母提取物，20 g/L 葡萄糖，20 g/L 蛋白胨）。为本方案的大多数应用，制备 100 mL YPD 培养基已完全足够。</li>
	<li>制备无菌超纯水。为本方案的大多数应用，制备 100 mL 水已完全足够。 
	​注意：缓冲液、培养基和水通过高压灭菌器在 121 °C 液体循环条件下，根据容器中液体体积进行适当时间的灭菌27。例如，对于含有 500 mL 液体的瓶子，灭菌时间应为 40 分钟。</li>
</ol>
2. 接种、培养与传代培养 C. albicans
警告：操作白色念珠菌（C. albicans）时，须遵守所有机构和政府的相关规定。学术研究机构通常将白色念珠菌归类为生物安全等级（BSL）2级微生物，无论其耐药性如何；而美国典型培养物保藏中心（ATCC）则根据菌株的耐药性将其归类为BSL1或BSL2级微生物28。
注意：接种和培养步骤（步骤 2.1–2.2）应在开始抗真菌活性检测的前一天进行。如有可能，所有涉及细胞的操作步骤（以及将与细胞共同孵育的溶液）均应在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>将所需的 C. albicans 菌株接种至装有 10 mL YPD 培养基的培养管中。 
	注意：培养物可来自冻存菌种或琼脂平板，但所有需相互比较的数据必须使用一致的接种来源。</li>
	<li>在 30 °C、230 rpm 条件下，于摇床中培养过夜（约 12–16 小时）。</li>
	<li>将过夜培养的 C. albicans 培养物进行传代培养，并生长至 OD600 约为 1.0–1.2。
	<ol>
		<li>使用紫外分光光度计（见材料表）测定过夜培养物的 OD600。</li>
		<li>根据过夜培养物的 OD600 值，将其接种至 10 mL YPD 培养基中，使传代培养物的初始 OD600 为 0.1。</li>
		<li>在 30 °C、230 rpm 条件下于摇床中继续培养传代培养物，直至 OD600 达到约 1.0–1.2，此过程通常需要 4–6 小时。在传代培养物生长期间，同步完成步骤 3（肽溶液的制备）；在步骤 4 中，该传代培养物将被稀释后用于检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在96孔板中制备肽溶液
注意：如果肽段储备液在储存期间稳定，此步骤可预先进行。通常将肽段溶液保存在 −20 °C 直至使用。进行下一步操作前，可在室温水浴中解冻。
<ol>
	<li>确定每种待测肽在实验中的最高浓度。该浓度取决于所选肽的种类。在代表性结果部分展示的数据中，测试了组蛋白5及其工程化类似物22，所用最高浓度为 50 µM。 
	注意：最高测试浓度应根据文献报道的数据或通过在较宽肽浓度范围内进行预实验来确定。在条件允许的情况下，应选择足够高的浓度，以确保在最高浓度下观察到活力完全抑制的平台期，同时在最低浓度下观察到无活力抑制的平台期，从而能够量化肽活性的完整范围。</li>
	<li>将每种肽溶于无菌水中，配制成目标最高浓度的两倍浓度溶液。在代表性结果部分展示的数据中，配制了 150 µL 浓度为 100 µM 的组蛋白5及其工程化类似物的无菌水溶液。 
	注意：如果某肽在水中不溶解，则可能需要在本步骤前使用其他溶剂助溶。二甲基亚砜（DMSO）常用于高浓度溶解肽，之后再稀释至工作浓度。需确保DMSO的终浓度不超过1%（v/v）29，并确认所用替代溶剂不会影响细胞生长。此外，在步骤3.4–3.5中，所有孔中的溶剂浓度应保持一致。</li>
	<li>取40 µL所需肽的储备液，加入96孔圆底培养板的每行第一孔（第1列）中（参见材料表）。此板为第1板（图1）。 
	注意：每块板包含八行，用于肽的测试。这些行可用于测试不同肽或同一肽的重复样本。每行仅加入一种肽。</li>
	<li>向含有肽的各行列2至列12中各加入20 µL无菌超纯水（图1）。 
	注意：如果在步骤3.2中肽储备液使用了非纯水的溶剂，则本步骤中的无菌水应替换为与肽储备液中相同的溶剂。例如，若肽用DMSO溶解且肽储备液中含有1%（v/v）DMSO的水溶液，则应在第2至第12列中加入含1% DMSO的水溶液。</li>
	<li>在板上将肽储备液进行连续稀释至第10列（图1）。 
	注意：除按以下方法在板内直接进行连续稀释外，也可先在微量离心管中完成稀释，再转移至96孔板。
	<ol>
		<li>从第1列中移取20 µL溶液，转移至第2列，并通过反复吹吸混匀。此时第2列含有40 µL肽溶液，其浓度为第1列浓度的1:2稀释。</li>
		<li>从第2列中移取20 µL溶液，转移至第3列，并通过反复吹吸混匀，使第3列含有40 µL肽溶液，其浓度为第1列浓度的1:4稀释。</li>
		<li>重复此过程，直至第10列含有40 µL肽溶液，其浓度为第1列浓度的1:512稀释。</li>
		<li>从第10列中移除20 µL肽溶液并弃去。此时每列均含有20 µL肽溶液（第1–10列）或水（第11和第12列）。 
		​注意：第11列的孔作为无菌对照，第12列的孔作为不含肽的对照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 稀释 C. albicans 传代培养
注意：在继代培养物的 OD600 达到约 1.0–1.2 后（步骤 2.3.3），开始此步骤。
<ol>
	<li>将转接培养物转移至15 mL离心管中，在室温下以3,900 × g 离心3分钟，使细胞沉淀。用移液器吸除或倾倒上清液。</li>
	<li>用1 mL 2 mM NaPB（步骤1.1）重悬沉淀，并将悬液转移至1.7 mL离心管中。</li>
	<li>离心收集细胞（同步骤4.1），弃去上清液，再用1 mL 2 mM NaPB重悬沉淀。</li>
	<li>重复步骤4.3两次，最终使洗涤后的细胞悬浮于1 mL 2 mM NaPB中。</li>
	<li>测定洗涤后菌悬液的细胞密度，并计算所需稀释倍数，以获得5 × 105 个细胞/mL的细胞浓度。该浓度最终可确保向96孔板的每孔加入1 × 104 个细胞。 
	注意：可通过多种方法测定菌悬液的细胞密度，包括血细胞计数板或自动细胞计数仪。本研究采用目标菌株在相关培养条件下生长时的细胞密度与OD600的标准曲线。该标准曲线通过血细胞计数板（见材料表）测定不同OD600值菌悬液的细胞密度而建立。</li>
	<li>用2 mM NaPB将菌悬液稀释至5 × 105 个细胞/mL。制备10 mL该稀释菌悬液足以完成本研究。</li>
</ol>
5. 孵育 C. albicans 用肽溶液处理细胞并制备细胞以进行活力定量
<ol>
	<li>将稀释后的白色念珠菌（C. albicans）悬液（步骤 4.6）20 µL 加入每行的第 1–10 列和第 12 列（图 1）。 
	注意：此时第一列中的多肽终浓度为多肽储备液浓度的一半。在本研究中，此处的多肽终浓度为 50 µM。每个孔中的细胞悬液终浓度为 2.5 × 105 个细胞/mL。第 1–10 列作为实验孔，用于评估不同多肽浓度下的抗真菌活性，第 12 列作为无多肽的生长对照孔。</li>
	<li>向第 11 列加入 20 µL 的 2 mM NaPB。此时所有孔中的 NaPB 终浓度均为 1 mM。第 11 列作为无菌对照孔。</li>
	<li>盖好 1 号板（含细胞和多肽），在 30 °C 下孵育 30 分钟。 
	注意：对于许多多肽而言，30 分钟的孵育时间已足够17,21,22,30，但若需考虑某些多肽发挥抗真菌活性所需时间较长，可将孵育时间延长至 60 分钟25,31,32。</li>
	<li>准备一个新的 96 孔培养板（2 号板），用于检测细胞活力（图 2）。 
	注意：应在 1 号板孵育过程中准备该培养板。
	<ol>
		<li>向该板的所有孔中加入 100 µL YPD（步骤 1.2）。</li>
		<li>向该板的所有孔中加入 100 µL 2 mM NaPB（步骤 1.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>稀释 1 号板（含细胞和多肽）中的样品，并转移至 2 号板（含培养基和缓冲液）。
	<ol>
		<li>在 30 分钟孵育结束后，从孵育箱中取出 1 号板。</li>
		<li>通过向 1 号板的每个孔中加入 280 µL 1 mM NaPB（步骤 1.1），使每孔总体积达到 320 µL（图 2）。</li>
		<li>使用移液器反复吹打所有含细胞和多肽的孔，充分混匀，确保所有细胞重新悬浮，且孔底无可见沉淀细胞。</li>
		<li>从 1 号板的每个孔中转移 8 µL 至 2 号板的对应孔中。此体积可将每个 1 号板孔中的约 250 个细胞转移至 2 号板（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖好 2 号板，并在微孔板摇床（见材料表）上以 350 rpm 的速度于 30 °C 振荡孵育 17 小时。</li>
</ol>
<img alt="多肽稀释实验；培养板示意图；步骤：加入多肽、水稀释、加入细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64416/64416fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：制备第1号培养板用于多肽系列稀释与细胞共孵育。 多肽用水进行系列稀释，并将 C. albicans 细胞加入第1号培养板。蓝色表示孔中含有多肽，灰色表示孔中只有水而无多肽。含有细胞的孔以黑色圆点图案标示。完成上述步骤后，将培养板进行孵育，以使多肽发挥其抗真菌活性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64416/64416fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微生物生长测定示意图；涉及逐步稀释和平板转移过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64416/64416fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：制备平板 2 以量化肽对细胞活力的抑制作用。 向平板 2 中加入 YPD 培养基和 NaPB 缓冲液。将平板 1 中各孔内容物进行稀释后，取等分试样从平板 1 转移至平板 2。随后孵育平板 2，使存活细胞生长，以便通过测定 OD600 进行定量分析。在平板 2 中，仅含 YPD 和 NaPB 的孔以橙色表示；含有来自平板 1 的等分试样与 YPD 和 NaPB 混合物的孔以绿色表示。有关平板 1 上颜色的说明，请参见 图 1 图注。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64416/64416fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 抗真菌活性的测定
<ol>
	<li>获取 OD600 平板2中每个孔的读数。
	<ol>
		<li>孵育17小时后，从培养箱中取出2号培养板。</li>
		<li>用移液器反复吹打第2块板中的所有孔，确保所有细胞重悬，孔底无可见的沉淀细胞。 
		注意：此步骤中应避免产生气泡，因为气泡可能干扰 OD 测量600 读数。如果产生气泡，通常可用干燥的移液器吸头戳破，或使用两个移液器吸头将气泡从孔中挑出。</li>
		<li>使用吸光度酶标仪（参见 材料清单在600 nm波长下测定OD值600 每个孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算生长抑制率（以百分比表示），并绘制图表以确定多肽对细胞生长的影响 白色念珠菌.
	<ol>
		<li>对于每个孔，使用以下公式计算与对照组相比的存活率降低百分比17,22,23: 
		<img alt="细胞活力降低率公式：多肽对细胞活力影响的数学表达式" src="/files/ftp_upload/64416/64416eq1.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
		在哪里 光密度使用肽 是OD600 给定浓度肽溶液孔中的 OD背景 是OD600 同一行第11列（不含细胞的对照）的 
		OD无肽 是OD600 同一行中第12列的值（对照组，含细胞但不含肽）</li>
		<li>例如，使用以下表达式计算B5孔从OD值反映的活力降低程度600 B行的数值： 
		<img alt="静态平衡公式，存活率降低百分比的计算，以方程形式表示。" src="/files/ftp_upload/64416/64416eq2.png" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>将活力降低程度绘制成肽浓度的函数图。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案描述了一种高效获取抗菌肽（AMPs）对真菌病原体C. albicans抗真菌活性定量数据的方法。测试肽类及其他抗真菌试剂的一种常见替代方法是采用美国临床实验室标准协会（CLSI）标准M2718中所述的肉汤微量稀释法，但该标准侧重于获得定性的视觉结果，而非定量结果。另一种替代方法是使用与本方案类似的方法制备肽类，将其与细胞共孵育，然后将孔内内容物涂布于琼脂平板上，通过计数菌落形成单位（CFU）来量化肽类的作用效果。如代表性结果部分所述，本方案中采用OD600测定细胞生长，相比涂布平板并计数CFU的方法显著减少了实验耗时。此外，无需将孔内液体涂布于琼脂平板，也减少了肽类活性检测过程中产生的塑料废弃物量。
该方案的成功依赖于多个关键因素。由于许多阳离子抗菌肽在生理盐浓度条件下进行测定时活性较差， 体外8,32,<sup class="xre...

Candida albicans 是人类微生物群的一员，可定植于多个部位，包括口腔、皮肤、胃肠道和阴道1。对于因人类免疫缺陷病毒（HIV）等疾病或免疫抑制治疗而导致免疫功能受损的患者，C. albicans 的定植可能引发局部或全身性念珠菌病2,3。目前可用的小分子抗真菌药物（如两性霉素B、唑类或棘白菌素类）在使用中可能因溶解度、毒性问题以及病原体对药物产生耐药性而受到限制4,5。由于现有抗真菌药物存在局限性，研究人员正不断寻找能够有效对抗 C. albicans 的新型抗真菌分子。
抗菌肽（AMPs）是现有小分子抗真菌药物的一种潜在替代方案6,7,8 并且据推测，与小分子药物相比，其产生耐药性的可能性较低9AMPs 是一类多样化的多肽，通常带有正电荷，具有广谱的活性10,11,12具有抗活性的AMPs C. albicans 包括组蛋白家族和天蚕素家族中的知名肽类13,14,15，以及最近报道的肽类，如 ToAP2、NDBP-5.7 和组蛋白 5 变体 K11R-K17R16,17. 由于其在治疗方面的潜力 假丝酵母 感染，识别并设计靶向的新型抗菌肽（AMPs） 白色念珠菌 是许多研究团队的重要目标。
作为开发靶向 C. albicans 的有效抗菌肽（AMPs）及其他抗真菌剂过程的一部分，通常采用体外（in vitro）测试来鉴定具有潜力的肽类。测试抗 C. albicans 活性的方法通常包括在96孔板中将细胞与AMPs（溶于缓冲液或培养基中）的系列稀释液共同孵育。孵育后有多种方法可用于评估抗真菌活性。美国临床实验室标准协会（Clinical Laboratory Standards Institute）描述的一种技术通过肉眼观察孔内浊度，确定完全抑制生长所需的最低浓度（MIC）（对于某些特定抗真菌药物如唑类和棘白菌素类，则以至少50%抑制率为标准），但该方法无法对低于MIC浓度下的生长情况进行定量18。另一种常用方法是在与AMPs孵育后，将各孔内容物接种至琼脂平板，经孵育后计数平板上的菌落形成单位（CFUs）以量化细胞活性。该方法已被用于评估多种肽的活性，包括组蛋白5（histatin 5）衍生肽、LL-37和人乳铁蛋白19,20,21。然而，该技术需要大量琼脂和较多平板，且需耗时耗力地人工计数CFUs。为了在减少塑料废弃物并避免CFU计数的同时获得更定量的结果，可将各孔内容物接种至另一块96孔板中的新鲜培养基中。在对新接种的孔板进行孵育后，可通过吸光度酶标仪测定600 nm处的光密度（OD600）来定量生长情况。该方法已被用于测定组蛋白5及其降解片段、穿膜肽等的抗真菌活性17,22,23,24,25。
本方案描述了如何检测肽类的抗真菌活性，并采用OD600法对肽作用后白色念珠菌（C. albicans）活力的降低程度进行定量分析。

<table><tbody><tr><td>96孔板（圆底）</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>吸光度微孔板读数仪</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>任何可用的微孔板读板仪均可满足要求</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. albicans &lt;/em&gt;菌株 SC5314</td><td>ATCC&amp;nbsp;</td><td>MYA-2876</td><td>其他 &lt;em&gt;C. albicans&lt;/em&gt; 也可用于</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>可用于制作细胞数量与OD之间的标准曲线&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td>VWR</td><td>2620-926</td><td></td></tr><tr><td>肽（多肽）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>多肽可由任何可靠的供应商进行商业合成；纯度应达到 &amp;ge;建议进行95%的三氟乙酸盐去除并转化为盐酸盐</td></tr><tr><td>多通道移液器用试剂储液槽</td><td>VWR</td><td>18900-320</td><td>使用多通道移液器简化向多孔板中的移液操作</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td>用于制备 NaPB</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500</td><td>用于配制 NaPB</td></tr><tr><td>紫外分光光度计</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>任何可用的紫外分光光度计均可满足要求</td></tr><tr><td>YPD 培养基粉末</td><td>BD生命科学</td><td>242820</td><td>也可由酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖制成</td></tr></tbody></table>

量化肽类物质对真菌的抗真菌活性 白色念珠菌

Quantifying the Antifungal Activity of Peptides Against Candida albicans

传统的白色念珠菌（Candida albicans）抗真菌药物敏感性检测方法耗时较长，且缺乏定量结果。例如，一种常用方法是将经不同浓度抗真菌分子处理的细胞接种于琼脂平板上，随后通过计数菌落来确定分子浓度与生长抑制之间的关系。该方法需要使用大量平板，并耗费大量时间进行菌落计数。另一种常用方法则省去平板培养和菌落计数步骤，通过肉眼观察经抗真菌试剂处理的培养物，以确定抑制生长所需的最低浓度；然而，这种方法仅能提供定性结果，且会丢失亚抑制浓度下的生长信息。本实验方案描述了一种用于测定白色念珠菌（C. albicans）对抗真菌肽敏感性的方法。该方法基于培养物的光密度测定，可减少获得不同肽浓度下定量生长数据所需的时间和材料。真菌与肽的孵育在96孔板中进行，使用适当的缓冲液，并设置无生长抑制和完全生长抑制的对照组。肽处理孵育后，将所得的细胞悬液稀释以降低肽的活性，随后过夜培养。过夜培养后，测定每孔的光密度，并与阳性和阴性对照比较，以计算各肽浓度下的生长抑制率。本检测方法所得结果与传统的琼脂平板培养法结果相当，但本方案减少了塑料废弃物的产生以及菌落计数所耗费的时间。尽管本方案的应用目前主要集中于抗真菌肽，但该方法同样适用于测试其他已知或疑似具有抗真菌活性的分子。

使用OD600测量值来量化抗真菌肽对真菌生长抑制的程度，相比接种样品并计数菌落形成单位（CFU），可显著节省时间。本方案所述方法需在三个不同日期完成相应步骤。第一天约需1小时准备缓冲液和培养基（不包括灭菌时间），并接种白色念珠菌（C. albicans）起始培养物，进行过夜培养。第二天需5至6小时（包括传代培养时间），用于制备96孔板，并进行17小时的培养。第三天的步骤可在1小时内完成。涉及收集细胞活力定量数据的部分仅需约30分钟操作时间（另加17小时培养时间）。相比之下，将每个96孔板内容物的单个重复样品涂布于琼脂平板并计数CFU，需耗时超过3小时（另加24小时培养时间），因此本方案在完成活力定量方面可节省超过2.5小时。若实验中需要使用多个96孔板，该方法的时间优势将更加显著。
本实验方案用于检测组蛋白5及其若干赖氨酸残基修饰变体的抗真菌活性。在第5步将多肽与C. albicans细胞孵育后，采用菌落形成单位（CFU）计数法和本方案所述结合OD600测定的方法对抗真菌活性进行定量分析（<strong...

本方案描述了一种获取肽类及其他化合物（如小分子抗真菌剂）对白色念珠菌（Candida albicans）抗真菌活性定量数据的方法。该方法采用光密度测定而非菌落形成单位计数来量化生长抑制，节省了时间和资源。

传统的白色念珠菌抗真菌药物敏感性检测方法耗时较长，且缺乏定量结果。例如，一种……

多肽正在被研究作为新型抗真菌分子。本方案可用于研究针对人类真菌病原体白色念珠菌的抗真菌效果。与需要在琼脂上操作的其他方法相比，该技术可提供关于抗真菌活性的定量数据，同时缩短实验时间并减少塑料废弃物。除了检测对白色念珠菌的活性外，本方案还可用于检测对其他酵母形态细胞的活性，以及小分子抗真菌剂的活性。首先将所需白色念珠菌菌株接种至含有10毫升液体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基的培养管中。在30摄氏度、230 rpm条件下，于旋转摇床中培养过夜。将过夜培养的白色念珠菌进行传代培养，并继续培养至在600纳米波长下的光密度值达到约1.0至1.2。将每种肽溶于无菌水，并稀释至所需最高浓度的两倍，然后向96孔圆底培养板每行的第一孔中加入40微升所需肽的储备溶液。接着，在含有肽的各排第2至第12列中加入20微升无菌超纯水。为在培养板上对肽储备溶液进行连续稀释至第10列，需从第1列转移20微升至第2列，并通过反复吹打混匀。重复稀释过程至第10列，其中将含有40微升肽溶液，为第1列浓度的1比512稀释。完成后，从第10列中移除20微升肽溶液并弃去。将白色念珠菌（C.albicans）亚培养物转移至15毫升离心管中，在室温下以3,900 g离心3分钟。用移液管或倾倒法去除上清液。用1毫升2毫摩尔磷酸钠缓冲液重悬沉淀，将悬液转移至1.7毫升离心管中。离心收集细胞沉淀，并弃去上清液。再次将沉淀重悬于1毫升2毫摩尔磷酸钠缓冲液中，再洗涤2次，最终使洗涤后的细胞悬浮于1毫升2毫摩尔磷酸钠缓冲液中。测定洗涤后细胞悬浮液的细胞密度，并用2毫摩尔磷酸钠缓冲液将细胞悬浮液稀释至每毫升5 × 10⁵个细胞。取稀释后的白色念珠菌细胞悬浮液，向每行的第1至第10列以及第12列各加入20微升，然后向第11列加入20微升2毫摩尔磷酸钠缓冲液。盖上盖子1，并将其放入30摄氏度的培养箱中孵育30分钟。准备一个新的96孔培养板，通过向2号板的所有孔中加入100微升YPD，然后向2号板的所有孔中加入100微升2毫摩尔的磷酸钠缓冲液，以测定细胞活力。为稀释1号板中的样品，从培养箱中取出1号板，并向每个孔中加入280微升1毫摩尔的磷酸钠缓冲液。用移液器充分混匀内容物后，从1号板转移8微升至2号板的对应孔中。操作完成后，将盖好的2号板置于微孔板摇床中，在30摄氏度下以350转/分钟振荡17小时。通过上下吹打混匀2号板的所有孔，确保所有细胞重新悬浮。 使用吸光度酶标仪测定2号板中每个孔在600纳米波长处的光密度值。以肽浓度为自变量，绘制细胞活力降低的曲线，计算生长抑制百分比，并确定肽对白色念珠菌（C.albicans）生长的影响。在将肽与白色念珠菌细胞共孵育后，通过菌落形成单位（CFU）计数法以及结合光密度测定的所述实验方案来定量抗真菌活性。利用光密度读数获得的数据具有高度可重复性，这由重复样本较小的标准偏差所表明。在执行本方案时，应将白色念珠菌细胞在30摄氏度下培养，以维持其酵母形态，因为光密度测量在菌丝细胞中不可靠。该方法的高效性使研究人员能够通过测试更多种类的肽段及其浓度，开展大规模的三重重复研究，以评估肽段活性。

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科研

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生物学

定量肽对白色念珠菌的抗真菌活性

我们介绍一种使用96孔微孔板形成Candida...

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活细胞成像技术研究抗真菌植物防御素进入真菌细胞的方式及其亚细胞定位

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微量肉汤稀释法 体外 筛选：一种检测新型抗真菌化合物的简便快速方法

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对数百个C. albicans细胞进行生物原子力显微镜测量的自动化

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测定生物防治产品的挥发性和非挥发性抗真菌活性

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一种基于可溶性四氮唑还原反应的检测方法，用于评估抗体的作用效果 Candida tropicalis 生物膜

评估软体动物粗提物和澄清提取物的潜在抗隐球菌特性

了解利用光密度测量法定量评估肽类抗真菌药物对白色念珠菌Candida albicans的抑制效果。该方法通过高通量筛选实现快速检测，显著减少实验时间与塑料消耗，为抗真菌药物研发提供可靠技术支持。

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