量化肽类物质对真菌的抗真菌活性 白色念珠菌

多肽正在被研究作为新型抗真菌分子。本方案可用于研究针对人类真菌病原体白色念珠菌的抗真菌效果。与需要在琼脂上操作的其他方法相比，该技术可提供关于抗真菌活性的定量数据，同时缩短实验时间并减少塑料废弃物。

除了检测对白色念珠菌的活性外，本方案还可用于检测对其他酵母形态细胞的活性，以及小分子抗真菌剂的活性。首先将所需白色念珠菌菌株接种至含有10毫升液体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基的培养管中。在30摄氏度、230 rpm条件下，于旋转摇床中培养过夜。将过夜培养的白色念珠菌进行传代培养，并继续培养至在600纳米波长下的光密度值达到约1.0至1.2。

将每种肽溶于无菌水，并稀释至所需最高浓度的两倍，然后向96孔圆底培养板每行的第一孔中加入40微升所需肽的储备溶液。接着，在含有肽的各排第2至第12列中加入20微升无菌超纯水。为在培养板上对肽储备溶液进行连续稀释至第10列，需从第1列转移20微升至第2列，并通过反复吹打混匀。

重复稀释过程至第10列，其中将含有40微升肽溶液，为第1列浓度的1比512稀释。完成后，从第10列中移除20微升肽溶液并弃去。将白色念珠菌（C.albicans）亚培养物转移至15毫升离心管中，在室温下以3,900 g离心3分钟。

用移液管或倾倒法去除上清液。用1毫升2毫摩尔磷酸钠缓冲液重悬沉淀，将悬液转移至1.7毫升离心管中。离心收集细胞沉淀，并弃去上清液。

再次将沉淀重悬于1毫升2毫摩尔磷酸钠缓冲液中，再洗涤2次，最终使洗涤后的细胞悬浮于1毫升2毫摩尔磷酸钠缓冲液中。测定洗涤后细胞悬浮液的细胞密度，并用2毫摩尔磷酸钠缓冲液将细胞悬浮液稀释至每毫升5 × 10⁵个细胞。取稀释后的白色念珠菌细胞悬浮液，向每行的第1至第10列以及第12列各加入20微升，然后向第11列加入20微升2毫摩尔磷酸钠缓冲液。

盖上盖子1，并将其放入30摄氏度的培养箱中孵育30分钟。准备一个新的96孔培养板，通过向2号板的所有孔中加入100微升YPD，然后向2号板的所有孔中加入100微升2毫摩尔的磷酸钠缓冲液，以测定细胞活力。为稀释1号板中的样品，从培养箱中取出1号板，并向每个孔中加入280微升1毫摩尔的磷酸钠缓冲液。

用移液器充分混匀内容物后，从1号板转移8微升至2号板的对应孔中。操作完成后，将盖好的2号板置于微孔板摇床中，在30摄氏度下以350转/分钟振荡17小时。通过上下吹打混匀2号板的所有孔，确保所有细胞重新悬浮。

使用吸光度酶标仪测定2号板中每个孔在600纳米波长处的光密度值。以肽浓度为自变量，绘制细胞活力降低的曲线，计算生长抑制百分比，并确定肽对白色念珠菌（C.albicans）生长的影响。在将肽与白色念珠菌细胞共孵育后，通过菌落形成单位（CFU）计数法以及结合光密度测定的所述实验方案来定量抗真菌活性。

利用光密度读数获得的数据具有高度可重复性，这由重复样本较小的标准偏差所表明。在执行本方案时，应将白色念珠菌细胞在30摄氏度下培养，以维持其酵母形态，因为光密度测量在菌丝细胞中不可靠。该方法的高效性使研究人员能够通过测试更多种类的肽段及其浓度，开展大规模的三重重复研究，以评估肽段活性。