一种基于人源酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

这是一种监测R-pass细胞核表型和特征的简单方法。它也经常可以在全基因组研究中恢复，以找到影响R-pass细胞核稳定性的遗传因素。由于这是一种成熟的运动生物，因此与使用人类细胞系或动物模型相比，该技术很容易并且不需要太多时间和精力。

R-pass细胞核的聚集与帕金森病密切相关。可能影响R-pass细胞核稳定性的蛋白质或化学物质可以在这种人源化酵母模型中进行测试。首先，将三个单菌落贴在SD-URA琼脂平板上，以选择含有α-突触核蛋白质粒的细胞。

然后，将每株三个贴片的酵母转化体接种到 3 毫升 SRD-URA 中，用于用 2% 棉子糖选择性生长含有质粒的酵母，以抑制 Gal1 启动子和 0.1% 葡萄糖下 α-突触核蛋白的诱导。将接种的培养物在30摄氏度下以每分钟200转的速度搅拌孵育。第二天，将过夜培养的细胞接种到3毫升新鲜SRD-URA中，直到它们在600纳米处达到0.2的光密度。

然后，将培养物在30摄氏度下以每分钟200转的速度搅拌孵育6小时。使用分光光度计测量600纳米处的光密度。接下来，在96孔板的泳道1中用无菌蒸馏水将样品稀释至600纳米处的光密度为0.5，以平衡每个培养物中的细胞数。

通过向接下来的五个泳道中加入 160 微升无菌蒸馏水，对酵母细胞进行 5 倍连续稀释，并确保在每个泳道中连续稀释细胞时总体积为 40 微升。使用多通道移液器从每个孔转移10微升，以在SD-URA琼脂平板上发现样品以进行对照，并使用SG-URA琼脂平板监测毒性。将斑点板在 30 摄氏度下倒置孵育四天。

每24小时拍摄一次平板图像，直到第四天，然后通过比较肉眼发现的菌株之间的生长差异来分析数据。将每个菌株的三个修补的酵母转化体接种到三毫升 SRD-URA 中，并在 30 摄氏度下以每分钟 200 转的速度孵育过夜。第二天，测量在600纳米下培养过夜的细胞的光密度，并将细胞接种到96孔板中总共200微升新鲜SD-URA和SG-URA中。

将包括细胞在内的最终体积调整为200微升，并将初始细胞光密度在600纳米处调整为0.05。调整微量滴定板中的程序设置。将目标温度设置为30摄氏度，间隔时间为15分钟，振荡持续时间设置为890秒，振荡幅度设置为5毫米，测量为600纳米处的吸光度。

将板孵育2-3天，以使所有菌株在酶标仪中到达固定相。通过绘制增长曲线来分析数据。将修补的酵母转化体接种到 3 毫升 SRD-URA 中，并在 30 摄氏度下以每分钟 200 转的速度搅拌培养过夜。

第二天，将过夜培养的细胞重新接种到3毫升新鲜SRD-URA中，在600纳米处的光密度为0.003，然后在30摄氏度下以每分钟200转的速度搅拌孵育培养物，直到光密度达到0.2。然后加入300微升20%半乳糖，然后在30摄氏度下以每分钟200转的速度搅拌下再孵育6小时。通过以800g离心5分钟收集一毫升细胞培养物，并弃去上清液。

将细胞沉淀轻轻重悬于30微升蒸馏水中。在载玻片上准备琼脂糖凝胶垫。重悬细胞并在载玻片上加载五微升细胞重悬，并使用切割的琼脂糖垫覆盖细胞进行检查。

要使用100倍物镜进行显微成像，请使用屏幕捕获选项使用该程序生成图像，并选择明场以使用浸油使用100倍物镜聚焦细胞。切换到GFP荧光滤光片，并将图像曝光时间调整为50毫秒至300毫秒之间，通过平衡信噪比获得清晰的图像。打开图像文件，通过使用图像分析软件根据细胞中的病灶数量对细胞进行计数来分析数据。

PRS426载体中Gal1启动子下的突触核蛋白表达在含有半乳糖作为诱导剂的琼脂平板上表现出明显的生长迟缓。在液体培养物中也观察到突触核蛋白表达的生长差异。在两种培养条件下，野生型突触核蛋白和具有E46K或A53T突变的变体由于突触核蛋白毒性而显示出生长缺陷。

然而，不形成聚集体的突触核蛋白A30p变体显示出无毒表型。表现出严重细胞毒性的菌株显示出突触核蛋白聚集体的病灶，但在A30p变体中，毒性较小的突触核蛋白形式扩散到整个细胞中。为了获得可重复的结果，重要的是在每个实验中使用处于相同生长阶段的细胞，尤其是在监测突触核蛋白相关表型时。

正如我们在荧光显微镜数据中所显示的，突触核蛋白可以形成更大的聚集体。因此，它可以简单地通过离心分离，也可以通过使用突触核蛋白特异性抗体的蛋白质印迹进行定量。该技术适用于高通量筛选，以发现影响突触核蛋白聚集的新遗传因子和化合物。

因此，我们希望找到新的帕金森病治疗候选药物。