Name: 使用光片荧光显微镜对老化耳蜗进行成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 了解光片荧光显微镜技术对老化耳蜗进行无损三维成像的方法。该技术可定量分析螺旋神经节神经元密度变化，为研究年龄相关性听力损失提供重要的病理学依据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到了美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所、凯洛格基金会以及布丽奇特·斯佩尔和约翰·麦科马克的私人捐赠资助。TSLIM 的开发得到了德国伊尔梅瑙工业大学的马蒂亚斯·希尔恩布兰德、克尔斯汀·约翰、梅克·拉温、米歇尔·莱希尔、托比亚斯·施罗特、彼得·沙赫特、奥利弗·丹贝格和朱利安·韦斯特的大力支持，并在其导师（斯特凡·辛青格和雷内·特什卡）以及詹姆斯·莱格的指导下完成。

所有实验操作及活体动物的使用均已通过明尼苏达大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的审查和批准（方案编号 #2010-38573A），且使用这些动物的研究人员在进入动物设施前，均已接受研究动物资源（RAR）兽医团队的全面培训与考核。本研究中使用了雄性和雌性小鼠。
1. 用于固定及成像用组织处理的耳蜗摘除
<ol>
	<li>使用 CO₂ 处死一只小鼠2 吸入麻醉后，用剪刀将小鼠断头，沿脑部做背腹向切口以分离颅骨。取出脑组织，辨认颅底腹侧圆形的鼓泡结构，用咬骨钳打开鼓泡，观察并取出耳蜗。</li>
	<li>固定：在通风橱内进行此操作，使用解剖显微镜（5倍放大）。佩戴手套和防护服。用尖头镊子刺破卵圆窗并取出镫骨。将镊子插入圆窗以刺破膜。</li>
	<li>用连接有装有2 mL甲醛溶液的1 mL注射器的输液器剪断后的管尖覆盖打开的圆窗。在2分钟内缓慢将甲醛溶液注入耳蜗的外淋巴间隙，注意观察甲醛溶液从耳蜗流出 通过 打开的卵圆窗。修剪耳蜗上多余的组织，将其浸入含有10%甲醛的瓶子中，并置于旋转器上过夜。</li>
	<li>脱钙：将耳蜗用 PBS 溶液冲洗 3 次，每次 5 分钟，随后置于含有 10% 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液的容器中，在旋转条件下孵育 4 天，每天更换溶液。</li>
	<li>脱水：用 PBS 灌注耳蜗 3 次，每次更换之间浸泡 15 分钟。用递增浓度的乙醇（10%、50%、70%、95%、95%、100%、100%）对耳蜗进行脱水，每个浓度处理 30 分钟。 
	&#8203;注意：脱水前必须彻底去除所有EDTA，因为EDTA会在乙醇中沉淀。此外，耳蜗可在浓度高于70%的乙醇中过夜保存。</li>
	<li>染色：将整个耳蜗浸入罗丹明B异硫氰酸盐溶液（5 µg/mL，溶于100%乙醇）中，旋转孵育过夜。用100%乙醇更换两次溶液，每次5分钟，以去除耳蜗中多余的染料。</li>
	<li>透明处理：将染色后的耳蜗转移至两份新鲜的 Spalteholz 试剂中12 溶液（水杨酸甲酯：苯甲酸苄酯 = 5:3），每次更换溶液30分钟，随后在透明溶液中旋转过夜。耳蜗可无限期保存于Spalteholz溶液中。</li>
</ol>
2. 耳蜗成像
<ol>
	<li>将耳蜗的卵圆窗和圆窗膜端固定在样品杆上，以确保透明溶液保留在耳蜗内部且不产生气泡（图2）。必须注意避免耳蜗内部形成气泡，因为气泡难以去除，若残留在组织中将导致成像伪影。</li>
	<li>使用紫外光固化胶将湿润的耳蜗粘附到干燥的样品杆上（图2），粘接位置为卵圆窗和圆窗末端。用紫外光围绕耳蜗照射10秒以固化紫外胶。 
	注意：耳蜗与样品杆连接松动会导致成像缺陷。该样品杆为此实验方案专用（详见 Santi 等8），且专用于我们的光片显微镜。</li>
	<li>将耳蜗悬置于充满 Spalteholz 溶液的成像室中进行成像。样品室为光学透明的石英荧光比色皿（视频1）。</li>
	<li>将样品杆固定于一个可旋转的夹具上，该夹具同时连接至XZ平移台。大多数图像堆栈通过在XZ平面内移动样品获得，但也可获取旋转堆栈图像。</li>
	<li>TSLIM光学切片：根据荧光染料的类型选择使用蓝色或绿色激光进行激发。将光片置于组织中部以进行对焦，并确定用于照亮耳蜗全宽度的放大倍数。然后使用定制程序，使样品沿X轴方向穿过光片（拼接图像），并在Z方向上以步进方式采集一系列2D图像，从而在整个耳蜗范围内生成图像堆栈。</li>
	<li>对于首幅图像，将光片的束腰位置对准样品边缘，程序将扫描样品的全宽度，采集宽度等于共焦参数的数据列（参见图像拼接；Santi 等8）（图3），以生成覆盖样品全宽度、具有最大分辨率的复合2D图像。该程序将自动完成每个Z步进的图像拼接，直至整个样品被完全成像。</li>
	<li>图像处理：将图像堆栈传输至另一台计算机，并导入三维重建软件中进行三维重建与定量分析。</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用光片显微镜进行光学切片以观察耳蜗结构，与传统组织学方法不同，该方法不具机械破坏性，能够提供耳蜗各结构之间关系的完整数字化视图。以往的方法，如柯蒂氏器的表面制备法14，虽可描绘出基底膜全长上毛细胞丢失的分布图，但由于组织已被剥离以暴露柯蒂氏器，无法评估螺旋神经节神经元（SGN）的损失情况。另一种方法——耳蜗的中转微切片，仅能提供罗森塔尔管全长范围内SGN状态的极小部分样本。而使用TSLIM技术，所有耳蜗结构均可在仪器分辨率水平（即亚细胞级）实现数字化。完整的耳蜗图像堆栈使得多种耳蜗结构的定量分析与可视化成为可能，而这些在传统组织学方法中无法实现。例如，本研究通过聚类算法，展示了一种全新的方式来观察和量化罗森塔尔管内SGN细胞密度，并表征因衰老导致的细胞丢失（图12）。
TSLIM 是一种早期8 受Voie及其同事工作的启发，开发了一台光片显微镜4,<sup ...

耳蜗是哺乳动物听觉的外周感觉器官。它具有复杂的螺旋结构，包含重复排列的感觉细胞和支持细胞，这些细胞在解剖结构上特化为能够探测声波振动，并将其传递至大脑以产生听觉感知。主要的感觉元件是内毛细胞和外毛细胞，以及支配它们的神经纤维，这些神经纤维的胞体构成位于罗森塔尔管内的螺旋神经节（图1）。这些感觉和神经结构呈音位式排列，使得高频声音在耳蜗基部被转导，而低频声音则在耳蜗顶部被转导2。沿基底膜螺旋长度分布的感觉细胞的解剖图谱称为细胞耳蜗图3，可与听力损失随频率变化的情况（如听力图所示）进行比较。
耳蜗的膜迷路被致密的骨组织包围，这在技术上使得同时检查多个耳蜗结构变得困难。因此，开发光片显微镜的目的是生成完整耳蜗的整齐连续光学切片，以便在三维重建中相对地观察所有耳蜗结构。Voie 等人4以及 Voie 和 Spelman5设计了第一台光片显微镜，称为正交平面荧光光学切片（OPFOS）显微镜，用于对整个耳蜗进行光学切片。然而，该显微镜从未实现商业化开发；因此，我们的目标是构建一台名为薄片激光成像显微镜（TSLIM；图2）的光片显微镜。TSLIM 的设计与构建细节此前已有发表8。TSLIM 在 OPFOS 的基础上进行了多项改进，包括采用低光照数字相机替代 CCD 相机进行图像采集、使用光学编码的微位移器以实现样本在光片中精确且可重复的移动、采用市售的光学透明样本腔室，以及在乙醇中进行罗丹明染色而非在透明溶液中染色，以防止染料在组织内沉淀。诸如 SPIM6等光片显微镜的商业化发展主要集中在对活体小型透明样本的高分辨率成像，但由于工作距离不足，不适合用于完整耳蜗的成像。Santi7曾发表综述，回顾了其他光片显微镜的发展历程。TSLIM 相较于其他耳蜗组织学方法的主要优势在于，能够在保持样本完整性的前提下进行光学切片并实现三维重建，从而使样本仍可用于其他组织学方法。TSLIM 成像的另一优势在于，仅使用激光产生的薄光片照射组织，而共聚焦显微镜则需将整个组织厚度暴露于激光下。通过组织透明化以减少光散射，且仅有少量组织暴露于激光，使得光片激光成像中的荧光染料褪色（光漂白）程度极小。然而，固定、脱水和透明化过程确实会改变耳蜗结构的形态，并导致组织收缩，与活体组织相比存在差异。实际发生的组织收缩程度尚未确定。
TSLIM 由 Shane Johnson 和八名德国光学工程专业学生开发（参见致谢部分）。TSLIM 的构建细节由 Santi 等人8 提供，扫描式版本（sTSLIM）则由 Schröter 等人9 报道。TSLIM 可作为非破坏性显微切片装置，对样本进行光学切片，同时作为显微镜，获取贯穿耳蜗全长和全厚度的二维连续光学切片。TSLIM 能够对尺寸较小（毫米级）和较大（厘米级）、较厚的样本进行成像。其物镜采用空气介质安装，可在解剖显微镜上使用 1× 和 2× 的长工作距离收集物镜。解剖显微镜还配备变倍光学系统，使 TSLIM 能够分辨细胞内的亚细胞结构和突触结构。TSLIM 配备蓝色（473 nm）和绿色（532 nm）两种激光光源，可支持多种荧光探针用于成像。TSLIM 的目标是获取贯穿整个耳蜗组织、精确对齐的二维光学切片，以实现耳蜗组织的完整数字化重建。由于该方法基于荧光成像，也可结合配体标记和免疫组织化学技术，用于识别特定的耳蜗结构。
最初使用柱面透镜产生两个相对的高斯光片，但会产生吸收成像伪影。由于Keller等人10的工作，固定柱面透镜被扫描振镜取代以生成光片9。此外，由于光片中心在光束腰处最薄，因此sTSLIM的二维图像通过采集贯穿样本宽度的X轴数据列组合而成（图3）。该方法最早由Buytaert和Dircks11描述。用于驱动和采集图像的TSLIM定制软件是使用图形化仪器控制程序开发的。光片穿过样本，照亮组织内的一个荧光平面。该荧光平面通过透明样本正交投影，并由解剖显微镜采集。光学编码的微位移器允许沿X轴扫描光束腰，以采集单幅组合的二维图像；随后，Z轴微位移器将样本移动到组织更深层的平面，以获取一系列连续切片的二维图像堆栈（视频1，图4）。在整个耳蜗的宽度、厚度和长度方向上采集平移图像堆栈，无需进行图像拼接（视频2）。图像堆栈被传输至另一台计算机，并载入三维重建软件进行三维重建与定量分析。这些图像堆栈包含了显微镜分辨率下耳蜗形态的全部数字信息。然而，若需要更高分辨率，完整的耳蜗还可进一步通过破坏性组织学方法处理，例如切片机切片、扫描电镜和透射电镜观察。
使用三维渲染程序对不同耳蜗结构进行分割，以实现三维可视化和定量分析。在分割过程中，通过图形数位板和笔在每张二维图像上用不同颜色勾画出每一结构（图5）。截至目前，已有20种不同的耳蜗结构被成功分割（图6）。完成分割后，可进行多种三维分析。例如，三维渲染软件可沿结构的中心轴线在任意平面对耳蜗进行虚拟切片。视频3展示了与柯蒂氏器相切的切片过程，从而清晰呈现基底膜全长上的毛细胞。该过程首先需要手动分割目标结构，随后根据从结构基部到顶部中心线上设置的样条点的最小二乘法拟合计算其中心轴线，从而估算结构的长度（视频4）。类似的方法称为骨架化（skeletonization），可用于通过颜色图谱可视化结构沿其长度方向的径向宽度（视频4）。程序在分割完成后可自动计算每个结构的总体积，同时也可以在三维渲染软件中利用颜色图谱对相对距离进行量化和可视化（图7）。分割后的结构还可导出，用于制作放大的实体塑料模型（图8）。此外，也可利用三维渲染软件进行半自动化的细胞计数（图9）。通过免疫组织化学染色或配体结合技术可特异性标记特定耳蜗结构，并将这些结构从其他耳蜗组织中分离出来，进行形态计量学评估，例如生成细胞耳蜗图谱（cytocochleogram）（图10）。所有耳蜗结构的长度、宽度、表面积、体积及数量均可从三维模型中测定，使该方法成为将耳蜗损伤与功能障碍进行关联映射的理想工具。具体而言，可通过二维光学切片重建的三维耳蜗模型，直观展示并量化由衰老、噪声性损伤或其他有害因素引起的耳蜗损伤。一旦耳蜗组织完成数字化，便可利用多种图像算法，在解剖学配准的基础上评估耳蜗内任何组织的损伤情况，并与其他耳蜗组织进行对比分析。

<table><tbody><tr><td>Amira 3D 渲染软件</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>地址：501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433</td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯 (W213810)</td><td>Sigma-Aldrich公司&amp;nbsp;</td><td></td><td>地址：邮政信箱 14508，密苏里州圣路易斯，68178</td></tr><tr><td>邦迪克&amp;nbsp;</td><td>邦迪克&amp;nbsp;</td><td></td><td>地址：235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 加拿大</td></tr><tr><td>95% 和 100% 乙醇&amp;nbsp;</td><td>明尼苏达大学</td><td></td><td>地址：明尼苏达州明尼阿波利斯市通用仓库，邮编 55455</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）&amp;nbsp; (E5134)</td><td>Sigma-Aldrich公司&amp;nbsp;</td><td></td><td>地址：邮政信箱 14508，圣路易斯，密苏里州 68178</td></tr><tr><td>LabVIEW 图形化程序与视觉系统</td><td>国家仪器公司</td><td></td><td>地址：11500 N Mopac Expwy，奥斯汀，德克萨斯州 78759-3504</td></tr><tr><td>水杨酸甲酯 (M6742)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>地址：邮政信箱 14508，密苏里州圣路易斯，68178</td></tr><tr><td>奥林巴斯 MVX10 体视显微镜</td><td>奥林巴斯公司</td><td></td><td>地址：3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034</td></tr><tr><td>罗丹明B异硫氰酸酯，(283924)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>地址：邮政信箱 14508，圣路易斯，密苏里州 68178</td></tr><tr><td>斯塔纳荧光计比色皿（3-G-20）</td><td>Starna 细胞</td><td></td><td>地址：邮政信箱 1919，阿塔斯卡德罗，加利福尼亚州 82423</td></tr></tbody></table>

使用光片荧光显微镜成像衰老的耳蜗

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

根据世界卫生组织的数据，耳聋是最常见的感觉功能障碍，影响全球约5%或4.3亿人1。衰老或老年性耳聋是感音神经性听力损失的主要原因，其特征是毛细胞、螺旋神经节神经元（SGNs）以及血管纹的损伤。这些结构位于耳蜗内，而耳蜗具有复杂的螺旋状解剖结构，由悬浮在液体中的膜性组织构成，并被骨性结构包围。这些特性使得耳蜗的组织病理学变化在技术上难以研究和量化。为满足这一需求，我们开发了一种光片显微镜（TSLIM），可对整个耳蜗进行成像和数字化，以促进对内耳结构与功能关系的研究。通过对整个耳蜗进行良好对齐的连续切片，可获得一系列图像，用于三维（3D）体积重建及单个结构的分割，从而实现三维可视化和定量分析（如长度、宽度、表面积、体积和数量）。耳蜗样本仅需经过最少的处理步骤（固定、脱钙、脱水、染色和光学透明化），且所有步骤均兼容后续的扫描电镜和透射电镜高分辨率成像。由于所有组织均保留在图像堆栈中，每个结构均可单独评估，或相对于其他结构进行评估。此外，由于成像使用荧光探针，可结合免疫组织化学和配体结合技术，识别特定结构及其在耳蜗内的三维体积或分布情况。本文中，我们利用TSLIM检测了老年小鼠的耳蜗，以量化毛细胞和螺旋神经节神经元的丢失。此外，还采用高级分析方法（如聚类分析），沿Rosenthal管的三维体积可视化其局部螺旋神经节神经元的减少情况。这些方法展示了TSLIM显微镜在耳蜗内部及不同耳蜗之间量化结构与功能关系的能力。

由于本期特刊的主题是成像耳蜗衰老效应，将以一只年轻的（3月龄，HS2479，CBA品系小鼠）和一只年老的（23月龄，HS2521，C57品系小鼠）耳蜗作为示例。需要注意的是，TSLIM能够成像多种样本，包括来自人类、哺乳动物、其他啮齿类动物和鱼类的耳蜗，以及其他器官如脑组织。
Johnson 等人13曾利用 TSLIM 技术对年轻（3周龄）CBA 小鼠的螺旋神经节神经元（SGN）发表了一篇文章。在五只小鼠中计数了全部 SGN，数量范围为 8,408–8,912 个，平均 Rosenthal 管长度为 2.0 mm。在本研究中，我们计数了一只 3 月龄 CBA 小鼠的 SGN，其 Rosenthal 管长度为 2.0 mm，共含有 7,913 个 SGN。一只 23 月龄的 C57BL6 小鼠则含有 6,521 个 SGN，Rosenthal 管长度为 2.11 mm。体积渲染图像显示了双侧耳蜗中所有的 SGN，但在年长小鼠中并未明显揭示 SGN 的丢失。然而，以 Rosenthal 管距离为函数的 SGN 细胞计数线性图显示，与年长动...

开发了一种光片显微镜，用于对整个耳蜗进行成像和数字化。

耳聋是最常见的感觉功能障碍，据世界卫生组织统计，全球约有5%或4.3亿人受其影响1。衰老或……

我们开发了一种光片显微镜，能够对整个耳蜗进行数字化成像。该显微镜采用空气介质物镜，具有较长的工作距离，可对从小鼠耳蜗到大型人类颞骨的样本进行成像。它利用激光束对耳蜗进行连续切片，且不会造成任何机械性损伤。我们的成像方法可用于评估耳蜗中的病理变化，例如因衰老导致的毛细胞和螺旋神经节神经元的丢失。在处死并断头一只小鼠后，通过脑组织做一条背腹向切口以将颅骨一分为二。移除脑组织，并在颅骨的基底腹侧部分识别出圆形的鼓室。使用咬骨钳打开鼓室。然后观察并移除耳蜗。在解剖显微镜下以五倍放大倍率观察，用锐利的探针刺破卵圆窗并移除镫骨。然后，将探针插入圆窗，刺破膜。进行固定时，用连接在装有2毫升福尔马林的一毫升注射器上的输液装置的剪断尖端覆盖打开的圆窗。在两分钟内缓慢将福尔马林注入耳蜗的外淋巴间隙，确保福尔马林从打开的卵圆窗流出。修剪掉耳蜗上多余的组织。将其浸入含有10%甲醛的瓶子中，并置于旋转器上过夜。进行脱钙时，用PBS冲洗耳蜗三次，每次五分钟。将样品浸入含有10% EDTA溶液的瓶子中。在旋转条件下孵育四天，每天更换一次溶液。随后，用PBS缓冲液灌注耳蜗三次，每次更换之间浸泡15分钟，以彻底清除所有EDTA。洗涤后，用浓度递增的乙醇对耳蜗进行脱水处理，每种浓度处理30分钟。将整个耳蜗浸入罗丹明B溶液中，在旋转条件下过夜染色。用两次更换的100%乙醇去除耳蜗中多余的染料，每次更换后孵育5分钟。将染色后的耳蜗转移至两份Spalteholz透明液中，每次更换溶液，每次浸泡30分钟。随后在透明液中旋转过夜。将耳蜗的卵圆窗和圆窗膜端附着于标本杆上。确保透明溶液保留在耳蜗内，避免产生气泡。使用紫外光固化胶将湿润耳蜗的卵圆窗和圆窗两端粘附到干燥的样本杆上。用紫外灯围绕耳蜗照射10秒，使紫外胶固化。将耳蜗悬浮于成像室内的光学透明石英荧光计样品池中，样品池内充满Spalteholz溶液，并将标本杆固定在可旋转的支架上，该支架同时连接至X/Z平移台。然后，使用自行设计的程序控制标本沿X轴方向移动，并在Z轴方向进行步进扫描，从而在整个耳蜗范围内获取一系列2D图像。图像处理时，将图像序列转移至另一台计算机，并导入3D重建软件中进行三维重建与定量分析。小鼠耳蜗的直接体绘制显示了卵圆窗和圆窗、包含毛细胞的柯蒂氏器，以及被分割并进行体绘制的罗森塔尔管，沿其全长显示了螺旋神经节神经元（SGNs）。利用TSLIM技术，对一只三个月龄的年轻小鼠和一只23个月龄的小鼠耳蜗进行了成像并计数SGNs。以罗森塔尔管距离为函数的SGN细胞计数在线性图中显示，在耳蜗的中段和顶端区域，年轻小鼠的SGNs数量多于年老小鼠。通过使用聚类分析和三维重建软件，可直观显示螺旋神经节神经元（SGNs）的明显丢失。螺旋神经节密度差异以颜色梯度表示，其中高密度区域为黄色，蓝色则代表低密度区域。聚类分析清晰地展示了沿罗森塔尔管全长分布的细胞密度较低区域。光片显微镜旨在生成排列良好的图像序列，从而可对结构进行三维体积重建。三维重建程序能够对结构及其不同结构之间的解剖学关系进行定量评估。然而，由于三维重建程序提供了大量不同的用户参数，要有效使用这些程序需要经历较陡峭的学习过程。

imaging-the-aging-cochlea-with-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用光片荧光显微镜对老化耳蜗进行成像

活体成像哺乳动物胚胎耳蜗具有挑战性，因为相关发育过程在十天内呈现时间梯度变化。本文介绍一种方法，用于培养并连续五天对来自荧光报告小鼠的胚胎耳蜗外植体组织进行成像。...

小鼠耳蜗组织外植体的长期延时成像

初级纤毛影响多种信号通路。哺乳动物耳蜗是研究平面细胞极性（PCP）信号通路的理想模型。纤毛功能障碍会影响耳蜗的外向生长、细胞排列模式以及毛细胞的定向，这些均为PCP的表型读数。我们的目标是通过表型分析、免疫组织化学和扫描电子显微镜技术，分析小鼠耳蜗中的PCP信号通路。...

纤毛病小鼠突变体耳蜗中平面细胞极性表型的评估

我们介绍了一种分离成年耳蜗柯蒂器官的方法，可获得完整的三个耳蜗回（顶回、中回和底回）。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体进行免疫染色的操作步骤。结合这些技术，可对耳蜗中的毛细胞、支持细胞及其他细胞类型进行研究。...

成年小鼠耳蜗的全组织解剖与免疫荧光染色

本文描述了一种用于可视化转基因 Hb9::GFP...

利用光片荧光显微镜观察小鼠胚胎运动轴突导向及量化轴突分支

斑马鱼是一种具有多种重要特性的模式生物，包括光学通透性高、体外发育迅速，以及对听觉和平衡研究尤为重要的体表感觉毛细胞。本文概述了如何利用转基因斑马鱼整体性地检测毛细胞的机械感觉功能和突触前功能。...

斑马鱼幼鱼侧线毛细胞的活体钙成像

本文描述了一种用于评估正常小鼠带状突触形态特征和功能状态的实验方案。该模型同样适用于噪声诱导和年龄相关性耳蜗突触病变受限模型。文中还讨论了以往小鼠研究的相关结果。...

小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的形态学与功能评估

本文介绍了一种利用功能性的机械转导通道，对3 kDa Texas Red标记的葡聚糖在听觉毛细胞中摄取过程进行可视化的方法。此外，还可使用3–10...

活体功能性小鼠耳蜗毛细胞中葡聚糖的标记与摄取

本文介绍了一种跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）的实验方案，这是一种非接触式扫描探针技术，可用于对活体听觉毛细胞中的静纤毛束进行纳米级成像。...

活体哺乳动物听觉毛细胞中纳米级分辨率的静纤毛束成像

本文介绍了一种用于处理年轻成年及老年沙土鼠耳蜗的实验方案，包括对传入性突触结构和毛细胞进行免疫标记、淬灭老年组织中的自发荧光、解剖并测量耳蜗长度，以及对共聚焦成像获得的图像序列进行突触定量分析。...

年轻成年与老年沙鼠耳蜗中带状突触的免疫标记与计数

鸡是一种经济、易得且广泛可用的模式生物，适用于多种研究。本文详细描述了一系列实验方案，旨在揭示禽类内耳发育与再生的分子机制。...

In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

本文介绍了一种噪声性听力损失（NIHL）小鼠模型的实验方案。为诱导NIHL，我们设计了一种新型且简便的装置，该装置由波纹塑料、大鼠捕鼠笼和扬声器组成。采用听觉脑干反应和免疫荧光成像分别评估听力功能和外毛细胞损伤情况。...

小鼠噪声性听力损失的改良实验条件及听力功能与外毛细胞损伤评估

了解光片荧光显微镜技术对老化耳蜗进行无损三维成像的方法。该技术可定量分析螺旋神经节神经元密度变化，为研究年龄相关性听力损失提供重要的病理学依据。

使用光片荧光显微镜成像衰老的耳蜗

探索更多视频