使用碎裂、均质化和连续过滤的组合从牛卵巢中分离小的前窦卵泡

该协议允许从单个牛卵巢中有效和可重复地分离早期前窦卵泡，并为研究非牛物种的卵巢卵泡生成创造了新的机会。通过使用来自单个卵巢的更多卵泡，该技术可以在卵巢收获前进行体内治疗，或者随着时间的推移通过卵巢活检从同一动物身上获得多个样本。早期前窦卵泡的分离和冷冻保存可能是接受性腺毒性治疗（如化疗）的年轻女性保留生育能力以及濒危物种种质保存的宝贵选择。

演示该程序的将是我实验室的博士生Stephanie McDonnell，Amanda Morton和Juliana Candelaria。首先，在实验室中将卵巢转移到含有Pen-Strep的温暖无菌PBS中，并选择具有许多小窦卵泡且没有突出的镥体的卵巢。用剪刀从卵巢中去除多余的结缔组织和脂肪。

将一个卵巢转移到工作台纸上的砧板上。使用手术刀将卵巢从一个韧带附着部位纵向切成两半到另一个附着部位。将一半的卵巢放在要处理的砧板上，然后将另一半卵巢放回含有Pen-Strep的温暖PBS中。

要去除髓质，请沿着卵巢的曲率切开距离表面约 2 毫米，不要穿过皮质，暴露的髓质朝上。切开切口以去除大部分髓质。将卵巢翻转一半，使上皮朝上，然后用手术刀完成将髓质从皮质上切开，并修剪掉连接到韧带的卵巢片边缘周围任何剩余的白色结缔组织。

一旦大部分髓质被移除，用手术刀将皮层切割成大约 1 毫米厚，同时用小的来回动作操纵手术刀以剃掉髓质的其余部分，然后将每个卵巢皮层切成两半。将皮质碎片保存在含有Pen-Strep的温暖PBS中，直到准备好切碎。将一块皮质转移到组织切碎器上的培养皿中，并用三到四滴含有Pen-Strep的温热PBS润湿组织。

在用一对镊子保持组织稳定的同时，按一次重置按钮以启动组织切碎器。将整个皮质切成条状后，使用刀片架旋钮将刀片从培养皿上提起，用镊子从刀片上去除任何组织。将板架旋转 90 度后，再次按下重置按钮并将刀片完全穿过纸巾条。

如前所述，使用刀片架旋钮将刀片从培养皿上提起，使用镊子从刀片上去除任何组织。使用移液管和含有Pen-Strep的温热PBS，将切碎的组织清洗到预热的50毫升锥形管中。将锥形管放回水或珠浴中，以保持切碎的组织温暖，同时对卵巢的其他三半重复切碎过程。

为获得最佳切割效果，请使用螺母起子从切碎臂上卸下螺母，然后卸下垫圈和刀片扣。使用镊子，从切肉臂上取下刀片。将其翻转过来，使未使用的边缘面向培养皿，然后将其放回切臂上。

确保均质机单元已插入并将速度设置为第二巴后，根据制造商的规格将 10 毫米发生器探头插入装置。接下来，设置一个计时器1分钟，并将探针插入50毫升锥形管中，该锥形管包含一个卵巢的切碎皮层组织和足够的含有Pen-Strep的PBS以将管填充到25毫升线。探头插入的深度必须是从腔室底部测量的液体高度的 1/3。

定时器启动后，打开均质机，确保探头底部不接触管子，并在均质器打开时保持管子不动。均质化1分钟后，从管中取出探针，然后清除任何堵塞转子刀和转子管之间空间的通风孔的结缔组织或使用镊子卡在探头中的皮质片，并将它们放回管中。将分散的组织倒入粗棉布覆盖的漏斗中，插入锥形瓶中，并使用温热的PBS将管的内容物冲洗到漏斗中。

最后，用温热的PBS冲洗粗棉布。通过将粗棉布绕在组织碎片周围向下挤压，直到从粗棉布上去除所有多余的液体和组织，迫使小碎片中的液体通过布孔。在漏斗上重新打开粗棉布后，使用移液管用含有Pen-Strep的PBS冲洗粗棉布，然后再次通过布挤压任何残留的组织碎片。

使用止血器，将 300 微米的细胞过滤器放在 200 毫升烧杯上，然后将滤液倒入锥形瓶中通过细胞过滤器。如果细胞过滤器被组织堵塞，请轻轻敲击烧杯，然后将过滤器倒置，将大组织碎片敲出到工作台纸上。使用含有Pen-Strep的温热PBS冲洗烧瓶的内容物，直到没有组织碎片残留，然后将其倒入细胞过滤器中。

接下来，在第二个200毫升烧杯上用止血器握住40微米细胞过滤器的同时，将第一个200毫升烧杯中存在的所有初始滤液倒入过滤器，然后使用含有Pen-Strep的温热PBS冲洗烧杯的内容物，直到没有组织碎片残留并将其倒入细胞过滤器中。将18号针头安装到20毫升注射器上后，用卵泡洗涤介质填充注射器。用止血器将40微米的细胞过滤器倒置在方形培养皿上，并使用注射器将细胞过滤器的内容物洗出到培养皿中。

将方形培养皿转移到立体镜中，将温暖的载物台设置为38.5摄氏度，放大倍率设置在1.25至3.2倍之间。从方形培养皿中识别卵泡后，使用微量移液管将卵泡转移到洗涤中等滴剂中。使用6分钟组织匀浆每次重复分离的窦前卵泡总数显示每个重复平均41个卵泡，范围从11到135个卵泡。

对476个分离卵泡发育阶段的评估表明，大多数处于发育的初级阶段，含有一层立方体颗粒细胞，测量为40至79微米。与以相同速度匀浆5分钟相比，卵巢皮层均质化6分钟产生更多的前窦卵泡。使用逆转录定量PCR评估卵泡中颗粒细胞标志物FSH受体和生殖细胞标志物DAZL的转录表达，证明原发性和早期次级卵泡均表达FSH受体和DAZL转录本。

CX37在初次和早期中期分离的窦前滤泡中的免疫荧光定位表明，CX37定位于O质，在O位点的细胞核和颗粒细胞的膜中不存在。根据我们的经验，正确解剖一层薄薄的皮质组织，将组织切碎到合适的大小，并进行适当的均质化是确保从组织中释放活卵泡的关键步骤。分离的窦前卵泡可用于回答诸如窦前卵泡生长的调节以及颗粒细胞与卵母细胞之间相互作用的性质等问题，从而促进更有效的培养条件的发展。