基于AirID的邻近标记技术用于植物中蛋白质-蛋白质相互作用研究

AirID 是一种用于蛋白质-蛋白质相互作用研究的有价值酶，与其他邻近标记酶相比，其在耗时过程中产生的毒性更低且错误率更少。本文以 AT4G18020 APRR2-AirID 蛋白为模型，展示了在黄瓜（Cucumis sativus）中进行邻近标记实验的逐步操作方案。本实验操作将由我实验室的 Ahmad Zada、Imran Khan、Yuting Cheng 和 Min Zhang 进行示范。

首先将黄瓜（Cucumis sativus）种子放入水中，于50°C下孵育20分钟，然后将种子置于培养皿中的滤纸上，保持12至16小时。随后将种子转移至装有土壤的花盆中，在气候培养箱中于23°C条件下培养三到四周，光照周期为16小时光照、8小时黑暗。向农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株的感受态细胞中转入2.5 µL的EarleyGate 100质粒。

将试管置于冰上孵育30分钟，然后转移至液氮中3分钟。为进行热激，将试管转移至37摄氏度的培养箱中孵育5分钟，随后将试管放回冰上孵育2分钟。

向热激的农杆菌细胞中加入 1,000 微升 LB（Luria Bertani）培养基。将细胞在 30 摄氏度、118 转/分钟条件下孵育 1 小时后，在 4 摄氏度下以 3000 ×g 离心 2 分钟。然后弃去 800 微升上清液，并混匀剩余溶液。

将菌液涂布于添加了每毫升50微克卡那霉素和庆大霉素以及每毫升25微克利福平的LB培养基上。在30°C条件下将平板培养48小时。从平板上挑取若干细菌菌落。

将菌体置于LB液体培养基中，加入适当的抗生素，并在30摄氏度、218转/分钟条件下培养36至48小时。在4摄氏度下以3,000 G离心两分钟，将菌体沉淀重悬于农杆菌浸润缓冲液中，调节600纳米波长处的光密度至1。使用1毫升无针注射器，将1.5毫升重悬的农杆菌接种液注入叶片下表皮的整个表皮区域。

将植物置于气候培养箱中，在23摄氏度、光照强度为75微摩尔每平方米每秒的条件下培养16小时，随后在黑暗条件下培养8小时。36小时后，向已进行渗透处理的叶片中注入1毫升含5微克生物素的溶液。生物素渗透4至12小时后，剪下叶片并迅速转移至液氮中，以防止蛋白质降解。使用研钵和研杵研磨叶片，并迅速加入2毫升pH为7.4的PBS BSA溶液，随后缓慢继续研磨。

将样品混合物通过置于15毫升锥形管上方的快速过滤材料进行过滤，随后将锥形管置于冰上。将过滤后的样品转移至2毫升离心管中。加入1%蛋白酶抑制剂混合液，通过上下颠倒混匀管内液体7到8次，然后进行离心。

完成后，将上清液转移至一个新的 2 毫升离心管中，并加入 10% beta-D-麦芽糖苷。将离心管置于冰上孵育 5 分钟，然后在 4°C 条件下以 20,000 G 离心 10 分钟。为平衡脱盐柱，请在柱体一侧做标记，并在离心时使标记面朝外。

取下色谱柱的顶部和底部盖子，在4°C条件下以1,000 G离心两分钟。弃去收集管中的液体，并用5毫升PBS缓冲液洗涤色谱柱收集管，离心条件与之前相同，至少重复五次。在1.5毫升离心管中，将1毫升PBS BSA加入50微升链霉亲和素-C1偶联磁珠中，充分混匀。

将离心管置于磁力架上静置三分钟，使磁珠吸附至管壁一侧。从另一侧弃去上清液，并重复此 PBS BSA 洗涤步骤三次。为富集生物素化蛋白，向层析柱中加入两毫升样品。

在4摄氏度下以1000 G离心柱子8分钟后，将1毫升脱盐后的蛋白质提取物加入50微升链霉亲和素-C1偶联的磁珠中。将含有磁珠的离心管置于旋转器上，在室温下以正常速度旋转30分钟，充分混匀溶液。随后，将磁珠置于磁力架上，在室温下静置3分钟，或直至磁珠聚集于离心管一侧。

轻轻移除上清液，加入一毫升洗涤缓冲液一。在旋转仪上旋转试管两分钟，然后重复在磁力架上进行的步骤以去除上清液。同样地，依次用一毫升洗涤缓冲液二和洗涤缓冲液三进行洗涤，操作步骤如前所述。

接下来，通过加入1.7毫升50毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（tris hydrochloride），并重复在磁力架上进行的步骤，以去除洗涤缓冲液中的去垢剂。使用1毫升50毫摩尔的碳酸氢铵缓冲液进行六次洗涤，每次洗涤2分钟。洗涤完成后，向珠粒中加入50微升蛋白提取物，其中含有50毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、12%蔗糖、2%十二烷基硫酸锂和1.5%二硫苏糖醇，然后将离心管置于100摄氏度的孵育器中加热5分钟，以进行热激处理。

在磁力架上重复该步骤后，将上清液于 minus 80 摄氏度保存，用于 LCMS/MS 分析。对提取的蛋白质进行的 Western 印迹分析显示，在浸润的黄瓜叶片中，蛋白质成功表达并实现了生物素化。与对照相比，标记蛋白质的表达水平更高，并出现额外条带，证实了 AirID 成功标记了目的基因的目标蛋白质。

使用 Anti-Flag 和 Anti-Mass 抗体验证了实验结果，所有转化样本中均通过 Anti-Flag 抗体检测到目标条带。利用链霉亲和素-C1偶联磁珠富集生物素化蛋白后，观察到多个不同大小的蛋白条带。综合所有结果，得出结论：AirID 是一种用于分析植物中蛋白质-蛋白质相互作用的新型且理想的酶。

在进行邻近标记实验时，需牢记五微摩尔生物素及HR孵育时间是理想条件。本方案详细阐述了基于AirID的植物邻近标记实验的逐步操作流程，包括叶片样品制备、去除预存生物素、提取蛋白的定量以及生物素化蛋白的富集。AirID有望通过联合应用提高蛋白质相互作用（PPI）非依赖性生物素标记的准确性。

综上所述，AirID 非常适合用于植物中的蛋白质相互作用分析。