Name: 低剂量伽马辐射灭菌治疗脱细胞气管移植物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 了解低剂量伽马辐射灭菌技术用于脱细胞气管移植物的处理方法。本方案以新西兰白兔气管为模型，在保持器官生物力学特性的同时实现有效灭菌，为器官移植提供安全可靠的灭菌策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到了2018年西班牙胸外科协会资助的全国多中心研究项目（编号180101，授予Ne）的支持。&#769;stor J.Marti&#769;nez-Herna&#769;ndez] 和 PI16-01315 [授予 Manuel Mata-Roig]，由西班牙卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）资助。CIBERER 由西班牙第六个国家研发计划（VI National R&amp;#38;D&amp;#38;I 计划 2018-2011、Iniciativa Ingenio 2010、Consolider 计划、CIBER 行动以及卡洛斯三世健康研究所，获得欧洲区域发展基金资助。

本研究遵循欧盟关于实验动物护理和使用的指令20170/63/EU，并已获得西班牙瓦伦西亚大学伦理委员会的批准（依据欧洲经济共同体法律86/609/EEC、1997年214号法令以及瓦伦西亚政府2018/VSC/PEA/0122第2类代码）。
1. 气管脱细胞化
注意：脱细胞化方法已在其他地方报道过20。
<ol>
	<li>使用200 mg/mL的戊巴比妥钠溶液经耳缘静脉注射（剂量为133 mg/kg），处死体重为3.5–4.1 kg的雄性成年新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）。</li>
	<li>在确保无菌条件下，行中央纵行颈部切口，分离颈肌并暴露气管。对气管进行环周及纵向解剖，最终在第一软骨环下方和隆突上方切断。</li>
	<li>用手术刀将气管切成2 cm长的节段，再用剪刀去除周围结缔组织和内层黏膜6。</li>
	<li>将组织样本浸入含12 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的溶液中，该溶液包含2%十二烷基硫酸钠（SDS）、5%青霉素-链霉素和5%两性霉素B。</li>
	<li>将气管置于室温下，用磁力搅拌器以400 rpm持续搅拌5周。每周更换一次脱细胞溶液，每次换液前先将气管浸入蒸馏水中进行2小时的渗透压冲击处理。</li>
	<li>使用含80%胎牛血清（FBS）和20%二甲基亚砜（DMSO）的12 mL混合液，在-80 °C冷冻容器中对样本进行冷冻保存。</li>
	<li>当气管即将使用时（保存13–15天后），在37 °C水浴中解冻，并在解冻完成后将其浸入PBS中清洗。</li>
</ol>
2. 灭菌
<ol>
	<li>辐照
	<ol>
		<li>将四段气管组织（每段长2 cm）放入含20 mL PBS的T25培养瓶中，加入甲基丙烯酸酯至总体积达30 mL。注意避免气泡形成，以防在气液界面处引起能量扩散。</li>
		<li>使用直线加速器进行辐照，采用标称能量为10 MV的无均整滤过器光子束。在等中心处设置剂量率为每分钟2,400监测单位，将气管置于源-表面距离为100 cm的位置进行辐照，照射野深度为2.5 cm，照射野大小为10 cm × 10 cm，以覆盖整个容器，相当于剂量率为24 Gy/min。</li>
		<li>逐批递增剂量：每四段气管组织分别接受0.5 kGy、1 kGy、2 kGy等剂量，依此类推，直至达到灭菌剂量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养
	<ol>
		<li>将组织段转移至30 mL含10%灭活胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，不含抗生素和抗真菌剂。</li>
		<li>在标准组织培养箱中于37 °C、5% CO2&#160;条件下培养2周，每隔24小时观察一次。 
		注：污染的判断指标为培养基pH值的变化，以及相应的颜色和浑浊度改变。气管组织取自无菌兔形目动物，动物未患病，因此预期其气管内无厌氧菌存在。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 组织学分析
注意：使用苏木精和伊红21、马松三色染色法以及地衣红22对组织切片进行染色。
<ol>
	<li>DAPI 染色
	<ol>
		<li>使用DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）检测组织活力。这种蓝色荧光染料可强烈结合DNA序列中富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的区域，从而实现对DNA的可视化观察 通过 荧光显微镜技术</li>
		<li>将组织样本包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中。</li>
		<li>使用冷冻切片机切割样本。</li>
		<li>用蒸馏水将待染色的样品洗涤三次，以去除OCT。然后将其置于含有30 nM DAPI溶液的封片剂中。</li>
		<li>使用荧光显微镜观察荧光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA含量分析
	<ol>
		<li>使用手术刀切割长约3 mm的气管节段。</li>
		<li>在蛋白酶K中孵育2小时（材料表).</li>
		<li>使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取DNA。</li>
		<li>采用分光光度法，使用分光光度计在260/280 nm处测定吸光度以确定DNA浓度。</li>
		<li>使用生物分析仪通过毛细管色谱法测定提取的DNA样品的大小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 生物力学研究
注意：通过轴向拉伸和径向压缩试验测量气管对纵向和横向力的阻力23。
<ol>
	<li>气管测量
	<ol>
		<li>使用游标卡尺测量气管长度、管壁厚度和外径。</li>
		<li>对每个变量随机测量三次，计算其平均值。</li>
		<li>在径向压缩试验中，通过检测压板与样本接触的点来计算前后径。</li>
		<li>所有测试均在室温下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拉伸试验
	<ol>
		<li>在配备100 N载荷传感器（力分辨率为0.1 N，位移分辨率为0.001 mm，时间分辨率为0.1 s）的台式万能拉伸试验机（UTM）上，采用位移控制模式进行拉伸试验。该试验机配备有力和位移传感器，并连接至计算机，计算机中安装有制造商专门设计的软件23。</li>
		<li>每0.4秒记录一次数据，并导出至电子表格。</li>
		<li>使用纯单层、无毒水晶聚氯乙烯（PVC）空心管制作拉伸夹具，其外径为1 cm，壁厚为1.5 mm，尺寸适配兔气管的平均口径。</li>
		<li>将导管切成3 cm长的节段。</li>
		<li>在夹具边缘2 mm处钻制12个预制孔，用于端对端缝合，孔间距为2.5 mm，以避免缝线造成的偏差。</li>
		<li>通过交替使用预制孔（每5 mm一个），在距气管边缘2 mm处，使用6-0单丝尼龙缝线连续缝合，将PVC玻璃管与兔气管以端对端吻合方式连接。</li>
		<li>以5.0 mm/min的位移速率拉伸所有样品。</li>
		<li>记录最大应力（σmax，单位为N/mm2）和应变（εmax，无量纲），以及单位气管体积储存的能量（W/Vol，单位为mJ/mm）和杨氏模量（E，单位为MPa）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>径向压缩试验
	<ol>
		<li>在配备15 N力传感器（力分辨率0.001 N，位移分辨率0.001 mm，时间分辨率0.1 s）的台式压缩万能试验机（UTM）上进行径向压缩试验，以获取力（N）、位移（mm）和时间（s）数据。每0.5秒记录一次数据，并导出至电子表格。</li>
		<li>将气管放置于下压板上，使膜部朝下接触下板。下板以5 mm/min的恒定速度向上移动，逐渐接近上压板。</li>
		<li>计算使气管完全闭塞所需的单位长度上的力（f，单位为N/mm）、刚度（R，单位为MPa·mm）以及单位表面积上的能量（W / S，单位为mJ/mm2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 手术技术
注意：该手术技术已在其他地方被广泛报道20。
<ol>
	<li>放置一根无菌的管腔内PVC支架，规格为14 Fr（可自由滑动且不压迫管壁），两端各留出3-4 mm的边缘。</li>
	<li>通过第一软骨的软骨间间隙，使用一根6-0单丝尼龙缝线固定支架。</li>
	<li>继续对兔子进行麻醉。
	<ol>
		<li>对实验动物（3.65–4.05 kg 雄性新西兰白兔）进行术前给药，肌内注射镇痛剂（35 mg/kg 氯胺酮）以及镇静剂、肌松剂和镇痛剂（2.5 mg/kg 赛拉嗪）。</li>
		<li>剃除手术区域内的切口部位，并清洁手术区以去除毛发。</li>
		<li>给予镇痛药联合抗生素预防：0.05 mg/kg 肌内注射布托啡诺和 10 mg/kg 恩诺沙星。</li>
		<li>在每只兔子的耳缘静脉中插入静脉导管。</li>
		<li>以静脉注射10 mg/kg的丙泊酚推注诱导麻醉。</li>
		<li>使用三导联心电图、脉搏血氧仪和无创血压测量仪监测动物的生命体征。每30分钟向眼睛滴加生理盐水，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
		<li>使用脚趾夹捏法检测麻醉深度。</li>
		<li>使用1.5%–2%最低肺泡浓度的吸入式异氟烷维持麻醉，确保不抑制兔子的自主呼吸，并通过加热垫提供保温支持。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用含碘消毒剂以环形方式多次消毒切口区域。始终在无菌条件下操作，使用无菌器械，沿胸骨中线做一长约3 cm的纵向切口，切取双侧带蒂皮瓣，皮瓣包含胸肌筋膜及肌肉成分。</li>
	<li>用皮瓣包裹四只兔子的气管，每侧胸腔各一个（共八个气管）。</li>
	<li>手术完成后，通过停止异氟烷给药来逆转麻醉。</li>
	<li>术后时期
	<ol>
		<li>将动物留在手术室内，直至其完全从麻醉中恢复。待其完全恢复后，将其送回与其他兔子共同生活的环境。</li>
		<li>每24小时为兔子注射一次抗生素（每千克体重0.5 mL的2.5%恩诺沙星）和镇痛剂（美洛昔康5 mg/mL；每千克体重0.05 mL美他卡），持续5天。</li>
		<li>留下植入物 原位 所需时间。</li>
		<li>安乐死前，先通过肌内注射给予兔子镇痛剂（35 mg/kg 氯胺酮）以及具有镇静、肌肉松弛和镇痛作用的药物（2.5 mg/kg 赛拉嗪）。随后通过耳缘静脉注射200 mg/mL的戊巴比妥钠（133 mg/kg）实施安乐死，并取下气管。</li>
		<li>对气管进行生物力学和组织学检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 统计学分析
<ol>
	<li>使用 R 软件 3.5.3 版（R Foundation for Statistical Computing, 2019）中的贝叶斯方法对所有模型进行调整。</li>
	<li>对研究变量（除 f 和 R 外）采用多重线性回归模型进行分析。</li>
	<li>对于 f 和 R 变量，应用混合线性回归模型。在这些模型中，除了与每根气管的处理和状态相关的感兴趣变量外，还需将阻塞百分比作为单调效应引入，并将每根气管的独立项作为随机因素。</li>
</ol>

<ol><li>Ch'ng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+%28Crico%29trachea+for+malignancy+in+the+virgin+and+irradiated+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).</li>
<li>Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+feasibility+of+gamma+radiation+sterilization+for+decellularized+tracheal+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts.</a> Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).</li>
<li>de Donato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosthesis+infection%3A+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prosthesis infection: prevention and treatment.</a> The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).</li>
<li>Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+safety+sterilization+and+tissue+banking+issues+for+soft+tissue+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts.</a> Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).</li>
<li>Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+years+of+experience+with+the+rabbit+model%2C+a+versatile+model+for+tracheal+transplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Aesthetic+Research%22%5BJournal%5D)">Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research.</a> Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).</li>
<li>Hysi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+orthotopic+transplantation+of+short+tracheal+segments+without+immunosuppressive+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy.</a> European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).</li>
<li>Wurtz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+with+a+composite+graft%3A+Fascial+flap-wrapped+allogenic+aorta+with+external+cartilage-ring+support%5BTitle%5D)+AND+%22Interactive+Cardiovascular+and+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).</li>
<li>White, A., Burns, D., Christensen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+terminal+sterilization+using+supercritical+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide.</a> Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).</li>
<li>Qiu, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+bacterial+spores+and+viruses+in+biological+material+using+supercritical+carbon+dioxide+with+sterilant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+B%2C+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).</li>
<li>Lange, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+a+novel+vacuum-assisted+method+for+decellularization+of+tracheae+for+clinical+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).</li>
<li>Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+sterilization+in+microbiological+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories.</a> Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).</li>
<li>Hennessy, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercritical+carbon+dioxide-based+sterilization+of+decellularized+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22JACC.+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves.</a> JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+of+lung+matrices+by+supercritical+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).</li>
<li>AENOR. UNE-EN. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISO+11737-1%3A2006.+Esterilizaci%C3%B3n+de+productos+sanitarios.+M%C3%A9todos+biol%C3%B3gicos.+Parte+1%3A+Determinaci%C3%B3n+de+la+poblaci%C3%B3n+de+microorganismos+en+los+productos%5BTitle%5D)+AND+%22AENOR.+UNE-EN%22%5BJournal%5D)">ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos.</a> AENOR. UNE-EN. , Published online 2006 (2006).</li>
<li>Uriarte, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+acellular+mouse+lungs+after+sterilization+by+gamma+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).</li>
<li>Sun, W. Q., Leung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+study+of+extracellular+tissue+matrix+degradation+and+instability+after+gamma+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation.</a> Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).</li>
<li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+radiation+sterilization+dose+improves+mechanical+and+biological+quality+while+retaining+sterility+assurance+levels+of+bone+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts.</a> Bone. 57 (1), 194-200 (2013).</li>
<li>Helder, M. R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+gamma+irradiation+of+decellularized+heart+valves+results+in+tissue+injury+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).</li>
<li>Martínez-Hernández, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tracheal+prelamination+implant%3A+A+proposed+bilateral+double+organ+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique.</a> Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coloraciones+para+fibras+col%C3%A1genas+y+el%C3%A1sticas+del+tejido+conjuntivo.+Coloraciones+para+sustancia+amiloidea%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratorio+de+Anatom%C3%ADa+Patologica%22%5BJournal%5D)">Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea.</a> Laboratorio de Anatomía Patologica. , McGraw-Hill. 175-195 (1993).</li>
<li>Martínez-Hernández, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardised+approach+to+the+biomechanical+evaluation+of+tracheal+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts.</a> Biomolecules. 11 (10), 1461(2021).</li>
<li>Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+optimal+decellularization+and+sterilization+protocol+for+preparing+a+tissue+scaffold+of+a+human-sized+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).</li>
<li>Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sterile+amniotic+membrane+tissue+graft+using+supercritical+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+stem+cells+seeded+into+decellularized+rat+kidney+scaffolds+endothelialize+and+remodel+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes.</a> Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).</li>
</ol>

所有作者均无利益冲突。

目前存在多种灭菌策略。超临界CO2能够完全穿透组织，通过降低植入物压力即可实现简单清除，同时使培养基酸化并破坏细胞磷脂双分子层8,14,25。紫外线辐射也曾被使用，其在啮齿类动物气管中的灭菌效果已有文献报道，但相关研究报道较少10。其他方法包括使用过氧乙酸、乙醇、过氧化氢或电解水等物质，但这些方法结果不稳定，且已被证明会对组织产生显著影响11,12。与上述策略相比，γ射线辐照不仅被证实具有完全有效的灭菌能力，而且对其剂量及灭菌效应的研究也十分充分和广泛。事实上，相关研究已足够深入，国际标准化组织（ISO）已制定了γ射线用于灭菌的标准，其中规定用于人体植入的惰性材料的灭菌剂量为25 kGy13,<su...

植入物的灭菌是其可存活的基本前提；事实上，已证明成功的假体都是植入于无菌区域（如血管、心脏、骨骼等）的1。气管具有两个表面：一个与外部环境接触的表面，因此并非无菌；另一个朝向纵隔的表面，则是无菌的。因此，从气管被取出的那一刻起，它就不是一个无菌器官。尽管后续的脱细胞过程是在最大限度的无菌条件下进行的，但该过程并不属于灭菌步骤2。植入异物本身会因产生利于细菌生长的微环境而带来感染风险3，并且即使材料已经过灭菌处理，仍存在最高达0.014%的从供体向受体传播疾病的风险4。为了确保气管获得良好的血管化，在几乎所有实验性移植方案中，首先需将其异位植入（heterotopic implant）到一个无菌区域（如肌肉、筋膜、大网膜、皮下等）5,6,7&#160;；这是因为将非无菌物质植入此类环境会导致局部感染3。
获得无菌植入物有多种可能的策略。使用超临界CO2已实现终端灭菌8,9。其他方法，如紫外线辐射或使用过氧乙酸、乙醇、过氧化氢和电解水等物质处理，在灭菌方面取得了不同的成功率，几乎总是依赖于其剂量，但这些方法已被证明会影响植入物的生物力学特性。事实上，某些物质（如环氧乙烷）可能显著改变植入基质的结构，甚至引起不良的免疫原性效应。因此，许多此类策略无法应用于生物模型2,10,11,12,13。
目前研究最广泛且被普遍接受的灭菌策略是依据 ISO 11737-1:2006 标准规定的对人体植入医疗器械进行灭菌的方法，即采用 25 kGy 的伽马辐射剂量。然而，该规范仅针对惰性、非生物性材料的灭菌14,15。此外，用于癌症根治性治疗的放射治疗剂量比用于医疗器械灭菌的剂量低三个数量级1。基于此，我们可以得出结论：该剂量不仅会杀死微生物群，还会破坏并显著改变植入物的生物结构。此外，还可能存在一种风险，即材料在降解过程中产生残留脂质，这些残留物可能具有细胞毒性，并加速支架的酶促降解13,14,15,16,17，即使使用低至 1.9 kGy 的剂量时也会发生，且损伤程度与所接受的辐射剂量呈直接正比关系17。
因此，本文的目的是尝试确定一种辐射剂量，该剂量可在尽量减少辐照造成有害影响的前提下，获得无菌的植入物2,18,19采用的策略包括对脱细胞并经辐照的气管在千戈瑞范围内（0.5、1、2、3 kGy等）进行不同递增剂量的辐照，直至获得阴性培养结果。对于获得阴性培养的剂量，进一步开展额外检测以确认灭菌效果。在确定实现灭菌所需的最低剂量后，评估辐照对气管结构和生物力学性能的影响。所有指标均与对照组天然兔气管进行比较。随后对构建物的灭菌效果进行验证 体内 通过将气管植入新西兰白兔体内。

<table><tbody><tr><td>6-0 尼龙单丝缝合线&amp;nbsp;</td><td>Monosoft. Covidien; 美国马萨诸塞州曼斯菲尔德</td><td>SN-5698G</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B 5%</td><td>Gibco 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪</td><td>Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare；英国赫尔</td><td>N02AE01</td><td></td></tr><tr><td>压缩式台式万能试验机</td><td>Microtest，西班牙马德里</td><td>EM1/10/FR</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leyca CM3059，Leica Biosystems，德国韦茨拉尔</td><td>CM3059</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich；美国密苏里州</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>DNA 提取试剂盒</td><td>DNeasy 提取试剂盒 Qiagen，德国希尔登</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>恩诺沙星，2.5%</td><td>Boehringer Ingelheim，德国英格尔海姆</td><td>0035-0002</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GE Healthcare Hyclone；西班牙马德里</td><td>SH20898.03IR</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica DM2500（Leica，德国韦茨拉尔）</td><td>DM2500??</td><td></td></tr><tr><td>冷冻容器&amp;nbsp;</td><td>Mr Frosty. 赛默飞世尔；西班牙马德里</td><td>&amp;nbsp;5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Isoflo；Proyma Ganadera；西班牙雷阿尔城&amp;nbsp;</td><td>8.43603E+12</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Imalgene. Merial；法国图卢兹</td><td>BOE127823</td><td></td></tr><tr><td>直线加速器&amp;nbsp;</td><td>&quot;True Beam&quot;. Varian，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托</td><td>H191001</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Orbital Shaker PSU-10i. Biosan；拉脱维亚里加</td><td>BS-010144-AAN</td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康 5 mg/ml</td><td>Boehringer Ingelheim，德国英格尔海姆</td><td>6283-MV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 5%</td><td>Gibco 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Dolethal. Vetoquinol；西班牙马德里&amp;ntilde;</td><td>3.60587E+12</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich；美国密苏里州</td><td>P2272</td><td></td></tr><tr><td>丙泊酚</td><td>Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG；德国梅尔松根</td><td>G 151030</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Gibco 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>S3020</td><td></td></tr><tr><td>PVC 空心管</td><td>Cristallo Extra；FITT，意大利桑德里戈</td><td>hhdddyyZ</td><td></td></tr><tr><td>PVC 支架&amp;nbsp;</td><td>ArgyleTM Medtronic；土耳其伊斯坦布尔</td><td>019 5305 1</td><td></td></tr><tr><td>R 软件，版本 3.5.3 R Core</td><td>统计计算 R 基金会</td><td>R 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich；美国密苏里州</td><td>8,17,034</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Nanodrop，Life Technologies；Isogen Life Science. 荷兰乌得勒支</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>电子表格软件</td><td>Microsoft Excel for Mac，版本 16.23，美国华盛顿州雷德蒙德</td><td>2864993241</td><td></td></tr><tr><td>拉伸万能试验机&amp;nbsp;</td><td>Testing Machines，荷兰韦嫩达尔</td><td>84-01</td><td></td></tr><tr><td>UTM 软件</td><td>TestWorks 4，MTS 系统公司，美国明尼苏达州伊甸草原&amp;nbsp;</td><td>100-093-627 F</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 封片剂&amp;nbsp;</td><td>Vector Labs，美国加利福尼亚州伯林盖姆</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Xilagesic. Calier；西班牙巴塞罗那&amp;ntilde;</td><td>20102-003</td><td></td></tr></tbody></table>

低剂量伽马辐射对脱细胞气管移植物的灭菌处理

Low-Dose Gamma Radiation Sterilization for Decellularized Tracheal Grafts

确保移植顺利进行的关键因素之一是介质的无菌性。脱细胞气管移植涉及植入原本与外界环境接触的器官，因此从一开始便不具备无菌状态。尽管脱细胞化方案（通过去污剂处理［2% 十二烷基硫酸钠］、持续搅拌和渗透冲击）是在无菌操作条件下进行的，但该过程并不能实现灭菌。因此，主要挑战之一是在移植前确保无菌性 体内 植入。尽管无机材料已有成熟的伽马辐射灭菌方案，但目前尚无适用于有机材料的类似措施。此外，现有的无机材料灭菌方案无法直接应用于有机材料，因为常规的辐射剂量（25 kGy）会彻底破坏移植物。本研究探讨了逐步提高辐射剂量对脱细胞兔气管的影响。我们保持剂量范围（kGy），测试递增的辐射剂量，直至确定实现灭菌的最低有效剂量。在确定该剂量后，我们从组织学和生物力学两方面评估其对器官的影响。结果表明，0.5 kGy 剂量未能实现灭菌，而 1 kGy 和 2 kGy 剂量均可实现完全灭菌，因此 1 kGy 为实现灭菌所需的最低剂量。显微观察显示，与未灭菌器官相比无显著结构变化。轴向生物力学特性未发生任何改变，仅观察到器官在径向所能耐受的单位长度受力有轻微下降。因此，我们可以得出结论：1 kGy 剂量可实现脱细胞兔气管的完全灭菌，且对器官的影响极小，甚至可忽略不计。

脱细胞化 
DAPI 染色显示无 DNA 存在，通过电泳检测所有气管中的 DNA 含量均未超过 50 ng，且所有片段均小于 200 bp20。
微生物培养 
在接受0.5 kGy辐照的八块样品中，有两块在不到1周内出现了颜色变化。接受1 kGy和2 kGy辐照的样品均未出现任何颜色变化（图1）。
组织学分析 
在所分析的所有样本中，均未检测到胶原纤维或弹性纤维分布模式的改变（图2）。
确定辐射剂量 
根据上述结果，0.5 kGy 的辐照剂量无法确保样本的灭菌，而 1 kGy 和 2 kGy 的剂量则可以实现灭菌，因此我们将实现组织灭菌的最低可能辐照...

获得无菌状态对于气管组织移植至关重要。本文介绍了一种使用低剂量γ射线辐照的灭菌方案，该方法可被器官完全耐受。

确保移植顺利进行的主要关键因素之一是介质的无菌性。脱细胞气管移植……

本方案提供了一种完整的灭菌流程，可用于任何非无菌器官，且不会影响其特性。该技术的主要目标是能够在不改变器官性质的前提下实现灭菌。尽管该技术目前主要针对气管，但已证明较低剂量的γ射线即可有效灭菌生物材料。可以通过确定不同器官类型的最低有效剂量来解决这一问题。建议从较低剂量开始，逐步增加剂量，直至达到灭菌效果。首先，将安乐死的新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）的气管取出并切成两厘米长的片段。使用剪刀去除周围的结缔组织和内层黏膜。将标本浸入含有SDS、5%青霉素-链霉素和5%两性霉素的12毫升PBS溶液中。在室温下，用磁力搅拌器以400转/分钟持续搅拌气管，持续五周。每周将气管浸入蒸馏水中，进行两次、每次两小时的渗透冲击处理，然后再更换培养基。五周后，使用含有80% FBS和20% DMSO的12毫升混合液，将气管样本置于-80摄氏度的冷冻容器中进行冷冻保存。13至15天后，将气管在37摄氏度的水浴中解冻。然后用PBS洗涤。照射样本时，将四个气管组织片段放入含20毫升PBS的甲基丙烯酸甲酯T25培养瓶中，并防止气泡形成。使用直线加速器进行照射，射线为10兆伏（MV）标称能量的无均整滤过器光子束。以每分钟2,400个监测单位的剂量率照射，并按照文中的描述设置其他参数。处理完成后，将样本接种于30毫升DMEM培养基中，该培养基需添加10%灭活的FBS，且不含抗生素和抗真菌剂。将培养物置于标准组织培养箱中，在37°C及5% CO₂条件下孵育两周，每隔24小时观察一次污染指标，如培养基pH值、颜色和浑浊度的变化。使用配备有力传感器和位移传感器、并连接装有专用软件计算机的桌面式万能牵引试验机（UTM位移控制模式）进行拉伸试验。每0.4秒记录一次数据，并将数据导出至电子表格中。采用纯单层无毒晶体聚氯乙烯（PVC）空心管，根据兔气管的平均口径制作适配的拉伸夹具。将导管切成三厘米长的节段。为进行无偏斜的端端吻合，在距钳缘两毫米处钻出12个预先形成的孔，孔间距为2.5毫米。接着，通过连续的6-0尼龙单丝缝线，经距气管边缘两毫米处预先存在的五毫米孔，以交替方式将PVC玻璃管与兔气管进行端端吻合固定。以5.0毫米/分钟的位移速率拉伸所有样品。然后记录各项变量，如最大应力和应变、单位气管体积储存的能量以及杨氏模量。使用配备15牛顿载荷传感器的压缩式桌面万能试验机进行径向压缩测试，以获取力、位移和时间数据。以0.5秒为间隔记录数据并导出至电子表格。将气管放置于下板上，使膜部朝下，随后下板以每分钟5毫米的恒定速度逐渐向上板移动。计算样品单位长度的各个变量、刚度，以及完全闭塞气管所需的单位表面积能量。放置一个14号无菌管腔内PVC支架，确保支架两端各留出3至4毫米的边缘。通过第一软骨的软骨间间隙，使用一根6-0单丝尼龙缝线将支架固定。在无菌条件下，使用无菌材料做一长约3厘米的纵行胸段正中切口，切取双侧带蒂瓣，瓣膜由胸肌筋膜及肌肉成分组成。用瓣膜包裹四只兔子的气管，每侧胸腔各包裹一根气管。手术完成后，停止异氟烷给药以逆转麻醉。在暴露于0.5千戈瑞辐射的八块组织中，有两块在一周内出现培养基颜色改变。然而，在一或两千戈瑞剂量下辐照的样本均未显示出培养基颜色的任何变化。与对照组相比，在不同辐射剂量下辐照的分析样本中，均未检测到胶原纤维或弹性纤维分布模式的改变。此处展示了对辐照气管进行拉伸试验所获得的数据。脱细胞化并经辐照的气管的应力-应变曲线与未灭菌气管相比未发现变化。图中显示了对天然气管（对照组）以及脱细胞化、冷冻保存并经辐照的气管进行的压缩测试结果。相应的图表表明，与天然气管相比，辐照处理未改变阻塞百分比。伽马辐照导致放射生物力学特性及单位长度上的可变力出现具有统计学意义但临床意义轻微的下降。组织学检查显示，移植材料具有高度有序的结缔组织，形态类似于天然气管的软骨膜。软骨结构完整，未见坏死迹象。在将放射性元素植入生物体时，植入物的无菌性以及无菌操作过程对于避免感染和组织排斥至关重要。在组织生成后，有多种器官需要进行植入，这些器官均应保持无菌状态。遵循此操作流程可实现完全灭菌，同时不改变器官的主要特性。

low-dose-gamma-radiation-sterilization-for-decellularized-tracheal

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

低剂量伽马辐射灭菌治疗脱细胞气管移植物

干细胞鉴定领域正不断取得重大突破。然而，要转化这些发现，必须设计出新的细胞递送方法。本文报道了气道可作为干细胞移植到肺部的安全途径。...

气管切开术：一种将干细胞移植至肺部的方法

本视频展示了一种通过血管系统顺行灌注去污剂来制备脱细胞化细胞外基质（ECM）支架的方法。这些结构化的ECM支架随后可用于分析与心肺疾病相关的ECM重塑过程。...

心肺复合体脱细胞：一种用于小鼠模型心脏和肺脏脱细胞的技术

本文描述了一种从大鼠肠道制备无细胞基质的方法。肠道支架的构建对于组织工程、干细胞生物学以及药物测试等未来应用具有重要意义。...

一种用于制备天然去细胞肠道基质的脱细胞方法

全器官脱细胞技术可制备天然生物支架，用于再生医学。本文介绍了一种非人灵长类动物肺再生模型，其中完整肺脏在生物反应器中进行全器官脱细胞处理，随后接种成体干细胞和内皮细胞，该生物反应器可支持血管循环和液体培养基通气。...

非人灵长类动物肺脏脱细胞与再细胞化：基于专用大型器官生物反应器的方法

该方案可高效地将小鼠胚胎干细胞来源的定型内胚层诱导为成熟的气道上皮细胞。该分化技术在明确的无血清培养条件下，利用三维去细胞肺支架引导肺谱系特化。...

利用脱细胞肺支架生成胚胎干细胞来源的小鼠气道上皮细胞

移植物狭窄是组织工程气道替代物面临的关键障碍。为了研究导致狭窄的细胞机制，我们采用了一种经骨髓单个核细胞（BM-MNC）接种的组织工程气管替代小鼠模型。本文详细描述了我们的实验方案，包括支架制备、BM-MNC分离、移植物接种以及移植手术。...

在小鼠模型中接种与植入生物合成组织工程气管移植物

喉气管狭窄由病理性瘢痕沉积引起，导致气管气道严重狭窄，目前缺乏有效的药物治疗方法。利用PLLA-PCL（70%左旋聚乳酸和30%聚己内酯）支架作为局部药物递送系统，可研究旨在减少气管内瘢痕增生的潜在疗法。...

用于喉气管狭窄小鼠的生物相容性载药气管支架设计

本方案介绍了一种利用去细胞化大鼠肾脏制备支架的方法。该方案包括去细胞化和再细胞化过程，以验证其生物可利用性。去细胞化过程使用Triton...

大鼠脱细胞肾脏支架的制备

该方案描述了一种可进行成像的生物反应器，可用于选择性去除大鼠气管的内源性上皮，并在外源细胞接种后使其在管腔表面均匀分布，随后实现长期培养 体外...

成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

小鼠肺内气管移植（IPTT）模型对于研究肺移植后闭塞性气道疾病（OAD）具有重要价值。该模型可深入揭示同种异体移植后气道闭塞过程中肺特异性的免疫学和血管生成行为，且具有高度可重复性。本文中，我们描述了IPTT的操作步骤及其预期结果。...

小鼠肺内气管移植：肺移植后闭塞性气道疾病研究模型

本文介绍了利用脱细胞和再细胞化方法构建生物工程小鼠肺脏的技术，同时详细描述了后续的原位肺移植过程。...

利用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程化肺

了解低剂量伽马辐射灭菌技术用于脱细胞气管移植物的处理方法。本方案以新西兰白兔气管为模型，在保持器官生物力学特性的同时实现有效灭菌，为器官移植提供安全可靠的灭菌策略。

低剂量伽马辐射对脱细胞气管移植物的灭菌处理

探索更多视频