一种高效透明化方案用于研究番茄（Solanum lycopersicum L.）种子发育

该方法可帮助研究人员快速、轻松地发现番茄胚胎发育的异常时期。本实验方案的主要优势在于采用次氯酸钠处理番茄种子，为观察番茄胚胎提供了基础。首先进行化学试剂的配制，并在开花后3至23天（DAF）采集茄属植物（Solanum lycopersicum）果实。

立即将果实置于冰上，并根据开花后的天数将其分为早期、中期和晚期果实。取早期果实，将其打开，置于载玻片上，在体视显微镜1倍至4倍放大条件下，用精细镊子小心采集新鲜种子。对于中期和晚期果实，打开果实后直接用精细镊子采集新鲜种子。

在传统方法中，将 freshly 收集的种子立即转移至含有 1.5 毫升 FAA 固定液的 2 毫升离心管中，并将离心管置于摇床上，于室温下以 5 rpm 振荡 4 小时。随后在摇床上以 5 rpm 分别用 70%、95% 和 100% 乙醇各脱水 1 小时。完成后，将种子置于载玻片上已滴加的 3 至 5 滴透明溶液中，再轻轻加盖盖玻片。

对于中期和晚期种子，使用单个凹面载玻片。根据种子的发育阶段，在室温下孵育以进行透明处理。孵育后，使用配备数码相机的微分干涉相差（DIC）显微镜，在10倍、20倍和40倍放大倍数下观察样品。

针对每个样品实时调整并优化透射光亮度、微分干涉差（DIC）滑块和聚光镜孔径，并采集图像。将从破裂果实中采集的新鲜种子转移至含有1.5毫升消毒液的2毫升离心管中。在室温下，将样品置于摇床中以30 rpm振荡培养3至50分钟。

当最内层种皮轮廓清晰可见时，弃去消毒液。对于中期和晚期种子，将种子转移至载玻片上。在体视显微镜1倍至4倍放大倍数下，使用镊子和解剖针去除种子黏液。

用镊子将种子转移回原来的离心管中。加入1.5毫升去离子水，每次洗涤10秒，共洗涤五次，并弃去去离子水。接着，向种子中加入两倍体积的透明溶液。

根据种子所处的发育阶段，进行0至50分钟的间歇性真空处理，每次10分钟真空处理后间隔10分钟。真空处理结束后，更换透明溶液。为促进种子透明化，将离心管避光放置于室温下30分钟至7天。

对于晚期胚胎，每天更换一次溶液，使用新鲜的透明溶液，并将种子置于真空条件下处理10分钟。将透明后的种子置于载玻片或单凹载玻片上。使用配备数码相机的微分干涉差显微镜（DIC显微镜），针对每个样品实时调整并优化透射光亮度、DIC滑块以及聚光镜孔径，然后采集图像。

在传统的S.lycopersicum种子透明化方法中，致密的胚乳细胞阻碍了对授粉后3天和6天早期胚胎的观察。随着种子的生长，通透性降低，导致授粉后9天获得的图像模糊不清。种子黏液和种皮逐渐变得更加致密，从授粉后13天开始阻止了透明化试剂的渗透。

在14至19 DAF的种子中，尽管延长处理时间至七天，胚胎内部轮廓仍极为模糊。在22 DAF的种子中，内部结构完全不可见。从13 DAF开始，由种皮表皮细胞产生的去除了种皮的黏液层变得明显。

次氯酸钠处理能够清晰地识别内种皮，并在不损伤种子的情况下去除大部分附着的黏液。在优化的透明化方案中，种子在所有测试的发育阶段均表现出满意的透明度。观察到3 DAF时种皮的不同细胞层、5 DAF时可区分的胚乳细胞、7 DAF时棒状的胚、9 DAF时的球形期以及11 DAF时的心形期。

在优化后的实验方案中，子叶和茎尖分生组织的卷曲程度在胚胎发育的各个阶段均能被清晰捕捉。灭菌过程可去除种子黏液和种皮色素，从而增强种子的通透性和观察效果。真空处理可加速透明溶液的渗透。