Name: 一种用于研究番茄种子发育的有效清除方案（Solanum lycopersicum L.） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 了解番茄种子透明化方案，利用次氯酸钠处理Solanum lycopersicum种子，结合真空渗透与体视显微镜观察技术，清晰呈现胚胎发育各阶段形态特征，为植物发育生物学研究提供高效可视化工具。

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作者感谢乐杰博士和宋秀芬博士分别在微分干涉相差显微镜和传统透明化方法方面提供的有益建议。本研究由国家自然科学基金（31870299）和中国科学院青年创新促进会资助。图 2 使用 BioRender.com 制作。

1. 溶液的配制
<ol>
	<li>在50 mL离心管中加入2.5 mL 37%甲醛、2.5 mL冰醋酸和45 mL 70%乙醇，配制FAA固定液。涡旋混匀后于4 °C保存。使用前新鲜配制FAA固定液。 
	警告：37%甲醛具有腐蚀性，若接触或吸入可能具有致癌性。固定操作必须在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>在100 mL用锡箔纸包裹的玻璃瓶中加入5 mL 100%甘油、40 g水合氯醛和10 mL蒸馏水，配制透明溶液。室温下使用磁力搅拌器搅拌过夜至溶解。配制好的溶液可在4 °C保存最多6个月。 
	警告：水合氯醛具有致癌性且有强烈刺激性气味。实验应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。水合氯醛在空气中易潮解，不应大量储存。透明溶液遇光易分解，应避光保存。</li>
	<li>在50 mL离心管中加入10 mL 6%次氯酸钠、40 mL蒸馏水和50 µL Tween-20，配制消毒液。涡旋混匀后于室温保存。使用前新鲜配制消毒液。 
	注意：&#160;长期放置的次氯酸钠有效氯含量可能降低，可根据实际情况适当增加6%次氯酸钠的用量。&#160;</li>
</ol>
2. 种子采集
<ol>
	<li>在8 cm × 8 cm × 8 cm的方形育苗盆中播种番茄种子（S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom，参见材料表），盆中填充体积比为1:1的花卉营养土与基质混合物（v/v）（参见材料表），于培养室中培养，培养条件为：光照/黑暗周期16/8 h，白天温度24 ± 2 °C，夜间温度18 ± 2 °C，相对湿度60%–70%，光照强度4,000 Lux。约6周后，植株进入开花期。</li>
	<li>在花药散粉期（花瓣张开角度为90°）标记各单花的开花日期，并记录开花后天数（DAF）。</li>
	<li>采集开花后3至23天（DAF）的番茄果实，并立即置于冰上。将开花后3至23天的果实（种子或胚）分为早期（3–10 DAF）、中期（11–16 DAF）和晚期（17–23 DAF）三类。 
	注意：每次采集果实数量不宜过多，确保每个果实的种子在1小时内完成剥离，以便后续处理。</li>
	<li>对于早期果实，切开果实后置于载玻片上，在体视显微镜（参见材料表）1×至4×放大倍数下，使用精密镊子小心收集新鲜种子；对于中期和晚期果实，切开果实后可直接使用精密镊子收集新鲜种子。</li>
</ol>
3. 基于水合氯醛的种子透明化
注意：本研究比较了常规35与优化后的方案在种子透明化效率方面的表现。
<ol>
	<li>使用常规方案进行透明化处理
	<ol>
		<li>将新鲜种子（步骤 2.4 中获得）立即放入含有 1.5 mL FAA 固定液的 2 mL 离心管中，在摇床（5 rpm，参见材料表）上室温孵育 4 小时。</li>
		<li>在摇床（5 rpm）上依次使用 70%、95% 和 100% 乙醇（v/v）进行脱水处理，每步 1 小时。</li>
		<li>将种子置于载玻片上 3–5 滴透明化溶液（约 100 µL）中，轻轻加盖盖玻片。对于中期和晚期种子，更换为单凹载玻片（参见材料表）。</li>
		<li>根据种子材料的发育阶段，将这些载玻片或单凹载玻片在室温下放置 30 分钟（授粉后 3 天，3 DAF）、2 小时（6 DAF）、1 天（9 DAF）、3 天（12 DAF）或 7 天（14 至 22 DAF）（材料越幼嫩，透明化速度越快）。</li>
		<li>使用配备数码相机的微分干涉差显微镜（DIC 显微镜）（参见材料表），在 10×、20× 和 40× 放大倍数下观察样品。针对每个样品实时调节透射光亮度、DIC 滑块和聚光镜光圈，并采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用优化方案进行透明化处理
	<ol>
		<li>将新鲜种子（步骤 2.4 中获得）直接放入含有 1.5 mL 消毒液（步骤 1.3）的 2 mL 离心管中。 
		注：收集到 2 mL 离心管中的种子数量取决于种子的发育阶段。详细信息见表 1。</li>
		<li>在摇床（30 rpm）上室温孵育 3 至 50 分钟，直至最内层种皮轮廓清晰可见。弃去消毒液。 
		注：所需孵育时间取决于种子发育阶段（种子越成熟，所需孵育时间越长）。详细信息见表 1。</li>
		<li>对于中期和晚期种子，在体视显微镜下（1× 至 4× 放大倍数）用镊子和解剖针将种子转移至载玻片上，并去除种子黏液层，然后用镊子将种子重新转移回原离心管中。 
		注：此步骤对早期种子非必需。</li>
		<li>用 1.5 mL 去离子水清洗种子 5 次，每次 10 秒。弃去去离子水。</li>
		<li>加入体积为种子体积 2 倍的透明化溶液，随后使用真空泵（参见材料表）进行 0 至 50 分钟的真空处理（表 1）。采用间歇式真空处理，每次抽真空 10 分钟，间隔 10 分钟。</li>
		<li>更换为新鲜的透明化溶液（体积为种子体积的 2 倍）。将含有种子的 2 mL 离心管置于室温、避光条件下孵育 30 分钟至 7 天，以促进透明化（表 1）。在孵育期间，对于晚期胚，需每日更换新鲜透明化溶液，并对种子进行 10 分钟真空处理。</li>
		<li>将透明化完成的种子置于载玻片或单凹载玻片上，使用配备数码相机的 DIC 显微镜在 10×、20× 和 40× 放大倍数下观察。针对每个样品实时调节透射光亮度、DIC 滑块和聚光镜光圈，并采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Morley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+clearing+of+plant+leaves+by+NaOH+in+association+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen.</a> Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

与机械切片相比，透明化技术在三维成像方面更具优势，因其能够保持植物组织或器官的完整性16传统的透明化处理方案通常仅限于小样本，因为化学溶液更容易渗透。番茄种子是组织透明化处理中较难处理的样本，因其体积约为 拟南芥 种子大小不一，且具有更多的通透性屏障。 拟南芥 种皮由四到五层活细胞构成，这些细胞来源于外珠被和内珠被24。然而，与 拟南芥，番茄种皮在球形胚阶段有22-27层薄壁细胞6番茄种皮的最内层由栓皮质组成，被称为半透层，已被证实可阻碍水溶性化合物的移动38此外，富含多糖的种子黏液具有高黏度和显著较低的通透性，阻碍了透明溶液的渗透。番茄种子种皮中富含色素，也会降低成像质量。35,36,37历史上，色素的去除通...

番茄（S. lycopersicum L.）是全球最重要的蔬菜作物之一，2020年种植面积达510万公顷，产量达1.868亿吨肉质果实1。它属于包含约2716个物种的大型茄科（Solanaceae）家族2，该科还包括茄子、辣椒、马铃薯和烟草等多种具有重要经济价值的作物。栽培番茄为二倍体物种（2n = 2x = 24），基因组大小约为900 Mb3。长期以来，人们通过从野生茄属（Solanum spp.）植物中筛选优良性状，持续开展番茄的驯化与育种工作。番茄遗传资源中心列出了超过5000份番茄种质资源，全球保存的番茄种质材料超过8万份4。番茄在温室中为多年生植物，通过种子繁殖。成熟的番茄种子主要包括三个部分：发育完全的胚、残留的细胞型胚乳以及坚硬的种皮5,6（图1A）。双受精后，细胞型胚乳的发育早于合子的发育。在开花后约5–6天（DAF），当胚乳含有6至8个细胞核时，首次可观察到两细胞原胚7。在醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）中，胚在开花后20天左右达到最终大小，种子在开花后32天具备萌发能力8。随着胚的发育，胚乳逐渐被吸收，仅残留少量胚乳。残留胚乳包括包围胚根尖端的珠孔端胚乳，以及分布在种子其余部分的侧生胚乳9,10。外层种皮由珠被的外皮层增厚并木质化形成，与珠被残余的死亡组织层共同构成坚硬的外壳，以保护胚和胚乳5。
<img alt="胚胎横切面示意图；种子结构，含顶端分生组织、子叶、胚根、胚乳。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64445/64445fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1成熟种子的示意图 Solanum lycopersicum 和 拟南芥. (A成熟番茄种子的纵向解剖结构。B成熟个体的纵向解剖结构 拟南芥 种子。成熟的番茄种子大小约为一个 拟南芥 种子。比例尺 = (A) 400 µm, (B) 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64445/64445fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
高质量番茄种子的产生依赖于胚胎、胚乳与母体种子组分之间的协调作用11. 解析种子发育过程中的关键基因与调控网络，需要对突变体种子进行深入且全程的表型记录。传统的包埋切片技术，如半薄切片和石蜡切片，已广泛应用于番茄种子，以观察胚的局部精细结构12,13,14,15然而，通过薄切片分析种子发育过程通常费时费力，且缺乏z轴空间分辨率。相比之下，组织透明化是一种快速高效的方法，可精确定位最可能出现的胚胎发育缺陷阶段16该透明化方法通过使用一种或多种生物化学试剂均一化组织的折射率，从而降低内部组织的不透明性。16整体组织透明化技术可在不破坏植物组织完整性的前提下观察其结构，结合透明化技术与三维成像已成为获取植物器官形态与发育状态信息的理想方案17,18多年来，种子透明技术已应用于多种植物物种，包括 拟南芥, 大麦，以及 Beta vulgaris19,20,21,22,23其中，胚珠整体透明技术已成为研究种子发育的一种高效方法 拟南芥，由于其体积较小，种皮细胞有4-5层，且为核型胚乳24,25随着不同透明剂混合液的不断更新，例如Hoyer's溶液的出现26尽管大麦胚珠的胚乳占据了种子的大部分体积，仍能以较高清晰度成像其内部结构。通过透明化结合真空处理及盐酸软化，可观察到甜菜的胚胎发生过程。19然而，与上述物种不同，目前尚未见有关通过透明化方法对番茄种子进行胚胎学观察的报道，这阻碍了对番茄胚胎及种子发育过程的深入研究。
水合氯醛常用作透明剂，可使浸入的组织和细胞在不同光学平面上清晰显示，并能显著保存细胞或组织成分27,28,29水合氯醛透明法已成功用于种子整体透明化，以观察胚胎和胚乳结构 拟南芥21,28. 然而，这种透明化溶液在清除番茄种子时效率较低，因为番茄种子的透性比 拟南芥 种子。物理屏障包括：（1）番茄珠被在授粉后3至15天具有近20层细胞30,31，（2）番茄的胚乳为细胞型，而非核型32，且（3）番茄种子的体积大约是其他种子的70倍33,34 （4）产生大量种皮黏液，阻碍透明试剂的渗透，影响胚胎细胞的观察。
因此，本报告提出了一种基于水合氯醛的优化透明化方法，适用于不同发育阶段番茄种子的整体透明化处理，可实现对胚胎发育过程的深层成像（图2）。

<table><tbody><tr><td>1,000 &amp;micro;L 移液器</td><td>GILSON</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Corning</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>DAMAO</td><td>685-2013</td><td></td></tr><tr><td>5,000 &amp;micro;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3120000275</td><td></td></tr><tr><td>5,000 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>biosharp</td><td>BS-5000-TL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>BOYUAN</td><td>678-2002</td><td></td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>Fisher</td><td>FB800-100</td><td></td></tr><tr><td>水合氯醛</td><td>Meryer</td><td>M13315-100G</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Leica</td><td>384200</td><td></td></tr><tr><td>DIC 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager A1</td><td>10x、20x 和 40x 放大倍数</td></tr><tr><td>消毒剂</td><td>QIKELONGAN</td><td>17-9185</td><td></td></tr><tr><td>解剖针</td><td>Bioroyee</td><td>17-9140</td><td></td></tr><tr><td>花卉营养土</td><td>FANGJIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>HAIOU</td><td>4-94</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>BOYUAN</td><td>676-2007</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Solarbio</td><td>G8190</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>IKA</td><td>RET basic</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tom</td><td>Tomato Genetics Resource Center</td><td>LA3911</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-206</td><td></td></tr><tr><td>播种基质</td><td>PINDSTRUP</td><td>LV713/018-LV252</td><td>筛分：0–10 mm</td></tr><tr><td>单凹载玻片</td><td>HUABODEYI</td><td>HBDY1895</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Leica</td><td>3800381</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>S8 APO</td><td>1x 至 4x 放大倍数</td></tr><tr><td>锡箔纸</td><td>ZAOWUFANG</td><td>613</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>SHIDING</td><td>SHB-III</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Silogex</td><td>MX-S</td><td></td></tr></tbody></table>

一种高效透明化方案用于研究番茄（solanum lycopersicum l.）种子发育

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球主要的经济作物之一。番茄种子是研究植物繁殖过程中遗传学和发育生物学的重要模式材料。由于种皮黏液、多细胞层的珠被以及厚壁的胚乳等结构的存在，对番茄种子内部精细胚胎结构的观察常常受到阻碍，传统上需要通过繁琐的包埋切片技术来解决。一种更简便的替代方法是采用组织透明技术，利用化学试剂使种子几乎变得透明。尽管传统的透明化方法能够深入观察种皮较薄的小型种子，但番茄种子的透明化在技术上仍具挑战性，尤其是在发育后期阶段。
本文介绍了一种快速且省力的透明化方法，可用于观察番茄开花后3至23天的种子发育过程，此时胚胎形态已基本完成。该方法结合了在Arabidopsis中广泛使用的水合氯醛透明液，并进行了多项优化，包括省去福尔马林-乙酸-酒精（FAA）固定步骤、增加次氯酸钠处理种子、去除软化的种皮黏液层，以及清洗和真空处理。该方法适用于不同发育阶段番茄种子的高效透明化，有助于以良好的空间分辨率全面监测突变体种子的发育过程。此透明化方案也可应用于茄科其他具有重要经济价值物种的深层成像研究。

当番茄种子采用传统方法进行透明处理时 拟南芥，致密的胚乳细胞阻碍了对授粉后3天和6天早期番茄胚胎的观察（图3A,B）。随着胚胎总体积的增加，在授粉后9天（9 DAF）几乎难以分辨出球形胚胎。图3C）。然而，随着种子尺寸的持续增大，其通透性降低，导致在授粉后12天（12 DAF）时出现模糊的心形胚图3D）。从13 DAF开始，种子黏液和种皮逐渐变得致密，阻碍了透明剂的渗透。即使将处理时间延长至7天，14-19 DAF种子内部胚的轮廓仍极为模糊图3E-G）。在22天后授粉（DAF）的种子中，种子内部结构完全不可见（图 3H).
因此，对传统的基于水合氯醛的透明化方法进行了优...

番茄种子是研究植物繁殖过程中遗传学和发育生物学的重要模式材料。本方案适用于清除不同发育阶段的番茄种子，以观察更精细的胚胎结构。

一种高效透明化方案用于研究番茄（Solanum lycopersicum L.）种子发育

番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球主要的经济作物之一。番茄种子是研究遗传学和发育生物学的重要模式材料……

该方法可帮助研究人员快速、轻松地发现番茄胚胎发育的异常时期。本实验方案的主要优势在于采用次氯酸钠处理番茄种子，为观察番茄胚胎提供了基础。首先进行化学试剂的配制，并在开花后3至23天（DAF）采集茄属植物（Solanum lycopersicum）果实。立即将果实置于冰上，并根据开花后的天数将其分为早期、中期和晚期果实。取早期果实，将其打开，置于载玻片上，在体视显微镜1倍至4倍放大条件下，用精细镊子小心采集新鲜种子。对于中期和晚期果实，打开果实后直接用精细镊子采集新鲜种子。在传统方法中，将 freshly 收集的种子立即转移至含有 1.5 毫升 FAA 固定液的 2 毫升离心管中，并将离心管置于摇床上，于室温下以 5 rpm 振荡 4 小时。随后在摇床上以 5 rpm 分别用 70%、95% 和 100% 乙醇各脱水 1 小时。完成后，将种子置于载玻片上已滴加的 3 至 5 滴透明溶液中，再轻轻加盖盖玻片。对于中期和晚期种子，使用单个凹面载玻片。根据种子的发育阶段，在室温下孵育以进行透明处理。孵育后，使用配备数码相机的微分干涉相差（DIC）显微镜，在10倍、20倍和40倍放大倍数下观察样品。针对每个样品实时调整并优化透射光亮度、微分干涉差（DIC）滑块和聚光镜孔径，并采集图像。将从破裂果实中采集的新鲜种子转移至含有1.5毫升消毒液的2毫升离心管中。在室温下，将样品置于摇床中以30 rpm振荡培养3至50分钟。当最内层种皮轮廓清晰可见时，弃去消毒液。对于中期和晚期种子，将种子转移至载玻片上。在体视显微镜1倍至4倍放大倍数下，使用镊子和解剖针去除种子黏液。用镊子将种子转移回原来的离心管中。加入1.5毫升去离子水，每次洗涤10秒，共洗涤五次，并弃去去离子水。接着，向种子中加入两倍体积的透明溶液。根据种子所处的发育阶段，进行0至50分钟的间歇性真空处理，每次10分钟真空处理后间隔10分钟。真空处理结束后，更换透明溶液。为促进种子透明化，将离心管避光放置于室温下30分钟至7天。对于晚期胚胎，每天更换一次溶液，使用新鲜的透明溶液，并将种子置于真空条件下处理10分钟。将透明后的种子置于载玻片或单凹载玻片上。使用配备数码相机的微分干涉差显微镜（DIC显微镜），针对每个样品实时调整并优化透射光亮度、DIC滑块以及聚光镜孔径，然后采集图像。在传统的S.lycopersicum种子透明化方法中，致密的胚乳细胞阻碍了对授粉后3天和6天早期胚胎的观察。随着种子的生长，通透性降低，导致授粉后9天获得的图像模糊不清。种子黏液和种皮逐渐变得更加致密，从授粉后13天开始阻止了透明化试剂的渗透。在14至19 DAF的种子中，尽管延长处理时间至七天，胚胎内部轮廓仍极为模糊。在22 DAF的种子中，内部结构完全不可见。从13 DAF开始，由种皮表皮细胞产生的去除了种皮的黏液层变得明显。次氯酸钠处理能够清晰地识别内种皮，并在不损伤种子的情况下去除大部分附着的黏液。在优化的透明化方案中，种子在所有测试的发育阶段均表现出满意的透明度。观察到3 DAF时种皮的不同细胞层、5 DAF时可区分的胚乳细胞、7 DAF时棒状的胚、9 DAF时的球形期以及11 DAF时的心形期。在优化后的实验方案中，子叶和茎尖分生组织的卷曲程度在胚胎发育的各个阶段均能被清晰捕捉。灭菌过程可去除种子黏液和种皮色素，从而增强种子的通透性和观察效果。真空处理可加速透明溶液的渗透。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

一种用于研究番茄种子发育的有效清除方案（Solanum lycopersicum L.）

番茄分析仪：一种用于从二维物体中收集准确且详尽形态学与色度学数据的实用软件工具

Ice-Cap 方法可实现植物在96孔板中生长，并能对每株幼苗的根组织进行非破坏性采样。从这些根组织中提取的 DNA 可用于基因分型反应。我们发现，Ice-Cap 方法在拟南芥（Arabidopsis...

Ice-Cap：一种用于植物生长的高通量毛细管采样方法 拟南芥 在96孔板中培养番茄植株以实现高通量基因分型

介绍了两种不同的根结线虫植物筛选方法。所述方法包括以非破坏性方式对线虫进行高通量筛选，从而便于将这些植物用于育种项目。...

高通量与低通量根结线虫筛选 Meloidogyne spp.

来源： Hassan, J. A., 等 高通量鉴定抗性 Pseudomonas syringae pv. tomato 利用幼苗淹水法在番茄中进行检测。 J. Vis. Exp.

用于筛选番茄细菌抗性的幼苗淹水试验

本文介绍了一种通用的番茄根部转化方法，随后接种青枯劳尔氏菌（Ralstonia...

番茄根部转化后接种Ralstonia solanacearum以实现青枯病的简便遗传分析

幼苗淹水法可快速筛选野生番茄种质资源对Pseudomonas...

高通量抗性鉴定 丁香假单胞菌番茄致病变种 利用幼苗淹水法在番茄中进行检测

本文介绍一种简单的方法，用于直接观察和自动测量细菌侵染下拟南芥（Arabidopsis...

气孔响应的直接观察与自动测量 Pseudomonas syringae pv. 番茄 DC3000 在 拟南芥

鸡胚视网膜细胞培养是研究光感受器生物学的重要工具。我们开发了一种基于高效基因转导技术的方法 ex ovo...

用于原代细胞培养研究的鸡视网膜高效基因转导：一种 体外培养 电穿孔法

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。...

伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

本文介绍了凝胶收缩实验的建立及其应用，用于评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞的收缩功能。...

一种的开发 体外 评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

了解番茄种子透明化方案，利用次氯酸钠处理Solanum lycopersicum种子，结合真空渗透与体视显微镜观察技术，清晰呈现胚胎发育各阶段形态特征，为植物发育生物学研究提供高效可视化工具。

一种高效透明化方案用于研究番茄（Solanum lycopersicum L.）种子发育

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