Name: 从小鼠子宫建立3D子宫内膜类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 学习从小鼠子宫分离高纯度子宫内膜上皮细胞，利用酶解和机械分离法建立三维子宫内膜类器官培养体系。该方法可用于研究子宫内膜信号传导、再生机制及相关疾病治疗。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Stephanie Pangas博士和Martin M. Matzuk博士（M.M.M.）对本文稿的审阅与修改。本研究由Eunice Kennedy Shriver儿童健康与人类发育国家研究所资助，基金编号为R00-HD096057（D.M.）、R01-HD105800（D.M.）、R01-HD032067（M.M.M.）和R01-HD110038（M.M.M.），以及美国国家癌症研究所P30癌症中心支持基金（NCI-CA125123）。Diana Monsivais博士&#160;获得Burroughs Wellcome基金会颁发的下一代妊娠奖（Next Gen Pregnancy Award）。

小鼠操作和实验研究均依照贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》所制定的规范进行。
1. 使用酶法和机械法从小鼠中分离子宫上皮组织
注意：本节描述了利用凝胶基质支架建立、传代、冻存和复苏小鼠子宫内膜上皮类器官所需的步骤。既往研究表明，从小鼠动情期阶段获取的组织建立的小鼠子宫内膜类器官培养效果最佳4，动情期可通过阴道涂片的细胞学检查确定15。所有实验均使用成年雌性野生型小鼠（6–8 周龄，C57BL/6J 与 129S5/SvEvBrd 杂交品系）。小鼠依据 IACUC 批准的操作指南，经异氟烷麻醉后行颈椎脱位法人道处死。小鼠处死后，应按照以下步骤进行操作。有关本实验方案所用材料和溶液的详细信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>将凝胶基质置于冰上解冻约1-2小时后再使用。</li>
	<li>解剖小鼠时，使用剪刀在腹部中线处做一纵向切口，轻轻掀开皮肤以暴露下方的腹膜层。用镊子提起腹膜层，并用剪刀做横向切口以暴露腹腔内容物。
	<ol>
		<li>轻轻拨开腹部脂肪垫以定位子宫角。从宫颈连接处夹住子宫角，用剪刀沿肠系膜脂肪进行剪切分离。在完成小鼠子宫的解剖后，使用小剪刀彻底清除子宫角上的脂肪组织。 
		注意：细胞分离过程中需保持无菌，使用前对所有手术器械进行灭菌，用70%乙醇喷洒小鼠腹部，并在无菌细胞培养罩内进行解剖后的所有操作步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每侧子宫角切成若干小段，每段长约4-5 mm。</li>
	<li>将来自一个子宫的所有子宫组织碎片放入含有0.5 mL 1%胰蛋白酶的24孔板的一个孔中。让酶溶液进入子宫腔，以实现子宫内膜上皮与下方间质的酶解分离。</li>
	<li>将24孔板置于37 ˚C湿润的组织培养孵育箱中孵育约1小时。</li>
	<li>孵育1小时后，将子宫组织碎片转移至含有1 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的35 mm组织培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用精细镊子和1 mL移液枪通过机械方法将子宫上皮从子宫管中分离。用镊子夹住一段子宫组织的一端，将移液枪头沿组织纵轴轻轻滑动，从子宫管的另一端挤出上皮。在解剖显微镜下观察从子宫组织中分离出的上皮片层。</li>
	<li>使用1 mL移液器收集上皮细胞片，并轻柔地转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>对剩余的子宫组织片段重复上述步骤，将所有上皮细胞片转移至同一收集管中。</li>
	<li>通过离心以375 × g的离心力在5分钟内沉淀解离的上皮细胞片 g.</li>
	<li>小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于0.5 mL含2.5 mg/mL胶原酶和2 mg/mL DNase的溶液中，上下吹打约10次，或直至获得单细胞悬液。</li>
	<li>加入0.5 mL DMEM/F12 + 10% 胎牛血清（FBS）+ 抗生素，375 × g离心5分钟 g. 
	&#8203;注意：有关细胞培养中使用的广谱抗生素的更多信息，请参见 材料表.</li>
	<li>小心吸除上清液，将细胞重悬于 1 mL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素中。在 375 × g 条件下离心 5 分钟。 g.</li>
</ol>
2. 间质组分的处理
注意：本部分概述了分离小鼠子宫内膜基质区室所需的实验方案。鉴于上皮/基质共培养实验日益受到关注，除能够生成类器官的上皮细胞外，对基质细胞群体进行处理也至关重要。
<ol>
	<li>当所有上皮组织已通过酶解和机械方法从子宫碎片中分离后，剩余的管状结构即为&#34;间质/子宫肌层&#34;组分。将此组织收集至含有2.5 mg/mL胶原酶和2 mg/mL DNase的HBSS溶液中。</li>
	<li>将间质/子宫肌层样本置于37 ˚C摇床中孵育15分钟。</li>
	<li>孵育结束后，每只小鼠加入500 µL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素，并通过40 µm细胞滤网过滤未解离的组织碎片。</li>
	<li>以375 × g 离心5分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素中，然后逐滴加入含10 mL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素的10 cm细胞培养皿中。将培养皿置于37 ˚C、湿润的细胞培养箱中孵育。</li>
	<li>为建立小鼠子宫内膜上皮细胞与间质细胞的共培养体系，可参照人子宫内膜类器官所描述的方法，采用无支架或胶原基质系统6,8。 
	&#8203;注意：尽管这些技术尚未在小鼠中正式发表，但可根据已发表的人子宫内膜方案进行适当调整。</li>
</ol>
3. 将子宫上皮包埋于凝胶基质中以建立类器官
注意：在准备使用前，应将凝胶基质保持在冰上。
<ol>
	<li>移去上清液，将细胞沉淀重悬于体积为细胞沉淀20倍的凝胶基质中（例如，若细胞沉淀为20 µL，则加入400 µL凝胶基质重悬细胞）。轻轻重悬沉淀，避免产生气泡。</li>
	<li>让凝胶基质/细胞悬液在室温下静置约10分钟。</li>
	<li>当凝胶基质/细胞悬液变为半固体凝胶后，使用带有宽口200 µL吸头的P200微量移液器轻柔吸取25 µL凝胶基质/细胞悬液。在12孔板的每个孔中分别加入三个25 µL的液滴，置于37 ˚C、湿润的组织培养孵箱中孵育15分钟，使凝胶基质充分固化。</li>
	<li>凝胶基质固化后，向每孔含有凝胶基质半球的孔中加入750 µL类器官培养基。在37 ˚C、湿润的组织培养孵育箱中孵育。 
	&#8203;注意：类器官培养基配方见文末 材料表类器官通常在初始培养后4天内形成。</li>
</ol>
4. 雌二醇处理后子宫内膜类器官的基因表达分析
注意：本节描述了使用实时定量聚合酶链式反应（qPCR）对经雌二醇（E2；见表1）处理后的子宫内膜上皮类器官进行基因表达谱分析的方法。由于子宫内膜受卵巢激素E2的周期性调控，检测类器官对E2的反应性是评估其生理功能的重要指标。我们已从子宫内膜上皮类器官中获得了高质量的RNA，并制备了足量的mRNA，可用于qPCR和/或RNA测序进行基因表达谱分析。本节介绍如何收集类器官并对其进行处理，以用于后续的基因表达分析。所选的处理培养基反映了用于培养子宫内膜细胞的常用培养基。然而，应注意的是，该处理培养基可根据具体实验需求进行优化，如同在人子宫内膜三维培养物的激素处理中所进行的优化8,16,17。
<ol>
	<li>按照上述方法培养子宫内膜类器官。</li>
	<li>接种后第四天，移除类器官培养基，并替换为 750 µL 饥饿培养基。过夜孵育。</li>
	<li>次日早晨，移除饥饿培养基，加入含载体或 10 nM E2 的处理培养基 750 µL。孵育 48 小时。</li>
	<li>按照试剂盒制造商提供的说明书进行 RNA 提取。</li>
</ol>
5. 子宫内膜类器官的组织学分析
注意：对子宫内膜类器官的形态特征进行成像，对于评估生长因子、基因操作或小分子抑制剂的细胞效应至关重要。本节介绍用于固定、处理和成像子宫内膜上皮类器官的技术，包括组织学染色和抗体免疫荧光染色方法。
<ol>
	<li>准备含有1 mL 4%多聚甲醛（溶于1× PBS）的1.5 mL微量离心管，置于冰上。</li>
	<li>吸除含有类器官的12孔板各孔中的培养基。</li>
	<li>使用剪去尖端的1 mL移液枪头，向每个孔中加入500 µL 4%多聚甲醛，并轻轻将凝胶基质圆顶从孔底脱离。</li>
	<li>轻柔地将整个凝胶基质圆顶吸入移液枪头，并转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>将类器官置于4 ˚C旋转仪上过夜，进行固定。</li>
	<li>次日早晨，以600 × g 离心5分钟，使类器官沉淀。用移液器小心吸除4%多聚甲醛溶液并弃去。用70%乙醇洗涤类器官两次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将管中乙醇保留50–100 µL，其余弃去。将离心管暂置一旁。</li>
	<li>将一管组织处理胶置于水浴中，微波加热约30秒以融化胶体。注意观察胶体状态，防止其沸腾溢出。 
	注意：组织处理胶融化后，若未过热沸腾，应迅速操作以包埋类器官。</li>
	<li>转移足量的组织处理胶以完全覆盖模具表面（约250 µL）。</li>
	<li>在组织处理胶仍处于熔融状态时，迅速将含有类器官的50 µL 70%乙醇溶液转移至模具中。确保类器官沉入或被推至模具底部区域。</li>
	<li>将组织学模具置于盛有冰的容器上，使组织处理胶冷却并凝固。</li>
	<li>待组织处理胶完全凝固后，小心将凝固的胶块转移至标本袋中，并记录类器官所在平面位置。</li>
	<li>将标本袋放入组织学包埋盒中，采用常规组织固定与石蜡包埋的标准方法进行处理18。</li>
	<li>固定并石蜡包埋后，使用切片机切成5 µm厚的切片19。随后按照下文所述步骤进行常规苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色或免疫染色。</li>
</ol>
6. 苏木精 &amp;#38; 伊红染色
<ol>
	<li>脱蜡处理切片，步骤如下：二甲苯，2 次，每次 10 分钟；100% 乙醇，2 次，每次 3 分钟；80% 乙醇，3 分钟；60% 乙醇，3 分钟；dH2O，2 次，每次 3 分钟；苏木精染色 1 分钟；自来水冲洗（3 次，每次 5 秒）；伊红染色 1 分钟。</li>
	<li>脱水处理切片，步骤如下：60% 乙醇，3 分钟；80% 乙醇，3 分钟；95% 乙醇，3 分钟；100% 乙醇，2 次，每次 3 分钟；二甲苯，2 次，每次 15 分钟。</li>
	<li>使用封片介质封片。</li>
</ol>
7. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>按照步骤 6.1 所述方法对切片进行脱蜡。</li>
	<li>进行抗原修复
	<ol>
		<li>将载玻片浸入耐微波容器中的抗原修复液中。</li>
		<li>高火微波加热 20 分钟，每 5 分钟暂停一次，以防止溶液沸腾溢出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成 20 分钟抗原修复后，将载玻片继续浸没于抗原修复缓冲液中，在冰上冷却 40 分钟。</li>
	<li>用 1× TBST 洗涤载玻片 3 分钟。</li>
	<li>用含 3% BSA 的 TBST 在室温下孵育 1 小时，以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>用含 3% BSA 的 TBST 稀释一抗（稀释比例为 1:50–1:1,000，具体取决于抗体）。</li>
		<li>在湿盒中 4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>用含 3% BSA 的 TBST（1:250 稀释）或 5% 正常驴血清稀释二抗。</li>
		<li>由于二抗偶联了荧光染料，需在避光条件下室温孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞核染色
	<ol>
		<li>将 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用 TBST 按 1:1,000 稀释。</li>
		<li>室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>用 TBST 洗涤 2 次，每次 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封片
	<ol>
		<li>取一滴封片剂将盖玻片封固。</li>
		<li>次日用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文描述了从小鼠子宫内膜建立子宫内膜上皮类器官的方法，以及常规用于其后续分析的实验方案。子宫内膜类器官是研究调控子宫内膜相关疾病（如子宫内膜异位症、子宫内膜癌和着床失败）机制的有力工具。2017年发表的几项里程碑式研究报道了从小鼠和人类上皮组织培养长期可传代且可再生的子宫内膜类器官的培养条件。4,5尽管类器官已被广泛用于研究其他系统中的生物学通路，但对子宫内膜组织的研究 体外 由于缺乏合适的模型来在培养条件下研究未转化的原代上皮组织，相关研究受到限制26利用通常用于培养其他器官组织（如肠道、肾脏和肺）类器官的条件，并将人和小鼠子宫内膜来源的子宫内膜类器官包埋于由凝胶基质组成的细胞外基质支架中，成功建立了子宫内膜类器官4自这些初步报道以来，科学界使用子宫内膜类器官研究子宫内膜生物学的现象已显著增加。
通过改进先前发表的小鼠子宫上皮分离方法<sup clas...

子宫内膜——子宫腔内层的黏膜组织——是一种独特且高度动态的组织，在女性生殖健康中发挥着关键作用。在生殖生命周期中，子宫内膜可在卵巢激素雌激素和孕激素的协同调控下，经历数百次的增殖、分化与脱落循环。通过对基因工程小鼠的研究，科学家揭示了子宫内膜对激素反应的基本生物学机制，以及胚胎着床、基质细胞蜕膜化和妊娠过程的调控机制1. 体外 然而，由于在传统二维细胞培养中难以维持未转化的原代小鼠子宫内膜组织，相关研究一直受到限制2,3近年来，子宫内膜组织以三维类器官（organoid）形式进行培养的技术取得了新进展，为研究调控子宫内膜细胞再生与分化的生物学通路提供了全新机遇。目前已利用包埋于不同基质中的纯子宫内膜上皮细胞，建立了小鼠和人类的子宫内膜类器官体系。4,5，而人类子宫内膜已被培养成无支架的上皮/间质共培养体系6,7，以及最近开发的胶原包封上皮/间质类组装体8上皮类器官培养物的生长与再生潜能依赖于一组经经验确定的生长因子和小分子抑制剂的特定组合，该组合可最大程度地促进类器官的生长与再生4,5,9此外，子宫内膜类器官的冻存与复苏能力使得小鼠和人类的子宫内膜类器官可长期保存，以供未来研究使用。
基因工程小鼠揭示了调控早期妊娠和蜕膜化的复杂信号通路，并已被用作妊娠丢失、子宫内膜癌和子宫内膜异位症的研究模型。这些遗传学研究主要通过在雌性生殖组织中特异性表达的Cre重组酶，实现对loxP位点侧翼等位基因（&#34;floxed&#34;）进行细胞特异性敲除而完成。这类小鼠模型包括广泛使用的孕酮受体-cre10，其在子宫内膜上皮和间质组织中具有强效的重组酶活性；乳铁蛋白i-cre，可在成年小鼠中诱导子宫内膜上皮的基因重组11；以及Wnt7a-cre，可在苗勒氏管来源的组织中触发上皮特异性基因删除12。将基因工程小鼠模型的子宫内膜组织以三维类器官形式进行培养，为研究子宫内膜生物学特性提供了极佳平台，并有助于鉴定调控子宫内膜细胞更新与分化的生长因子及信号通路13,14。已有文献描述了小鼠子宫内膜组织的分离与培养方法，报道了采用多种酶解策略分离子宫上皮组织，进而用于培养子宫内膜上皮类器官4。尽管既往研究为子宫内膜上皮类器官的培养提供了重要的技术框架4,5,6，本文则提供了一种清晰、全面的方法，用于此类类器官的建立、维持、处理与分析。标准化这些技术对于推动女性生殖生物学领域的进步至关重要。本文报道了一种详细的实验方法，通过酶解与机械法联合纯化小鼠子宫内膜上皮组织，继而在凝胶基质支架中培养子宫内膜类器官。同时，我们还描述了对凝胶基质包埋的小鼠子宫内膜上皮类器官进行下游组织学与分子分析的技术方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;类器官培养基配方&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;终浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，*无LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>100%</td></tr><tr><td>牛胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&amp;trade; 补充剂（50X），不含维生素A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>ALK-4、-5、-7 抑制剂 A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>重组人 EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>重组人 Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>重组人 Rspondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>重组人 FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>重组人 HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R&amp;D systems</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他耗材与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;终浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>梭菌胶原酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/mL</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS，无钙、无镁</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS，无钙、无镁</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&amp;nbsp;聚苯乙烯微孔板（24孔）</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&amp;nbsp;聚苯乙烯微孔板（12孔）</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛，40 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep（50 &amp;micro;g）</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，含 HEPES，无酚红</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，炭吸附处理</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td>2%</td></tr><tr><td>雌二醇（E2）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>甲醛水溶液（16%），电镜级</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4%</td></tr><tr><td>Epredia 组织包埋盒（单槽）</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia 不锈钢包埋模具</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200 proof（100%）</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Permount 封片介质</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Epredia 尼龙活检袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel 组织处理凝胶</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>优质苏木精溶液</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y（微黄色）溶液，优质</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS 缓冲液，20X，pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST（10X），pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>柠檬酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>3%</td></tr><tr><td>DAPI 溶液（1 mg/mL）</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>VWR 显微盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 抗体（TROMA-I）&amp;nbsp;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&amp;nbsp;</td><td>1:50 稀释</td></tr><tr><td>Vimentin 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗&lt;br/&gt; Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>1:250 稀释</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG（H+L）高交叉吸附二抗&lt;br/&gt; Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>1:250 稀释</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 体视显微镜</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 倒置常规显微镜，带数码相机</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物序列&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;正向（5'-3'）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;反向（5'-3'）&lt;/strong&gt;</td><td>_</td></tr><tr><td>脂质运载蛋白2（Lcn2）</td><td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>乳铁蛋白（Ltf）</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td><td>ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC</td><td></td></tr><tr><td>孕酮受体（Pgr）</td><td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATCATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）</td><td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCACCTTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠子宫建立三维子宫内膜类器官

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

子宫内膜组织衬于子宫内腔，受雌激素和孕激素的周期性调控。该组织由腔上皮和腺上皮、间质区室、血管网络以及复杂的免疫细胞群体组成。小鼠模型已成为研究子宫内膜的有力工具，揭示了调控胚胎着床、胎盘形成及癌症发生的关键机制。近年来发展的三维子宫内膜类器官培养技术，为解析子宫内膜生物学背后的信号通路提供了前沿模型。利用基因工程小鼠模型建立子宫内膜类器官，分析其转录组，并在单细胞分辨率下观察其形态，是研究子宫内膜疾病的重要手段。本文概述了从小鼠建立子宫内膜上皮三维培养的方法，并描述了定量基因表达及分析类器官组织学的技术。目标是提供一种可用于建立、培养并研究子宫内膜上皮类器官基因表达与形态特征的资源。

小鼠子宫内膜类器官的相差显微图像 
我们按照所附方案（参见示意图）所述，从野生型小鼠子宫内膜上皮建立了类器官。 图 1）。在小鼠子宫内膜上皮经酶解离后，通过机械方法将上皮片层与子宫基质细胞分离，并进一步使用胶原酶解离以获得单细胞悬液。若操作正确，这种上皮与基质细胞分离方法应能确保样品中异型细胞（即相反细胞类型）的污染率不超过10%-15%（参见免疫荧光图像于 图 2）。随后，将上皮细胞沉淀重悬于凝胶基质中，在室温下使其凝胶化，并铺板至25 &#181;将组织培养板上的凝胶基质圆顶。待凝胶基质圆顶凝固后，覆盖以类器官培养基并允许其生长。我们通常观察到，子宫内膜上皮细胞在3-4天内组装形成类器官，如图所示。 图 3类器官在培养中维持，每3天更换一次培养基，每5-7天进行一次传代。
小鼠子宫内膜类器官的组织学与免疫荧光染色成像<br ...

本方案描述了建立小鼠子宫内膜上皮类器官以进行基因表达和组织学分析的方法。

子宫内膜组织衬于子宫内腔，受雌激素和孕激素的周期性调控。该组织由……组成。

本方案具有重要意义，因为它展示了从小鼠子宫中分离高纯度子宫上皮以培养子宫内膜类器官的逐步方法。该方法高效地利用酶消化和机械解离来分离子宫上皮。相关技术经过优化，可用于建立、处理和分析源自分离上皮的子宫内膜上皮类器官。使用前，先将凝胶基质置于冰上解冻约一至两小时。然后用剪刀在小鼠腹部中线处做切口，解剖已处死的小鼠，轻轻剥离皮肤以暴露下方的腹膜层。通过轻轻移开腹部脂肪垫来定位子宫角，并在子宫颈连接处夹住子宫角，然后沿肠系膜脂肪进行切割。在分离小鼠子宫后，使用小剪刀彻底去除子宫角上的脂肪组织。完成后，将每个子宫角切成若干小片段，每段长约四至五毫米。将一个子宫的所有片段放入24孔板的一个孔中，孔内含有0.5毫升1%胰蛋白酶溶液。然后将24孔板置于37摄氏度、加湿的组织培养箱中孵育约一小时，以通过酶促反应使子宫内膜上皮与下方的基质分离。孵育结束后，将子宫组织碎片转移至含有1毫升杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate buffered solution，DPBS）的35毫米组织培养皿中。接着，在解剖显微镜下用镊子夹住一段子宫组织的一端，用移液器枪头沿组织纵轴轻轻刮擦，将上皮从子宫管的另一端挤压出来，从而分离子宫上皮与子宫管。然后在解剖显微镜下观察从子宫片段中分离出的上皮细胞层。接着，使用1毫升移液器将所有上皮细胞层轻柔地转移至同一个1.5毫升离心管中。并通过在375 × g条件下离心5分钟，使解离的上皮细胞层形成沉淀。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于 0.5 毫升含 2.5 毫克/毫升胶原酶和 2 毫克/毫升 DNA 溶液的溶液中。上下吹打约 10 次，或直至形成单细胞悬液。接着，加入 0.5 毫升 DMEM F/12 培养基，含 10% 胎牛血清（FBS）及抗生素，然后在 375 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL DMEM/F12培养基中，其中添加10% FBS和抗生素，然后离心细胞。将凝胶基质置于冰上直至使用。接着，弃去离心后细胞的上清液，用相当于凝胶基质体积20倍的溶液重悬细胞沉淀，注意避免产生气泡。将凝胶基质细胞悬液在室温下静置约10分钟。待凝胶基质细胞悬液形成半固体凝胶后，使用带有宽口200微升吸头的P200移液器，轻柔吸取25微升凝胶基质细胞悬液。在12孔板的每个孔中分别加入三个独立的25微升凝胶液滴，然后将板置于37摄氏度、湿润的组织培养孵育箱中，使凝胶基质固化15分钟。凝胶基质固化后，向每个含有凝胶基质半球的孔中加入 750 µL 类器官培养基，并在 37 °C、湿润的组织培养孵箱中孵育。小鼠子宫内膜类器官的相差显微图像显示，上皮细胞与间质细胞的分离所获得的样本中，相反细胞类型的污染不超过 10% 至 15%。子宫内膜上皮细胞在 3 至 4 天内组装形成类器官。通过苏木精和伊红染色观察经福尔马林固定、石蜡包埋的子宫内膜类器官切片，可见单层上皮结构及中空的腔体，即类器官的管腔。荧光显微镜成像显示，类器官中的所有细胞均表达细胞角蛋白8（Cytokeratin 8）并含有DAPI，表明子宫内膜类器官的固定、包埋和处理过程适用于基于抗体的免疫荧光染色。实时定量PCR结果显示，经10纳米浓度雌二醇刺激后，上皮类器官中脂质运载蛋白2（lipocalin 2）、乳铁蛋白（lactoferrin）以及孕酮受体的表达水平升高，表明子宫内膜上皮类器官可成功用于检测雌二醇刺激下基因表达的变化。在机械解离步骤中，确保获得子宫内膜上皮的清晰分离非常重要。应能够观察到上皮组织从子宫管中分离出来。其他方法包括将上皮细胞包埋于凝胶基质中以建立上皮类器官。如有需要，可对间质组分进行进一步消化，以建立三维上皮-间质共培养体系。该方法有助于解答关于子宫内膜再生调控信号的科学问题，并有望用于治疗女性相关疾病，如子宫内膜异位症、妊娠丢失和癌症。

establishing-3d-endometrial-organoids-from-the-mouse-uterus

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从小鼠子宫建立3D子宫内膜类器官

通过将子宫组织自体移植至肠系膜动脉级联，对小鼠和大鼠进行子宫内膜异位症手术诱导的描述。...

通过子宫组织自体移植建立手术诱导型子宫内膜异位症小鼠模型

本文介绍了一种生成人原代子宫内膜类器官的方案，该类器官包含上皮细胞和间质细胞，并保留了天然子宫内膜组织的特性。本方案详细描述了从子宫组织获取到子宫内膜类器官组织学处理的全过程。...

人原代子宫内膜类器官的多细胞生成

许多子宫内膜异位症的啮齿类动物模型受限于技术复杂性、可重复性差，和/或需要使用免疫缺陷动物或特殊报告基因小鼠。我们提出了一种简化的病灶诱导系统，该系统可应用于任何实验小鼠，具有独立可验证的客观评分系统，且无需进行卵巢切除术或存活手术。...

使用自然动情周期小鼠建立同系小鼠子宫内膜异位症模型

本研究介绍了一种专门设计用于模拟子宫内膜异位囊肿（一种具有重要临床意义的子宫内膜异位症亚型）的新型小鼠模型。该模型采用C57BL/6J小鼠，旨在阐明与子宫内膜异位囊肿相关不孕的病理生理机制，为填补生殖医学领域当前的知识空白提供一种优化的研究工具。...

建立子宫内膜异位囊肿小鼠实验模型以研究其相关不孕症

本文介绍一种分离和培养大鼠子宫内膜上皮干细胞（reESCs）并建立大鼠子宫内膜类器官的实验方案。该方法有助于 体外...

由大鼠子宫内膜上皮干细胞生成并表征大鼠子宫类器官

本文介绍了一种通过在1-3分钟内向小鼠子宫内注射95%乙醇，以制备出可靠且可重复的薄型子宫内膜的详细方案，该方法具有极低的死亡率和最少的宫腔粘连。...

建立小鼠薄型子宫内膜模型

该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立，到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的遗传特征，再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内...

由小鼠输卵管上皮细胞建立类器官系用于高级别浆液性卵巢癌建模

本方案描述了一种基于明确成分水凝胶的方法，可在可控的三维培养系统中生成模拟乳腺形态发生关键特征的人类乳腺类器官。...

一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程

玻璃体内注射是视觉科学研究中用于眼部疾病或局部治疗直接给药的常用技术。本视频展示了一种使用1...

建立眼病模型的玻璃体腔注射法

本文介绍了一种从野生啮齿类动物皮肤和肺组织中分离并维持原代成纤维细胞培养物的实验方案。...

建立来自啮齿类动物的原代成纤维细胞培养物

学习从小鼠子宫分离高纯度子宫内膜上皮细胞，利用酶解和机械分离法建立三维子宫内膜类器官培养体系。该方法可用于研究子宫内膜信号传导、再生机制及相关疾病治疗。

从小鼠子宫建立三维子宫内膜类器官

探索更多视频