用于使用受激拉曼散射显微镜进行延时活细胞成像的柔性腔室

灵活的环境室技术可实现延时摄影，如SRS成像，并在手术显微镜架上进行透射信号检测。SRS显微镜使用高数值孔径物镜和高端聚光镜，仅留下几毫米的间隙，而传统腔室无法容纳。灵活的腔室解决了这个问题。

使用SRS显微镜的研究人员可以很容易地采用这种技术。柔性室也可用于解剖或无菌显微镜，以将标本保持在最佳生理条件下。首先，使用光学台上的记号笔标记SRS显微镜架和电动载物台的支脚位置。

从光学台上取下显微镜架和载物台后，将硅橡胶片放在工作台上。用刀沿着标记切割硅橡胶。取出小橡胶片，然后将方形云母陶瓷片放入相同的位置。

然后将显微镜架和载物台移回光学台，并沿着标记线小心地将脚对准云母陶瓷片。重新对准SRS光路后，使用五块大型聚碳酸酯板将环境外壳组装在隔热基础的顶部，以覆盖整个显微镜框架。使用铝箔胶带密封盒子的边缘和接口。

将柔性管道软管连接到外壳盒的入口和出口，以允许由加热器模块泵送和控制的循环、温暖的气流。使用三个固定螺钉将机加工的空心圆柱形铝片1安装到物镜的鼻片上。接下来，使用四个螺钉将机加工的空心圆柱形铝片 2 安装到样品架上。

将带有铝片 2 的样品架安装到电动载物台上，并使用螺钉安装。将天然橡胶膜套放在两个机加工铝片之间，并在两端使用橡皮筋安装。使用适当的管道和连接器将压缩的 CO2 气瓶连接到气体混配器模块。

将 CO2 输入压力设置为 20 至 25 psi。使用内置的 CO2 传感器和控制器，确保空气混合器模块可以调节 5% 的 CO2 并将其混合到气流中。使用在线过滤器清理气流。

使用适当的管道和连接器，将混合空气引导到放置在加热板上的预灭菌水瓶，然后将加湿的空气引导到柔性腔室。将加热板设置为 37 摄氏度。在温水中冒泡气流以增加气流的湿度。

通过卸下螺钉将机器铝片 2 与样品架断开连接。用70%乙醇擦拭柔性室的所有部分，包括鼻梁、样品架和水浸物镜。使用放置在机柜中的紫外线灯对整个机柜系统进行 20 到 30 分钟的净化。

然后装入细胞培养皿。取下盘子的盖子并使用夹子将其固定。将物镜降低到细胞培养基中进行粗聚焦。

降低铝片2以封闭柔性室，并使用螺钉将其安装到样品架上。然后插入传感器。将空气供应设置为5%CO 2和19%O 2，用于正常细胞培养，气流速率为每分钟200立方厘米，温度为37摄氏度。

将激光波长调谐到 805 纳米，以瞄准 2， 854 厘米的逆拉曼位移，这归因于 CH2 化学键的振动。使用低激光功率来减少对细胞的光损伤。使用软件主控制面板上的对焦按钮调整和聚焦物镜，以实现细胞的良好SRS成像。

要执行快速对焦，请在配置面板上将像素数设置为 512 x 512 像素，像素停留时间为 4.8 微秒。实现良好对焦后，将成像分辨率设置为 2048 x 2048 像素，以获得 175 微米的平方视场，以采集高质量图像。检查主控制面板上的保存功能，并在通道面板上检查SRS通道。

在主控制通道上将两帧之间的间隔时间设置为 180 秒。将采集编号设置为 480，以便在 24 小时内进行延时成像。使用主控制面板上的循环功能开始自动成像采集。

评估了用于延时SRS成像的柔性腔室系统的性能。显微镜环境外壳内的温度达到预期的37摄氏度，对室温没有显着影响。柔性腔室内的温度在1.5小时内达到37摄氏度，并稳定保持至少24小时。

柔性腔室的相对湿度在一小时内达到85%，并且可以保持至少24小时。活的SKOV3细胞的延时SRS成像显示细胞内脂滴的快速和活跃运动，时间分辨率为三分钟。在24小时的成像结束时，细胞仍然显示出正常的形态和密度，表明细胞是健康的。

接下来，对用油酸处理的SKOV3细胞进行成像，并在10小时内跟踪脂滴积累。使用脂滴与细胞体面积比和脂滴的总SRS强度来量化脂滴量。结果表明，脂滴的量在10小时内持续增加。

还展示了脂质液滴的同时正向SRS成像和用荧光染料DND-189标记的溶酶体的后向两个光子荧光成像。观察到脂滴和溶酶体的共定位程度非常低。尝试此协议时，请记住，焦点漂移是活细胞成像中的常见问题。

在大约两个小时的延时成像后，可能需要重新聚焦。延时SRS成像在其开发后已被用于各种研究，以跟踪活细胞中无标记分子或带有拉曼文本的标记分子。