用于受激拉曼散射显微镜时间序列活细胞成像的柔性腔室

灵活的环境培养室技术能够在手术显微镜框架上实现基于透射信号检测的实时SRS成像。SRS显微镜采用高数值孔径物镜和高倍聚光镜，仅留下几毫米的间隙，传统培养室无法适配。灵活的培养室解决了这一问题。

使用SRS显微镜的研究人员可轻松采用该技术。该柔性腔室也可用于解剖显微镜或无菌显微镜，以在最佳生理条件下维持样本。首先，使用记号笔在光学平台上标记SRS显微镜框架和电动载物台支脚的位置。

从光学平台上取下显微镜框架和载物台后，将硅橡胶片平铺在平台上。使用刀具沿标记裁剪硅橡胶片。移除小块橡胶碎片，并将方形云母陶瓷片放置到相同位置。

然后将显微镜框架和载物台移回光学平台，并小心地将脚部沿标记线对准云母陶瓷片。重新调整SRS光路后，将环境封闭装置组装到隔热基座上方，以覆盖整个显微镜框架，使用五块大型聚碳酸酯板。使用铝箔胶带密封箱体的边缘和接缝处。

将柔性导管连接到 enclosure box 的进风口和出风口，以实现由加热模块泵送和控制的循环暖风流动。使用三个紧定螺钉将加工好的空心圆柱形铝件1固定在物镜的鼻部。接下来，使用四个螺钉将加工好的空心圆柱形铝件2固定在样品 holder 上。

将带有铝片2的样品架安装到电动载物台上，并用螺丝固定。将天然橡胶薄膜套筒置于两个加工好的铝片之间，并在两端使用橡皮筋固定。使用合适的管路和接头将压缩CO2气瓶连接至气体混合模块。

将 CO2 输入压力设置在 20 至 25 psi。使用内置的 CO2 传感器和控制器，确保空气混合模块能够调节并将 5%CO2 混入气流中。使用管路过滤器对气流进行净化。

使用合适的管路和连接件，将混合空气引导至放置在加热板上的预灭菌水瓶，再将加湿后的空气导入柔性培养室。将加热板温度设定为 37 摄氏度。使气流在温水中鼓泡，以增加气流的湿度。

通过拧下螺丝，将机器的铝制部件2与样品架分离。使用70%乙醇擦拭柔性腔室的所有部件，包括鼻部组件、样品架和浸水物镜。将紫外灯置于腔室内照射20至30分钟，对整个封闭系统进行去污染处理。

然后加载细胞培养皿。取下培养皿盖，并使用夹具将其固定。将物镜浸入细胞培养液中进行粗调焦。

将铝制部件2向下移动以封闭柔性腔室，并使用螺丝将其固定到样品架上。然后插入传感器。设置气源，其中含5%CO2和19%O2，用于正常细胞培养，气流速率为每分钟200立方厘米，温度设为37摄氏度。

将激光波长调节至805纳米，以靶向2,854厘米⁻¹的反斯托克斯拉曼位移，该信号源于CH₂化学键的振动。使用低激光功率以减少对细胞的光损伤。通过软件主控面板上的聚焦按钮，调节并聚焦物镜，以获得良好的受激拉曼散射（SRS）细胞成像。

为实现快速聚焦，在配置面板上将像素数设置为 512 × 512 像素，像素驻留时间为 4.8 微秒。完成良好聚焦后，将成像分辨率设置为 2048 × 2048 像素，视场为 175 平方微米，以获取高质量图像。在主控制面板上勾选保存功能，并在通道面板上勾选 SRS 通道。

在主控通道上将两帧之间的间隔时间设置为180秒。为持续24小时的时间序列成像设置采集次数为480次。使用主控面板上的循环功能开始自动成像采集。

评估了柔性培养室系统在时间序列SRS成像中的性能。显微镜环境封闭腔内的温度达到预期的37摄氏度，且未显著影响室温。柔性培养室内的温度在1.5小时内达到37摄氏度，并稳定维持至少24小时。

柔性培养室内的相对湿度在1小时内达到85%，并可维持至少24小时。对活体SKOV3细胞进行的延时SRS成像显示，细胞内脂滴快速且活跃地运动，时间分辨率为3分钟。在持续24小时的成像结束后，细胞仍表现出正常的形态和密度，表明细胞处于健康状态。

接下来，对经油酸处理的SKOV3细胞进行成像，并在10小时内追踪脂滴的积累情况。通过脂滴与细胞体面积比值以及脂滴的总SRS信号强度来定量脂滴含量。结果表明，在10小时内脂滴含量持续增加。

同时进行脂滴的前向受激拉曼散射（SRS）成像和用荧光染料DND-189标记的溶酶体的背向双光子荧光成像也已实现。观察到脂滴与溶酶体之间的共定位程度极低。在实施本方案时，需注意焦点漂移是活细胞成像中的常见问题。

大约进行两小时延时成像后，可能需要重新对焦。自该技术发展以来，延时SRS成像已被用于多种研究，以在活细胞中追踪无标记分子或带有拉曼标签的标记分子。