具有长距离纤维排列的微工程3D胶原蛋白水凝胶
2022年9月7日
该协议演示了使用沿流体流动方向改变几何形状的微流体通道来产生拉伸应变（拉伸）以在3D胶原水凝胶（厚度<250μm）中对齐纤维。由此产生的对齐延伸几毫米，并受拉伸应变率的影响。
这种方法使我们能够设计具有受控纤维排列水平的3D胶原蛋白水凝胶，以模拟体内健康和患病组织中发现的环境。该技术提供了一种简单的微流体方法来设计排列的胶原蛋白水凝胶，引入细胞并量化细胞在地形定义的3D环境中的行为。演示该程序的将是我的实验室的Neil Joshi，Mehran Mansouri，Ann Byerly和Justin Vidas。
首先，将 250 微米厚的 PDMS 片材安装在塑料载体上，并使用工艺切割机以 0.5 毫米的刀片深度、每秒 1 厘米的速度和高力切割微流体设计。使用超声波浴清洁微流体通道切口五分钟。用去离子水冲洗超声通道，并在100摄氏度的热板上干燥五分钟。
将通道存放在干净的、有盖的培养皿中直至使用。为了制造PDMS覆盖层并使表面功能化以供将来改性，通过在49毫升丙酮中加入1毫升氨丙基三乙氧基硅烷，在玻璃烧杯中制备2%氨丙基三乙氧基硅烷溶液。接下来，将25%戊二醛溶液稀释至5%去离子水中。
为每张 24 毫米 x 50 毫米的盖玻片制作两毫升溶液。使用 IPA 在浴超声仪中清洁盖玻片五分钟。使用去离子水从盖玻片上冲洗掉 IPA。
盖玻片上光滑的水膜表明 IPA 已彻底冲洗。将盖玻片在热板上在 100 摄氏度下干燥五分钟。将干燥的盖玻片放入干净的培养皿中，确保它们不会重叠。
使用电晕放电棒，将盖玻片暴露在电晕放电中，每个一分钟。在电晕暴露后五分钟内取出盖玻片，并将每个盖玻片浸入氨丙基三乙氧基硅烷溶液中 10 秒钟，确保盖玻片浸没然后，从氨丙基三乙氧基硅烷溶液中取出盖玻片，将它们浸入丙酮中 10 秒钟，然后用压缩空气干燥。将干燥的盖玻片放回培养皿中，处理过的一侧朝上。
将一毫升戊二醛溶液移液到每个盖玻片的表面上。尽可能多地覆盖表面，不要让溶液溢出盖玻片的边缘。让盖玻片与溶液接触30分钟，然后用去离子水冲洗20秒。
使用压缩空气干燥盖玻片，然后将它们放回培养皿中，等离子体处理的一面朝上 对于激光切割模块化磁性底座，请使用适当的激光设置（例如通过次数和功率）从 PMMA 层中切割出设计。应调整激光设置，以便磁体可以压在PMMA层中。用肥皂和水清洗激光切割零件，以去除激光切割过程中的碎屑。
不要使用溶剂，因为它们可能会在激光切割边缘传播微裂纹。要组装平台，请用手将磁铁推入激光切割底座。磁体的厚度必须小于PMMA基座的厚度，以确保磁体与基座表面齐平。
从压敏胶或 PSA 片上撕下背衬，然后将底座连接到经戊二醛处理的盖玻片上，功能化的一面朝上。轻轻地将 PDMS 通道切口放入框架定义的空腔中。用宽尖镊子向下按压以去除气泡并确保保形接触。
将牛血清白蛋白或经 BSA 处理的通道盖放在通道切口顶部，BSA 侧朝下。确保流体入口和出口与通道对齐。该设备已准备好注射胶原蛋白I。
将注射泵、冷冻无菌注射器、冷冻中和胶原蛋白 I 溶液和无菌 20 号90度角尖鲁尔锁针放入生物安全柜中。将胶原蛋白I溶液装入注射器中，避免气泡。将针尖连接到注射器上，将注射器装入注射泵，针头朝下，并用胶原蛋白I溶液灌注针头。
将注射泵设置为每分钟50至2， 000微升之间的所需流速。将准备好的PDMS通道放在实验室插孔上，并与针头水平。将针头插入 PDMS 通道的入口端口。
注射通道，直到 30 微升胶原蛋白滴在出口侧收集。放下实验室插孔，轻轻地将针头与新填充的通道分开。重复直到所有通道都充满胶原蛋白I溶液。
将填充的通道装入培养皿中，同时用干净的无绒湿巾浸有去离子水，以防止新形成的胶原蛋白I凝胶脱水。盖上培养皿，在剥离步骤之前将加载的通道放入培养箱中两个小时。对于剥离和培养基平衡，首先使用镊子取下PDMS盖，露出聚合的胶原蛋白I凝胶。
向孔中加入650微升内皮生长培养基。或者，连接另一个模块以引入额外的胶原层或提供培养基灌注功能。将设备在培养箱中放置至少四个小时以平衡凝胶和培养基。
在接种细胞之前更换培养基。将玻璃盖玻片功能化可实现通道提升，并将PDMS盖功能化为BSA防止胶原蛋白I附着。胶原I纤维排列在取下盖子后不受影响。
在基质的对齐片段上培养的HUVEC的图像显示，与具有随机纤维的片段上的HUVEC相比，肌动蛋白纤维排列增加。我们的方法使我们能够模拟肿瘤微环境并量化不同细胞类型的反应。我们还可以引入流道来支持长期实验。
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概述
该协议展示了一种微流体方法，用于设计具有受控纤维排列的3D胶原水凝胶。该技术允许在定义的3D空间中对健康和患病组织环境进行建模，从而影响细胞行为。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物材料
- 微流体学
背景
- 胶原水凝胶在组织工程中广泛使用。
- 水凝胶中的纤维排列可能影响细胞反应。
- 微流体技术可以对水凝胶特性进行精确控制。
- 本研究探索了拉伸应变对纤维排列的影响。
研究目的
- 开发一种创建排列的胶原水凝胶的方法。
- 研究纤维排列如何影响细胞行为。
- 为研究健康和疾病建模组织环境。
使用的方法
- 将PDMS片材安装到载体上，并切割微流体设计。
- 使用超声波浴清洁微流体通道切口。
- 冲洗并干燥通道以准备形成水凝胶。
- 将细胞引入排列的胶原水凝胶中进行分析。
主要结果
- 成功生成排列的胶原水凝胶。
- 排列延伸至数毫米。
- 水凝胶的地形特征影响细胞行为。
- 该方法为组织建模提供了一种简单的方法。
结论
- 微流体方法有效地在胶原水凝胶中排列纤维。
- 该技术可用于研究工程组织中的细胞反应。
- 未来应用可能包括建模各种类型的组织。
常见问题
Executive Industry Relevance
Microengineered 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment enable precise modeling of structured tissue microenvironments for early discovery and translational research. This platform supports predictive confidence in cell-matrix interaction studies, de-risking target validation and phenotypic screening in oncology, regenerative medicine, and tissue engineering portfolios. The ability to control fiber alignment and matrix architecture in 3D culture systems advances the fidelity of disease-relevant models and informs risk-adjusted R&D decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell behavior in physiologically relevant, aligned 3D matrices.
- Supports mechanistic de-risking by modeling healthy and diseased tissue architectures.
- Facilitates functional target validation through controlled microenvironmental cues.
- Improves predictive confidence for downstream phenotypic screening.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible 3D matrices for quantitative cell response assays.
- Enables preparation of aligned collagen systems for high-content screening workflows.
- Supports assay scalability and platform reuse across multiple cell types and conditions.
- Delivers robust, quantifiable outputs for compound evaluation in structured environments.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant tissue microenvironments for translational biomarker studies.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining matrix architecture.
- Reduces biological ambiguity in preclinical model selection and validation.
- Aligns with risk-adjusted advancement decisions for tissue-targeted therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in 3D systems.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of cell-matrix interactions and pathway clarification in aligned 3D environments.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible matrices with quantifiable alignment for comparative studies.
- Analytics: Supports quantitative measurement of cell morphology, motility, and alignment in response to defined matrix cues.
- Translational Research: Facilitates modeling of tumor, cardiac, and musculoskeletal microenvironments for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for repeated use across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-matrix studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible 3D culture systems for cross-team adoption.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling high-fidelity tissue modeling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue-targeted discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, biomaterials, and 3D cell culture techniques.
- Needs access to microfabrication tools, imaging systems, and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible matrix preparation and analysis.
- Adaptable to various cell types and tissue models with protocol optimization.
- Matrix thickness and alignment range may limit application to specific tissue models.
