利用数字滴定PCR定量环状RNA

dd-PCR 是一种用于靶标 DNA 或 RNA 绝对定量的高度敏感且准确的方法。该方法已用于其他常规技术无法提供准确结果的疾病诊断。dd-PCR 是检测极低丰度核酸分子的最敏感技术。

与定量PCR不同，dd-PCR在定量时无需任何看家基因作为内参对照。由于其高灵敏度和高准确性，dd-PCR可作为分子诊断和涉及低丰度RNA分子（如微小RNA和环状RNA）研究的工具。在使用dd-PCR之前，应先进行RT-PCR或RT-qPCR，以确认引物能够特异性扩增目标基因，且无非特异性PCR扩增产物。

首先，通过将环状 RNA 序列总长的最后 100 个核苷酸与环状 RNA 序列的前 100 个核苷酸连接，制备一段长度为 200 个核苷酸的 PCR 模板序列。使用该模板序列在 Primer 3 在线工具中设计引物。取一个含有约 500 万增殖性 C2C12 成肌细胞的 10 厘米培养皿，以及一个分化四天的 C2C12 成肌管细胞样本，用于 RNA 提取。

用 10 毫升 1× PBS 洗涤细胞三次，使用移液器弃去 PBS。加入 1 毫升 RNA 提取试剂，通过剧烈移液使细胞裂解。然后加入 200 微升氯仿，涡旋振荡 15 秒。

将离心管置于4摄氏度下，以12,000 G离心10分钟。取400微升上层水相，加载至硅胶柱上，并在室温下以12,000 G离心1分钟。收集穿流液至新的离心管中，加入600微升100%乙醇。加入20微升磁性硅胶珠，将离心管置于恒温混匀仪中，设置温度为25摄氏度、转速为1,200 RPM，孵育5分钟。

然后，将离心管置于磁力架上30秒，或直至溶液变澄清。用500微升含有90%乙醇的洗涤缓冲液重悬磁性二氧化硅珠。将离心管再次置于磁力架上30秒，待磁珠在磁场作用下沉降后，用移液器弃去上清缓冲液。

将离心管置于恒温混匀仪中，50摄氏度下开盖风干三分钟。加入20微升无核酸酶水，重悬磁珠。将溶解的RNA收集至新的离心管中，用于后续通过分光光度计进行定量和质量评估。

使用分光光度计测定RNA浓度，并取1微克RNA用于cDNA合成。将1微克总RNA与1微升dNTP混合物、4微升5X逆转录酶缓冲液、2微升10X逆转录酶随机引物、0.25微升逆转录酶以及0.5微升RNase抑制剂混合。用无核酸酶水补足体积至20微升。

将试管置于25摄氏度下10分钟，随后置于50摄氏度下1小时。然后将试管置于85摄氏度下5分钟以灭活酶。在0.2毫升PCR管或PCR条管中，设置总体积为22微升的PCR反应体系，并包括阴性对照管和无模板对照管。

配制NTC反应管时，加入11微升dd-PCR预混液、5.5微升浓度为1微摩尔的环状RNA特异性正向与反向引物混合液，以及5.5微升无核酸酶水。同样，配制检测反应管时，加入11微升dd-PCR预混液、5.5微升浓度为1微摩尔的环状RNA特异性正向与反向引物混合液，以及5.5微升cDNA。进行液滴生成时，将20微升PCR混合液从0.2毫升PCR管转移至液滴生成仪卡盒的样品孔中。

使用移液器小心地向微滴发生器芯片的油相孔中加入 70 微升微滴生成油。用橡胶垫片盖好微滴发生器芯片，并将其放入微滴发生器仪器中，以在芯片的微滴孔中生成样品油相微滴混合物。进行 PCR 扩增时，使用移液器将 40 微升样品油相微滴混合物从微滴发生器芯片的微滴孔中转移至 96 孔 PCR 板中。

用铝箔封膜密封96孔PCR板。将其放入预热至180摄氏度的封板机模块中，点击“封膜”以密封PCR板。随后，将该板放入数字PCR仪中，设置盖子温度为105摄氏度，升降温速率为每秒2摄氏度。

PCR 结束后，将反应板放入 dd-PCR 微滴计数仪中，并将板架置于正确位置以进行微滴计数。打开微滴分析软件，输入样品信息以设置运行程序。待微滴读取完成后，点击“分析”按钮以分析数据。

然后，点击 1D 振幅按钮以查看阳性液滴和阴性液滴。为了将阳性液滴与阴性液滴分离开，对具有相同靶标的全部样本设置一条共同的阈值线。点击导出按钮，将环状 RNA 计数数据导出为 csv 文件。

导出的数据展示了每个样本中环状 RNA 的数量。通过考虑每个反应中使用的 cDNA 总量，手动计算每纳克 RNA 中每个样本的环状 RNA 数量。此处展示了使用 QuantaSoft 软件进行的数据分析。

除MT1外，所有样本的液滴数均超过12,000。由于MT1的总液滴数较低，因此该样本未纳入最终数据分析。有趣的是，在分化四天的成肌管条件下，Circ B和C2的表达模式与成肌细胞相比存在明显差异。

以拷贝数表示的Circ B和C2丰度分析显示，C2C12成肌细胞的三个重复样本每纳克RNA分别含有76.8、67和46个拷贝，而两个肌管样本每纳克RNA分别含有558和610个拷贝。柱状图中的数据代表两次至三次生物学重复的均值加减标准差。ddPCR是测量目标环状RNA准确差异表达的最先进方法之一。

该方法将成为推动来年环状RNA研究和诊断产业发展的关键技术工具。