Name: 用于体外研究缺血性中风的人血脑屏障的三重原代细胞培养模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 了解利用原代人脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞建立三重血脑屏障细胞培养模型的方法，用于研究缺血性中风后的神经血管单元功能障碍及药物筛选。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 MH128022、MH122235、MH072567、MH122235、HL126559、DA044579、DA039576、DA040537、DA050528 和 DA047157 的支持。

注意：有关本方案中使用的所有细胞、材料、仪器和溶液的详细信息，请参见材料表。
1. 三细胞共培养血脑屏障模型的建立
<ol>
	<li>接种周细胞
	<ol>
		<li>在5% CO2培养箱中，于37 °C条件下，使用具有促进细胞黏附活性表面的T75培养瓶培养HBVP，直至细胞融合。达到融合状态后，吸除旧的周细胞培养基，并用5 mL温热的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞。吸除DPBS，然后使用4 mL温热的胰蛋白酶-EDTA溶液与1 mL DPBS联合处理，使细胞从培养瓶表面脱离。 
		注意：避免使用超过P7代的细胞。</li>
		<li>将培养瓶置于CO2培养箱中37 °C孵育5分钟。在显微镜下观察，确认细胞是否已脱离培养瓶表面。向培养瓶中加入5 mL温热的周细胞培养基（含2%胎牛血清[FBS]），并将脱离的细胞转移至50 mL离心管中。</li>
		<li>将细胞悬液在200 × g条件下离心3分钟，使细胞在管底形成沉淀。小心吸除上清液，确保细胞沉淀保持完整。</li>
		<li>用周细胞培养基重悬细胞沉淀；根据细胞融合程度和所需Transwell小室数量计算所需培养基体积。取10 µL重悬后的细胞悬液，加入细胞计数板，进行细胞计数。</li>
		<li>确定细胞密度后，以每孔300,000个细胞的密度，在1 mL周细胞培养基中将细胞接种至Transwell小室的基底侧（6孔板规格）。 
		注意：当在Transwell小室底部接种HBVP时，必须先将6孔板倒置。将板平放于台面上，取下底部部分以暴露小室的基底侧。在基底侧加入周细胞悬液后，将倒置的板盖回以防止蒸发。所有板均需倒置，并在37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种星形胶质细胞
	<ol>
		<li>在5% CO2培养箱中，于37 °C条件下，在T75培养瓶中培养HA，直至细胞融合。参照上述步骤1.1.1–1.1.4，使用星形胶质细胞培养基（同样含2% FBS）代替周细胞培养基。 
		注意：避免使用超过P9代的细胞。</li>
		<li>确定细胞密度后，以每孔300,000个细胞的密度将细胞接种至组织培养6孔板的底部。盖上盖子以防止蒸发，并将所有板置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种内皮细胞
	<ol>
		<li>在5% CO2培养箱中，于37 °C条件下，在组织培养皿中培养HBMEC，直至细胞融合。参照上述步骤1.1.1–1.1.4，使用完全经典培养基（含10% FBS）代替周细胞培养基。 
		注意：避免使用超过P12代的细胞。</li>
		<li>从37 °C、5% CO2培养箱中取出含有星形胶质细胞的6孔组织培养板以及含有周细胞的Transwell小室（6孔板规格）。吸除6孔板中的星形胶质细胞培养基。向每孔中加入1 mL周细胞培养基和1 mL星形胶质细胞培养基。</li>
		<li>吸除Transwell小室中的周细胞培养基，并将小室放入已接种星形胶质细胞的6孔组织培养板中。以每孔300,000个细胞的密度，在2 mL完全经典培养基中将HBMEC接种至同一Transwell小室的顶侧。 
		注意：内皮细胞应在周细胞接种至Transwell小室基底侧以及星形胶质细胞接种至6孔板后的次日进行接种。三重共培养体系应维持6天，以诱导形成类似血脑屏障（BBB）的特性。实验前24小时应更换两个腔室中的细胞培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 氧糖剥夺的诱导
<ol>
	<li>用 DPBS 洗涤细胞 3 次。对于接受氧糖剥夺（OGD）处理的三重细胞共培养体系，向顶端和基底外侧腔室中均加入无葡萄糖培养基（不含 L-谷氨酰胺和酚红）。在常氧对照细胞培养体系中，更换为新鲜培养基。将对照组三重细胞培养体系置于 5% CO₂2 孵育箱在 37 °C. 
	注意：在诱导氧糖剥夺（OGD）之前或OGD刚结束后更换培养基可能会产生机械应力，从而进一步影响内皮细胞单层。因此，培养基更换步骤仅适用于常氧对照细胞培养。</li>
	<li>在缺氧培养箱内放置一个含有20 mL无菌水的培养皿，以提供充足的湿度环境。松开环形夹，打开培养箱。将细胞培养物放置在层架上。拧紧环形夹，密封培养箱。</li>
	<li>打开腔室的进气口和出气口。将来自流量计顶部的管路连接到腔室上。将来自流量计底部的管路连接到装有95% N₂和5% CO₂混合气体的气瓶上。2/5% CO₂2 通过 空气过滤器</li>
	<li>逆时针旋转打开储气罐流量控制阀，以允许最小气体流量。顺时针缓慢旋转打开压力调节阀。</li>
	<li>以20 L/min的流速用气体混合物冲洗腔室5分钟。将腔室与气源断开，并牢固关闭两个白色塑料夹子。</li>
	<li>顺时针旋转关闭气罐流量控制阀。逆时针旋转关闭减压阀。</li>
	<li>将缺氧培养箱置于常规培养箱中 37 °C 4小时。 
	注意：如需加入后续复氧阶段，用DPBS洗涤细胞3次，向所有三重培养物中加入新鲜培养基，并在5% CO₂条件下继续培养24小时。2 孵育箱于 37°C根据制造商说明，使用厌氧气体混合物以20 L/min流速吹扫至少4分钟后，腔室中残留的氧气浓度为0%。</li>
</ol>
3. TEER 测量
<ol>
	<li>将灭菌后的TEER仪器放入生物安全柜中，并将电极插入上皮细胞伏特计。将电极置于30 mL的70%异丙醇溶液中，至少消毒30分钟。</li>
	<li>打开TEER仪器，将功能设置为欧姆。</li>
	<li>将电极从70%异丙醇溶液中取出，放入20 mL的DPBS中，至少浸泡30分钟，直至TEER设备上的数字读数显示为0欧姆。</li>
	<li>将电极的长探针穿过空白小室插入物对照组的三个开口之一，缓慢下放直至接触孔底。确保短探针位于小室插入物底部的顶侧培养层上方。 
	注：空白小室插入物对照组的顶侧腔室中含有2 mL完全经典培养基，基底外侧腔室中含有1 mL周细胞培养基和1 mL星形胶质细胞培养基的混合液。测量TEER时，应确保电极与小室插入物保持90°垂直。在同一孔中（每个开口）取两到三次读数的平均值，有助于降低变异度。</li>
	<li>等待TEER仪器上的数字读数稳定后再记录数值。每次测量之间，将电极放回DPBS中清洗。继续对另外两个空白小室插入物对照组收集所有TEER测量值。</li>
	<li>使用步骤3.4–3.5的方法对样品板进行TEER测量（与对照组测量相同）。完成所有测量后，将电极放回70%异丙醇溶液中浸泡30分钟。断开电极与TEER仪器的连接，并使其自然风干。</li>
	<li>计算TEER值。使用公式（1）从样品的欧姆值中减去空白小室插入物对照组的平均欧姆值，然后将所得电阻值乘以膜插入物的面积（cm2），得到以Ω∙cm2为单位的报告TEER值。 
	<img alt="跨上皮电阻公式，TEER计算，膜插入物面积，方程。" src="/files/ftp_upload/64469/64469eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> （1）</li>
</ol>
4. 血脑屏障旁细胞通透性的评估
注意：涉及异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）的所有操作步骤均须在细胞培养生物安全柜中进行，并关闭照明灯。使用铝箔覆盖异硫氰酸荧光素-葡聚糖溶液，以尽量减少光漂白。
<ol>
	<li>使用不含酚红的内皮细胞生长培养基配制含20 kDa和70 kDa FITC-葡聚糖的溶液（0.1 mg/mL），并在摇床平台上搅拌1小时。使用0.22 µm针头滤器过滤溶液。</li>
	<li>吸去基底外侧室中的培养基，并在三重细胞共培养血脑屏障模型中加入2 mL不含酚红的内皮细胞生长培养基。用Hanks'平衡盐溶液（HBSS）清洗顶侧室中的细胞两次。</li>
	<li>向顶侧室中加入1 mL FITC-葡聚糖溶液，并用铝箔包裹培养板。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>从基底外侧室中取出100 µL培养基，转移至黑色96孔板中。使用酶标仪检测荧光，激发波长和发射波长分别设置为480 nm和530 nm。</li>
</ol>
5. 活细胞中缺氧的检测
<ol>
	<li>种子 200 µL 人脑微血管内皮细胞（HBMEC）、星形胶质细胞（HA）和人脑血管周细胞（HBVP）位于中心位置 聚-d-用多聚赖氨酸包被的35 mm玻璃底培养皿，以每皿150,000个细胞的密度接种。在接种人脑微血管内皮细胞（HBMEC）前，需先用贴壁因子包被培养皿底部。让细胞 通过在玻璃表面过夜孵育使其附着 37 °C 在 CO2 培养箱 
	注意：将含有人原代细胞的培养皿与三室插件式血脑屏障（BBB）模型同时放入缺氧室进行氧糖剥夺（OGD）处理至关重要.</li>
	<li>待细胞融合后，弃去培养基，加入2 mL预热的无葡萄糖培养基（用于氧糖剥夺）或含正常培养基（用于对照） 2 µL 1 mM Hoechst 33342（终浓度） 0.2 µM）和 0.5 µL 5 mM 参考Image-iT绿色缺氧储存液 试剂（终浓度 1 µM处理完OGD后，将所有培养皿中的培养基更换为成像优化培养基。</li>
	<li>使用GFP滤光片和顶置式共聚焦显微镜培养箱，按照先前所述方法进行荧光活细胞成像14,15.</li>
</ol>

<ol><li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38(2016).</li>
<li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772(2021).</li>
<li>Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382(2020).</li>
<li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li>
<li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li>
<li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li>
<li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P50%3A+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li>
<li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230(2019).</li>
<li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突。

在本方案中，我们描述了一种建立可靠的三重内皮细胞-周细胞-星形胶质细胞血脑屏障模型的方法&#160;研究缺血性卒中背景下的血脑屏障功能障碍 体外考虑到周细胞是内皮细胞的最近邻细胞 在体内 在此模型中，HBVP细胞被接种于小室插件的底面16尽管这种配置缺乏星形胶质细胞与内皮细胞之间的直接细胞间通讯，但该体系允许不同类型细胞之间进行间接的细胞间通讯 通过 分泌的可溶性因子。该系统中星形胶质细胞和周细胞的存在显著增强了HBMEC的完整性，限制了单层细胞对小分子示踪剂的旁细胞通透性。此外，星形胶质细胞和周细胞在氧糖剥夺（OGD）条件下对HBMEC具有保护作用。
在已建立的方案中，我们优化了细胞比例（1:1:1）以及基底外侧区室的培养基混合物。该三重血脑屏障模型表现出几乎&#160;2.5 倍更高的跨上皮电阻（TEER）&#160;值（239 ± 9 Ω·cm）2) 高于对照组HBMEC单层培养（112 ± 11 Ω·cm）2共培养6天后,...

脑卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一1。脑卒中的发病率随年龄增长而迅速上升，自55岁以后每10年翻一番2。缺血性脑卒中由血栓形成和栓塞事件导致脑血流中断所引起，占所有脑卒中病例的80%以上3。目前，可用于减轻缺血性脑卒中后组织死亡的治疗手段仍然相对有限。现有治疗方法具有严格的时间依赖性，因此并不总能获得良好的临床效果。因此，迫切需要开展针对缺血性脑卒中复杂细胞机制的研究，以促进卒中后的功能恢复。
血脑屏障（BBB）是血液与脑实质之间分子交换的动态界面。从结构上看，血脑屏障由脑微血管内皮细胞构成，这些细胞通过连接复合物相互连接，并被基底膜、周细胞和星形胶质细胞终足所包绕4。周细胞和星形胶质细胞通过分泌多种对形成牢固紧密连接至关重要的因子，在维持血脑屏障完整性中发挥关键作用5,6。血脑屏障的破坏是缺血性脑卒中的标志性特征之一。与脑缺血相关的急性炎症反应和氧化应激会导致紧密连接蛋白复合物的解体，以及星形胶质细胞、周细胞和内皮细胞之间信号串扰的失调，从而增加溶质通过血脑屏障的旁细胞通透性7。血脑屏障功能障碍进一步促进脑水肿的形成，并增加出血性转化的风险8。鉴于上述因素，深入了解缺血性脑卒中发生期间及之后血脑屏障水平发生的分子与细胞变化具有重要意义。
尽管许多 体外 近几十年来，已开发出多种血脑屏障模型并应用于各类研究，但尚无一种模型能够完全复制 体内 条件9尽管一些模型仅基于内皮细胞单层培养于孔板插入式通透性支持物上，或与周细胞或星形胶质细胞共培养，但只有较新的研究引入了三细胞共培养模型设计。几乎所有现有的三细胞血脑屏障模型均包含原代脑微血管内皮细胞，以及来自动物物种的星形胶质细胞和周细胞，或由人多能干细胞衍生的细胞。10,11,12,13.
认识到需要更好地模拟人类血脑屏障 体外，我们建立了三细胞共培养体系 体外 由人脑微血管内皮细胞（HBMEC）、原代人星形胶质细胞（HA）和原代人脑血管周细胞（HBVP）组成的血脑屏障模型。该三细胞共培养血脑屏障模型构建于6孔板中，采用孔径为0.4 µm的聚酯膜插入式培养小室。此类培养小室为细胞贴壁提供了适宜环境，并便于对顶端（血液侧）和基底外侧（脑侧）腔室进行培养基取样或化合物施加。通过测量氧糖剥夺（OGD）后跨内皮电阻（TEER）和旁细胞通透性，评估该三细胞共培养血脑屏障模型在模拟缺血性脑卒中条件下的特性。 体外，伴有氧气不足（&#60;1% O₂2）以及通过使用无葡萄糖培养基实现的营养剥夺，这些条件通过使用加湿的密闭培养 chamber 实现。此外，该模型中诱导的类缺血条件可通过直接观察缺氧细胞进行准确验证。

<table><tbody><tr><td>24 mm Transwell，孔径0.4 &amp;micro;微孔聚酯膜小室</td><td>康宁</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek生命科学（FISHERSCI）</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>星形胶质细胞培养基</td><td>科学细胞</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>黏附因子</td><td>细胞系统（Fisher Scientific）</td><td>4Z0-201</td><td></td></tr><tr><td>BD 60 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>BrainPhys 成像优化培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5791</td><td></td></tr><tr><td>含血清与CultureBoost的完全经典培养基</td><td>4Z0-500</td><td>细胞系统</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL 聚丙烯离心管（锥底，带 CentriStar 盖）</td><td>VWR</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Corning 75 cm² 培养瓶&amp;sup2; U型倾斜颈未处理细胞培养瓶&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>康宁 CellBIND 96 孔平底透明底部黑色聚苯乙烯微孔板</td><td>康宁</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自动细胞计数仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td><td></td></tr><tr><td>Decon CiDehol 70 异丙醇溶液&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>04-355-71</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基（无葡萄糖，无谷氨酰胺，无酚红）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A14430-01</td><td>无葡萄糖培养基</td></tr><tr><td>DPBS（无钙，无镁）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>EBM 内皮细胞生长基础培养基，无酚红，500 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-3129</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 上皮细胞伏特/欧姆（TEER）测量仪配 STX2 电极</td><td>世界精密仪器</td><td>NC9792051</td><td>上皮伏特计&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素&amp;ndash;葡聚糖（分子量 20,000）</td><td>Millipore Sigma</td><td>FD20-250MG</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素&amp;ndash;葡聚糖（分子量 70,000）</td><td>Millipore Sigma</td><td>FD70S-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorview FV3000 共聚焦显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>气体钢瓶（95% N₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Airgas</td><td>X02NI95C2003071</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（无钙、无镁、无酚红）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342三盐酸盐三水合物 - 水溶液（10 mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>人类星形胶质细胞</td><td>科学细胞</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>人脑血管周细胞</td><td>科学细胞</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>缺氧培养箱</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27310</td><td></td></tr><tr><td>Image-iT Green 缺氧试剂</td><td>ThermoFisher</td><td>I14834</td><td></td></tr><tr><td>周细胞培养基</td><td>科学细胞</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>原代人脑微血管内皮细胞</td><td>ACBRI 376</td><td>细胞系统</td><td></td></tr><tr><td>双层摇床振荡器</td><td>VWR</td><td>10860-658</td><td></td></tr><tr><td>单一流量计</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27311</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td>75886-128</td><td></td></tr><tr><td>25 mm，0.22 微孔滤膜注射器过滤器 &amp;mu;微米，聚偏二氟乙烯，无菌</td><td>NEST Scientific</td><td>380121</td><td></td></tr><tr><td>TPP 多孔板（6 孔）</td><td>MidSci</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>TPP 细胞培养瓶 T-75 培养瓶</td><td>MidSci</td><td>TP90075</td><td>用于细胞黏附的活化表面培养瓶</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 纯水</td><td>Invitrogen（Life Technologies）</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Uno载物台培养箱-</td><td>Oko Lab</td><td>UNO-T-H-CO2-TTL</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究缺血性中风的人源三重原代细胞共培养血脑屏障模型 体外

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

缺血性卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因，其治疗选择有限。缺血性卒中的神经病理特征是脑部血液供应中断，导致细胞死亡和认知功能障碍。在缺血性卒中发生期间及之后，血脑屏障（BBB）功能障碍会促进损伤进展，并影响患者的恢复。目前的血脑屏障模型主要包括内皮细胞单层培养，以及与星形胶质细胞或周细胞共培养的双层共培养系统。
此类模型无法完全模拟对细胞间通讯至关重要的动态脑微环境。此外，常用的血脑屏障（BBB）模型通常包含永生化的人内皮细胞或动物来源（啮齿类、猪或牛）的细胞培养物，存在转化应用的局限性。本文介绍了一种基于培养小室的新型血脑屏障模型，该模型仅包含原代人源细胞（脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和脑血管周细胞），可用于缺血性脑损伤的研究。 体外. 
通过检测被动通透性、跨内皮电阻（TEER）以及直接观察缺氧细胞，评估氧糖剥夺（OGD）对血脑屏障完整性的影晌。本方案在模拟血脑屏障细胞间微环境方面具有独特优势。 体内，作为更为真实的 体外 用于缺血性脑损伤新治疗策略开发的血脑屏障模型。

为了研究星形胶质细胞和周细胞对人脑微血管内皮细胞（HBMEC）屏障功能的影响，我们在细胞培养小室中构建了三细胞共培养的血脑屏障模型（图1A）以及HBMEC单培养和两种双培养共培养模型作为对照（图1B）。双重重叠培养对照包括HBMEC与HA的非接触共培养，以及HBMEC与HBVP的接触共培养。共培养6天后，所有实验组均接受4小时的氧糖剥夺（OGD）处理。通过测定氧糖剥夺前后的跨内皮电阻（TEER），以及再氧合24小时后的TEER，评估上述不同血脑屏障构型中内皮单层的屏障完整性（图1C4小时的氧糖剥夺（OGD）仅在HBMEC单培养以及HBMEC与HBVP共培养模型中显著降低TEER值。经过24小时复氧后，这些降低的TEER值恢复至基线水平。OGD对HBMEC与HA共培养模型无影响，提示星形胶质细胞在缺血条件下具有保护作用。 体外.
尽管三重共培养模型与HBMEC/HBVP双重重共培养模型在基...

此处，我们描述一种基于原代人脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的三细胞共培养血脑屏障模型的建立方法。该多细胞模型适用于研究缺血性脑卒中期间神经血管单元的功能障碍 体外 或用于候选药物的筛选。

缺血性脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因，其治疗选择有限。缺血性脑卒中的神经病理学特征是……

本方案认识到，为了研究影响中风后恢复的复杂细胞机制，有必要在体外更好地模拟人类血脑屏障。我们的三重模型具有良好的完整性，部分原因在于培养小室具有较大的空间，使我们能够降低换液频率，避免细胞群体受到干扰。该模型是研究缺血性中风期间及之后血脑屏障处发生的分子与细胞变化的理想工具。本方案有助于发现新的治疗靶点和疗法，以改善中风后的恢复。目前针对缺血性中风的治疗方法具有时间敏感性，因此效果并不总是理想。首先，在37°C、5%二氧化碳培养箱中，将HBVP细胞接种于具有活化表面的T75培养瓶内，以促进细胞贴壁，培养至细胞融合。当细胞达到汇合状态后，吸除旧的周细胞培养基，并用五毫升温热的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）洗涤细胞。吸除杜氏磷酸盐缓冲液，然后使用四毫升温热的胰蛋白酶-EDTA 溶液与一毫升杜氏磷酸盐缓冲液共同作用，使细胞从培养瓶中脱离。将培养瓶置于二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育五分钟。在显微镜下观察，确认细胞是否已从培养瓶脱落。向培养瓶中加入5毫升含2% FBS的温热周细胞培养基，将脱落的细胞转移至50毫升离心管中。以200 ×g离心细胞悬液3分钟，使细胞在管底形成沉淀。吸出管中的培养基，确保细胞沉淀保持完整。将细胞沉淀重悬于周细胞培养基中。根据细胞汇合度及所需小室插件的数量，计算培养基的用量。取10微升重悬的细胞，加入细胞计数板，计数细胞数量。确定细胞密度后，将每插入物接种300,000个细胞，加入1毫升周细胞培养基，接种于插入物的基底侧。按照文稿中所述，使用含2% FBS的星形胶质细胞培养基培养原代人星形胶质细胞。测定细胞密度，并将300,000个细胞接种至组织培养六孔板的每个孔底部。盖好培养板以防止蒸发，过夜培养。同样，按照文本稿件中的描述，使用含10% FBS的完全经典培养基在组织培养皿中培养HBMEC细胞。从培养箱中取出含有星形胶质细胞的组织培养六孔板以及含有周细胞的孔插件。吸除组织培养六孔板中星形胶质细胞的培养基，每孔加入一毫升周细胞培养基和一毫升星形胶质细胞培养基。吸除孔插件中的周细胞培养基，然后将其放入已接种星形胶质细胞的组织培养六孔板中。将HBMEC细胞以每孔300,000个细胞的密度接种于同一孔插件的顶端侧，每孔加入2毫升完全经典培养基。用Dulbecco's PBS洗涤细胞3次。对于进行氧糖剥夺的三重细胞共培养，向顶端和基底外侧区室均加入无葡萄糖培养基。更换新鲜培养基，并将常氧对照细胞培养物放入培养箱中。将对照组三重培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱内。在低氧培养箱腔室内放置一个含有20毫升无菌水的培养皿，以 обеспечить adequate humidification of the cultures.松开环形夹具以打开腔室，然后将细胞培养物放置在搁板上。通过固定环形夹具来密封腔室。打开腔室的进气口和

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

用于体外研究缺血性中风的人血脑屏障的三重原代细胞培养模型

本方法描述了如何从小鼠脑组织中分离并永生化微血管内皮细胞。我们介绍了一套从脑组织匀浆、消化处理、细胞接种到细胞永生化的逐步实验方案。通常需要约五周时间获得均一的、可永生化的微血管内皮细胞系。...

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

本视频展示了人脑周细胞、星形胶质细胞和内皮细胞的共培养。每种细胞层分别形成后共同培养，构建出模拟血脑屏障细胞排列的三层结构体系...

建立人源血脑屏障的三重细胞共培养模型

建立人源血脑屏障（BBB）模型有助于研究与BBB功能障碍相关脑部疾病。本文介绍一种改良的接触式BBB模型制备技术，可在多孔膜的两侧分别共培养人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。...

改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法

本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。...

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

本实验的总体目标是提供一种高度可重复的技术，用于在缺血性脑卒中大鼠模型中进行血脑屏障破坏的体内评估。...

一个 在体 内 缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估

来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。...

从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

本文介绍了一种在细胞内构建血脑屏障-微型脑聚酯多孔膜培养插入系统的方法，用于评估生物分子或感染性物质穿过人血脑屏障的转运过程及其对邻近脑细胞的生理影响。...

一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型

本文介绍一种利用特定培养基的简单方法，可从胚胎皮层高效且可重复地建立富含神经元和星形胶质细胞的培养物，或神经元-胶质细胞共培养物。...

一种用于研究缺血过程中神经元-胶质细胞相互作用的细胞培养模型

本方案描述了一种建立人血脑屏障（BBB）的方法 体外...

一种模拟人类血脑屏障的三重共培养细胞系统

血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。...

血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

了解利用原代人脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞建立三重血脑屏障细胞培养模型的方法，用于研究缺血性中风后的神经血管单元功能障碍及药物筛选。

用于研究缺血性中风的人源三重原代细胞共培养血脑屏障模型体外

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