收集苜蓿根系分泌物以研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对代谢物产生的影响

本方案描述了在非靶向代谢组学分析中评估外源性物质对苜蓿影响的方法。该技术操作简便，可鉴定出更多种类的根系分泌物，有助于构建植物根系分泌物的代谢组学指纹图谱。

开始对紫花苜蓿（medicago sativa）或苜蓿种子进行消毒，先用0.1%次氯酸钠冲洗种子10分钟，随后用75%乙醇洗涤30分钟。接着，用蒸馏水将消毒后的种子多次冲洗。

然后将种子置于无菌培养皿中湿润的滤纸上，在黑暗条件下于30摄氏度下进行萌发。萌发后，将20粒均匀萌发且饱满的大种子转移到装有营养液的培养瓶中的移植篮内。

将所有培养瓶置于具有可控条件的生长室中。两周后，将15株生长一致的苜蓿幼苗转移至新的玻璃瓶中，使其分别暴露于1毫克/千克和10毫克/千克的DEHP胁迫条件下进行培养实验。用铝箔和封口膜包裹处理组和对照组的玻璃瓶，以防止DEHP发生光解和挥发。

每天补充营养液以维持液面高度。每两天随机移动并旋转瓶子一次，以确保苜蓿幼苗生长条件一致。培养七天后，将苜蓿幼苗从瓶中取出。

用超纯水多次清洗，以准备收集根系分泌物。将10株大小一致的苜蓿幼苗转移至装有50毫升灭菌去离子水的离心管中，开始根系分泌物收集实验。为收集根系分泌物，将离心管直立放置6小时，使根部浸没在水中。

完成后，用铝箔纸包裹离心管，以保护根部免受光照。取出植株，并将收集到的液体进行冷冻干燥，用于代谢物分析。随后向冷冻干燥的样品中加入1.8毫升提取液，继续进行提取实验。

涡旋振荡30秒。接着，将试管置于冰水浴中，超声处理10分钟。离心样品前。

小心地将200微升上清液转移至1.5毫升微量离心管中。从离心管中吸取45微升上清液，并将其混入质控（QC）样品中，最终体积为270微升。操作完成后，将提取物在真空浓缩仪中冷冻干燥。

干燥完成后，加入5 µL内标核糖核酸酶，继续干燥。蒸发后，加入30 µL甲氧胺盐酸盐溶液，将试管置于80 °C下孵育30分钟。接着，向样品中加入40 µL BSTFA试剂，然后将试管置于70 °C下反应1.5小时，进行衍生化。

孵育结束后，待衍生化样品降至室温，向衍生化样品中加入5 µL溶解于氯仿中的脂肪酸甲酯。使用规格为30米×250微米×0.25微米的毛细管柱，以氦气为载气（流速为1.0 mL/min），分离1 µL的根系分泌物。进样口温度设为280 °C。

并将传输线温度维持在280摄氏度。设置分离用的程序升温条件。分离提取物后，以电子碰撞模式进行质谱分析，能量为负70电子伏特。

将离子源温度维持在250摄氏度。采用全扫描监测模式获取质谱，扫描范围为50至500质荷比，扫描速率为每秒12.5张谱图。在对照样品的色谱图中检测到778个峰。

其中根据质谱鉴定了314种代谢物。这些酸类进一步分为脂肪酸、氨基酸、有机酸和酚酸。此外，在紫花苜蓿根系分泌物中还检测到一些通常存在于根系分泌物中的常见物质，包括嘧啶、羟基嘧啶、黄酮类、酚类、酮类、嘧啶类和二萜类。

基于VIP评分绘制了热图，以直观展示不同DEHP处理下差异代谢物的变化情况。与对照样品相比，DEHP暴露显著改变了50种代谢物及苜蓿根系分泌物的含量，主要包括一些碳水化合物和低分子量有机酸。

代谢通路分析表明，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）显著抑制了光合作用产物——碳水化合物的代谢，说明DEHP在一定程度上可抑制苜蓿的光合作用；同时观察到DEHP促进了有助于抵抗其胁迫的脂肪酸代谢。每个处理至少应进行种子根系分泌物的采集，以确保代谢组学数据分析的准确性。我们可由此确定差异代谢物，并进一步探究污染物环境行为中的重要规律。

通过使用该方法，可以主要解析植物与更广泛的田间生物群落之间的相互作用。