利用Artemia salina L. 进行致死率生物测定

该方案是一种对来自不同天然或合成来源的样品（如提取物、组分及化合物）进行初步全面毒性评价的非常有用的工具。本方案的主要优势在于操作简便、成本低廉，并可同时用于大量样品的检测。此外，手工制作的设备提高了实验场所的可靠性。

在此技术阶段，我们根据样品的初步总体毒性特征进行筛选，以选择需进一步接受特定测试（如扩展细胞系实验甚至体内实验）的样品。该方法主要应用于药物及其他产品化学领域，用于筛选生物样品。我们的方案也可用于其他类型的样品，例如纳米体系。

初次操作时请保持耐心，因为该过程需要细致的观察能力，并密切关注所有报告的参数。我们实验室的博士生 Marcia Filipe 和 Vera Isca 将协助演示此操作流程。首先，将漏斗形容器放入黑色支架中，并将漏斗朝向合适的方向，以便观察液面刻度和活塞。制作手工迁移装置时，将两个 0.5 升的塑料瓶的瓶口部分剪去，使最终高度为 12 厘米。

在每个瓶子底部上方7厘米处的一侧开一个直径为1.5厘米的孔，并在两个孔之间插入一段13厘米长的橡胶管。用热熔胶密封孔洞，静置15分钟使其干燥。将瓶子放在平坦的表面上，注满水以检查是否漏水。

加入28克盐至800毫升自来水中，配制人工盐溶液，或配制浓度为每升35克的卤虫盐溶液。用玻璃棒搅拌，直至盐完全溶解。为制备样品，将适量的各提取物和化合物二甲基亚砜（DMSO）溶解，终浓度为每毫升10毫克。

然后，在新的微量离心管中，用990微升人工盐溶液稀释每份样品各10微升，以获得终浓度为0.1毫克/毫升的溶液。在通风橱内的锥形瓶中，用蒸馏水配制浓度为1毫克/毫升的重铬酸钾溶液。向孵化容器中加入培养基至500毫升刻度线处，并向盐溶液中加入一勺（约0.5克）卤虫卵囊。

关闭容器。将一盏灯对准设备并打开光源。将供气系统连接到设备顶部的接口上，并启动泵。

卤虫卵在人工盐溶液中，通过强烈通气、持续光照和稳定温度条件下孵化。24至48小时后，当卵孵化完成，关闭气泵，等待无节幼体与空卵壳分离。为分离未孵化的卵与存活的无节幼体，打开漏斗底部的出水阀，将漏斗内的内容物排入自制迁移装置容器的其中一个容器中。

确保含有无节幼体和未孵化卵残渣的溶液液面低于试管内液面。将设备放入培养箱中孵育4小时，然后在第二个容器中加入残余盐溶液，使其液面高于试管高度。用铝箔覆盖装有无节幼体和未孵化卵残渣的容器，并将灯放置在仅含有盐溶液的第二个容器上。

卤虫会被光线吸引，从一个容器迁移到另一个容器，从而实现卵与活体卤虫的有效分离。从收集容器中吸取含有10至15只无节幼体的900微升盐溶液，将该溶液加入24孔板的一个孔中。所有样品均设置四个重复孔进行检测。

向每个孔中加入100微升的每种阴性对照、阳性对照（人工盐溶液）以及每种样品，并在光照条件下孵育24小时。24小时后，在体视显微镜下以12倍放大倍数观察并记录每个孔中死亡幼虫的数量。

加入 100 微升重铬酸钾溶液，以诱导残留活幼虫死亡，并静置六小时。在显微镜下计数每个孔中的总死亡幼虫数，并根据屏幕上显示的公式计算死亡率。所有实验均需设置三个重复，计算标准偏差。

最后，将结果表示为三次独立实验的平均值，每次实验均设有内部四重复，以均值加减标准差表示。本图展示了从Plectranthus属植物中提取并经半合成获得的选定化合物的结构。该图像显示了在显微镜下观察到的刚孵化的Artemia salina无节幼体。

该图示表示在0.1毫克/毫升浓度下，四种Plectranthus物种的甲醇提取物处理24小时后Artemia Salina的死亡率。通过本实验评估，所有提取物在一般毒性方面均可接受。其中“盐”代表盐溶液或空白对照。

以重铬酸钾作为阳性对照，DMSO 作为阴性对照。所有受试提取物均表现出非常令人鼓舞的结果，其死亡率百分比数值极低，与空白组和阴性对照组记录的结果相当。本图展示了五种纯化合物在 0.1 毫克/毫升浓度下暴露 24 小时后对 Artemia Salina 的死亡率。

从这些数据可以看出，使用该检测方法时，仅有五种表现出极低的毒性。您需要特别记住三个步骤：孵化、迁移和收集。因此，我们已将其他虾类分离，并获得了相应的数量用于实验。该初步检测站点是一种简单且低成本的模型，用于评估通道毒性，相较于细胞培养或斑马鱼等其他检测方法更具优势。

此外，还可以利用成本更高的细胞毒性检测位点。