Name: 使用 卤虫 盐L的致死性生物测定。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习使用卤虫盐L进行致死性生物测定的方法，用于天然产物和合成样品的初步毒性筛选。该方法简便经济，可同时检测多个样品，为药物化学研究提供可靠的毒性评估工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

纪念&#160;Amilcar Roberto 教授
本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT）资助，项目编号为 UIDB/04567/2020 和 UIDP/04567/2020（授予 CBIOS），以及博士奖学金 SFRH/BD/137671/2018（Vera Isca）。

1. 仪器准备
<ol>
	<li>购置市售的孵化设备。选择合适的位置安装孵化设备（图2A）。将漏斗形容器放入配套的黑色支架中，并将漏斗朝向合适的方向，以便观察液位刻度和活塞。</li>
	<li>制作手工迁移装置时，将两个0.5 L（直径5.8 cm）的塑料瓶顶部切除，使最终高度为12 cm。在每个瓶子距底部7 cm处的一侧开一个直径为1.5 cm的孔，然后在两个孔之间插入一段13 cm长的橡胶管（外径1.3 cm，内径0.9 cm）。用热熔胶密封接口（图2B），静置干燥15分钟；将瓶子置于水平面上，加水检查是否漏水。</li>
</ol>
2. 人工盐溶液的制备
<ol>
	<li>在玻璃烧杯中，配制浓度为 35 g/L 的人工盐溶液（卤虫盐）。根据生产商说明，向 800 mL 自来水中加入 28 g 盐，用玻璃棒搅拌，直至盐完全溶解。 
	注意：根据可用容器的大小调整所配制盐水溶液的体积。</li>
</ol>
3. 样品制备
<ol>
	<li>在微量离心管中制备所有样品，将适量的提取物（Plectranthus 提取物，Pa- P. ambigerus；Pb- P. barbatus；Pc- P. cylindraceus；Pe- P. ecklonii）或化合物 1–5（两种从 Plectranthus spp. 获得的天然化合物 [1 和 2] 以及三种半合成衍生物 [3, 4, 5]；图3）溶解于二甲基亚砜（DMSO）12 中，使终浓度达到 10 mg/mL（若样品可溶于水，则无需使用 DMSO）。</li>
	<li>在新的微量离心管中，用步骤 2.1 制备的人工生理盐水溶液 990 µL 稀释每种样品 10 µL（以及阴性对照的 DMSO），使终浓度为 0.1 mg/mL。</li>
	<li>在通风橱内的锥形瓶中，用蒸馏水配制浓度为 1 mg/mL 的重铬酸钾（K2Cr2O7）溶液13,14,15。</li>
</ol>
4. 卤虫致死率生物测定
注意：本实验方法基于多位作者的研究成果并加以改进1,16,17,18,19。
<ol>
	<li>将步骤 2.1 中配制的培养基加入孵化容器中，直至液面达到刻度线（500 mL）（图 2C）。</li>
	<li>取一勺（约 0.75 g）卤虫卵 cysts 加入盐溶液中，然后盖紧容器。将一盏灯（台灯，40 W，230 V，50 Hz，配备 8 W、4,000 K、830 lm 的 LED 灯泡）直接对准设备（图 2A），并打开电源。</li>
	<li>将供气系统（输出功率 3 W，50 Hz，230 V）连接至设备顶部的接口，并启动气泵。</li>
	<li>保持室温在 25 ± 3 °C。卤虫卵在人工盐溶液中，在强烈通气、持续光照和稳定温度条件下，24 至 48 小时内孵化。 
	注：也可使用垂直式培养箱。</li>
	<li>卵孵化完成后，关闭气泵，静置直至无节幼体（向漏斗底部移动）与空卵壳（漂浮于顶部）分离。</li>
	<li>为分离未孵化卵与存活的无节幼体，打开底部出水阀，将漏斗内容物排入自制迁移装置的一个容器中（见步骤 1.2 的描述）。确保含有无节幼体和残余未孵化卵的溶液液面低于导管高度；在第二个容器中，加入步骤 2.1 剩余的盐溶液，使其液面高于导管高度。</li>
	<li>用铝箔覆盖装有无节幼体和残余未孵化卵的容器。将灯置于仅含盐溶液的第二个容器上方。卤虫会被光线吸引，从一个容器迁移到另一个容器（收集容器），从而实现卵（缓慢沉降至底部）与活体 Artemia 的高效分离。</li>
	<li>随后，将装置置于培养箱中，在与步骤 4.4 相同的条件下孵育 4 小时（图 2E）。从收集容器中吸取含有 10 至 15 只无节幼体的 900 µL 盐溶液，加入 24 孔板的各个孔中（图 2F）；所有样品均设四复孔。</li>
	<li>向各孔分别加入 100 µL 的阴性对照（DMSO）、阳性对照（K2Cr2O7，重铬酸钾）、人工盐溶液以及各样品（图 2F）13,14。 
	注：每孔中样品的浓度为 0.01 mg/mL。阳性对照在盐溶液中的终浓度为 0.1 mg/mL，以确保孔内所有无节幼体均暴露于重铬酸钾的毒性作用并死亡。人工盐溶液作为空白对照。</li>
	<li>将 24 孔板置于 25 ± 3 °C 条件下，在光照中孵育 24 小时（图 2G）。24 小时后，在体视显微镜（12×）下观察各孔，记录死亡幼虫数量（连续 5 秒无运动的无节幼体）20（图 2H）。也可使用手持放大镜进行观察。</li>
	<li>加入 100 µL 重铬酸钾溶液，以杀死剩余的活体幼虫，静置 6 小时。在显微镜下计数各孔中总死亡幼虫数。根据以下公式计算死亡率。 
	<img alt="死亡率公式，方程：(总 A. salina 数量 - 存活 A. salina 数量) / (总 A. salina 数量) × 100" src="/files/ftp_upload/64472/64472eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"></li>
	<li>所有实验均设三个独立重复。计算标准差（SD），结果以三次独立实验的平均值表示，每次实验设内部四复孔（n = 12），± SD。根据 Meyer 等人的建议，将 LC50 &lt; 1,000 µg/mL 的粗提物和纯化合物视为具有毒性；同时需注意，卤虫的死亡率与所测试样品的浓度呈正相关21。</li>
</ol>
<img alt="静态平衡过滤装置：重力驱动水过滤器示意图、溶液混合、实验设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64472/64472fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：Artemia salina 致死性生物测定方法。（A）用于孵化卤虫卵囊的市售设备；（B）自制迁移装置；（C）装有盐溶液的孵化容器；（D）未孵化卵与无节幼体的收集；（E）在孵育过程中置于培养箱内的自制装置。远离光源的容器应使用铝箔覆盖；但为更清晰展示装置设置，本图中已移除铝箔；（F）在进行测定前从孔中收集Artemia。化合物应按图示方式加入：- 表示阴性对照（DMSO），+ 表示阳性对照（K2Cr2O7），salt 表示人工盐溶液，1 至 3 表示待测样品（本例中为化合物1-3）；（G）含有Artemia和选定样品的24孔板的孵育过程；（H）在双目显微镜下计数Artemia。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64472/64472fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="化学结构图；含官能团的分子，教育类化学内容。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64472/64472fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：部分化合物的结构。 化合物1-2的结构，提取自Plectranthus属植物；化合物3-5的结构，通过半合成方法获得。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64472/64472fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Ntungwe, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemia+species%3A+An+important+tool+to+screen+general+toxicity+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples.</a> Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).</li>
<li>Cragg, G. M., Newman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products%3A+A+continuing+source+of+novel+drug+leads%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Natural products: A continuing source of novel drug leads.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).</li>
<li>Ntungwe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+toxicity+screening+of+Royleanone+derivatives+using+an+artemia+salina+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biomedical+and+Biopharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model.</a> Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114(2021).</li>
<li>Seca, A., Plant Pinto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((secondary+metabolites+as+anticancer+agents%3A+Successes+in+clinical+trials+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263(2018).</li>
<li>Calixto, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+natural+products+in+modern+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ci%C3%AAncias%22%5BJournal%5D)">The role of natural products in modern drug discovery.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).</li>
<li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement%3A+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+brine+shrimp+larvae+lethality+microwell+test+method%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).</li>
<li>Domínguez-Villegas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((antioxidant+and+cytotoxicity+activities+of+methanolic+extract+and+prenylated+flavanones+isolated+from+leaves+of+eysehardtia+platycarpa%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Communications%22%5BJournal%5D)">antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa.</a> Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).</li>
<li>Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+evaluation+of+the+plant+products+using+Brine+Shrimp+%28Artemia+salina+L.%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Macedonian+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model.</a> Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).</li>
<li>Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+toxicity+testing+protocols+and+endpoints+with+Artemia+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Indicators%22%5BJournal%5D)">A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp.</a> Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).</li>
<li>Mendes Hacke, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+cymbopogon+citratus+%28DC%29+Stapf+fractions%2C+essential+oil%2C+citral%2C+and+geraniol+in+human+leukocytes+and+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes.</a> Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147(2022).</li>
<li>Thangapandi, V., Pushpanathan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Artemia+salina+and+Artemia+fransiscana+bioassays+for+toxicity+of+Indian+medicinal+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Coastal+Life+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants.</a> Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).</li>
<li>Syahmi, A. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+oral+toxicity+and+brine+shrimp+lethality+of+Elaeis+guineensis+Jacq.%2C+%28Oil+Palm+Leaf%29+methanol+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract.</a> Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).</li>
<li>Sasidharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+toxicity+impacts+of+Euphorbia+hirta+L+extract+on+behavior%2C+organs+body+weight+index+and+histopathology+of+organs+of+the+mice+and+Artemia+salina%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacognosy+Research%22%5BJournal%5D)">Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina.</a> Pharmacognosy Research. 4 (3), 170(2012).</li>
<li>Libralato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+of+Artemia+spp.+in+nanoecotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology.</a> Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).</li>
<li>Okumu, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemia+salina+as+an+animal+model+for+the+preliminary+evaluation+of+snake+venom-induced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%3A+X%22%5BJournal%5D)">Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity.</a> Toxicon: X. 12, 100082(2021).</li>
<li>Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemia+salina+as+a+model+organism+in+toxicity+assessment+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22DARU+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles.</a> DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20(2015).</li>
<li>Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemia+salina+as+test+organism+for+assessment+of+acute+toxicity+of+leachate+water+from+landfills%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Monitoring+and+Assessment%22%5BJournal%5D)">Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills.</a> Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).</li>
<li>Banti, C., Hadjikakou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+toxicity+with+brine+shrimp+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of toxicity with brine shrimp assay.</a> Bio-Protocol. 11 (2), 3895(2021).</li>
<li>Pecoraro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemia+salina%3A+A+microcrustacean+to+assess+engineered+nanoparticles+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity.</a> Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).</li>
<li>Lillicrap, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+approaches+to+vertebrate+ecotoxicity+tests+in+the+21st+century%3A+A+review+of+developments+over+the+last+2+decades+and+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).</li>
<li>Ribeiro, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeasts+as+a+model+for+assessing+the+toxicity+of+the+fungicides+Penconazol%2C+Cymoxanil+and+Dichlofulanid%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid.</a> Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).</li>
<li>Armour, C. D., Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+drug+to+protein%3A+using+yeast+genetics+for+high-throughput+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).</li>
<li>Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+successful+animal+model+for+screening+toxicity+of+medicinal+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants.</a> Plants. 9 (10), 1345(2020).</li>
<li>Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+testing+is+evolving%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Toxicity testing is evolving.</a> Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).</li>
<li>de Araújo, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+methods+in+toxicity+testing%3A+the+current+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alternative methods in toxicity testing: the current approach.</a> Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).</li>
<li>Toussaint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+to+measure+the+sensitivity+of+yeast+cells+to+genotoxic+agents+in+liquid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).</li>
<li>Horzmann, K. A., Freeman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+waves%3A+New+developments+in+toxicology+with+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish.</a> Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCunliffe%2C+VT+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Sitarek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+the+biological+activities+of+selected+Abietane+Diterpenes+isolated+from+Plectranthus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp.</a> Biomolecules. 10 (2), 194(2020).</li>
<li>Matias, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+activity+of+Royleanone+Diterpenes+from+Plectranthus+madagascariensis+Benth%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth.</a> ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).</li>
<li>Garcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Royleanone+derivatives+from+Plectranthus+spp.+as+a+novel+class+of+P-glycoprotein+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).</li>
</ol>

作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。

近年来，科学界对毒性筛选的替代模型给予了越来越多的关注21。旁边 A. salina 致死性生物测定，其他通常用于评估样品耐受性的方法还包括脊椎动物生物测定（如啮齿类动物）、无脊椎动物（如斑马鱼） 体外 使用酵母菌株或细胞的方法，以及 计算机模拟 方法22,23,24,25所有这些方法在考虑所花费的资金和时间、结果的可重复性以及待分析样本的类型时，均具有明确的优缺点。例如， 计算机模拟 这些方法代表了一种标准化且低成本的技术路线，所需设备极少。然而，当此类研究仅针对单一目标时，所获得的结果质量较差，因此在初步筛查中不适用，正如本研究中所展示的那样25,26</s...

多年来，由于植物、动物或微生物来源的天然产物具有多种生物学和药理学活性，其在新型生物活性分子开发中日益受到关注1。然而，这些物质在用作抗癌药物时，常伴随副作用、耐药性或靶向特异性不足等问题，这些是导致治疗效果不佳的主要因素1,2。
近几十年来，已发现多种源自植物的细胞毒性物质，其中一些已被用作抗癌药物1,2,3。在此背景下，紫杉醇被认为是已知最著名且活性最强的天然来源化疗药物之一3,4。目前估计，市售所有药物中超过35%来源于天然产物或受其启发而开发5。由于这些化合物可能具有较高毒性，在研究的各个阶段均需予以充分考虑，因为不同类型的污染物甚至植物自身的代谢成分都可能引起毒性作用。因此，应在初步阶段开展药理学和毒理学评价，以评估新型植物源治疗剂的生物活性与安全性。为评估新型生物活性样品的毒性，无脊椎动物可作为理想的研究模型，其伦理要求最低，并可进行初步的in vitro实验，从而优先筛选出最有前景的候选物，用于后续在脊椎动物中的进一步测试1,6。
通常称为卤虫， A. salina 是一种属于嗜盐性小型无脊椎动物，隶属于某一属 卤虫 （卤虫科，无甲目，甲壳亚门； 图1）。在海洋和水生盐渍生态系统中，卤虫作为重要的营养来源，以微藻为食，是构成浮游动物的重要组成部分，被用于鱼类的饵料。此外，其幼虫（称为无节幼体）在初步研究中被广泛用于评估一般毒性1,3,7.
Artemia spp. 广泛用于致死性研究，也是评估潜在生物活性化合物毒性的便捷起点，其原理是通过监测这些化合物对实验室培养的无节幼体的致死作用来评价毒性1,8。因此，A. salina 在一般毒性研究中受到关注，因为与其他动物模型实验相比，该方法非常高效且易于操作9。
由于无脊椎动物结构简单、体型微小且生命周期短，因此在单次实验中可研究大量个体。这使得它们兼具遗传操作的便利性以及适用于大规模筛选的低成本优势1。在此背景下，利用卤虫进行一般毒性检测具有多项优势，例如生长迅速（从孵化到获得初步结果仅需28–72小时）、成本低廉，以及商用卵可长期保存，全年均可使用3,10。然而，由于无脊椎动物器官系统较为原始，且缺乏适应性免疫系统，因此并不能完全可靠地模拟人体细胞的反应1。
然而，该方法可作为所选样品一般毒性的初步评估手段。由于其被广泛用作致死率检测，因此能够对潜在抗癌剂的毒性效应提供初步的指示。该方法也常用于评估具有其他任何生物活性化合物的一般毒性，以确保在卤虫（Artemia）虾中表现出尽可能低的死亡率。
在我们课题组正在进行的一项研究中，Plectranthus 属植物的不同提取物表现出抗氧化和抗菌活性（未发表结果）。同时，通过提取物的纯化获得单体化合物，并对其进行化学修饰。随后对提取物、纯化合物及半合成衍生物进行了一般毒性的测试。在此背景下，本研究旨在概述利用Artemia致死率生物测定法评估来自Plectranthus属不同植物的生物活性提取物及单体化合物的一般毒性及潜在细胞毒活性的应用11。
<img alt="显微镜下的甲壳类幼虫；海洋生物学研究；比例尺表示 500 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64472/64472fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：Artemia salina 的显微观察。 显微镜下观察到的 A. salina 初孵无节幼体（放大倍数 12 倍）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64472/64472fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>24孔板</td><td>赛默飞世尔科技，丹麦</td><td>174899</td><td>赛默飞世尔科技 Nunc Up Cell 24 孔培养皿</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>阿尔巴尔</td><td>-</td><td>可在超市购买</td></tr><tr><td>Artemio Set</td><td>JBL GmbH and Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 D-67141</td><td>61066000</td><td>可在宠物店购买</td></tr><tr><td>双目显微镜</td><td>比利时凯蒂</td><td>&amp;nbsp;1700.0000</td><td>Flexum-24AED，220-240 V，50 Hz</td></tr><tr><td>瓶子</td><td>-</td><td>-</td><td>0.5 L 直径：5.8 cm；高度：12 cm</td></tr><tr><td>卤虫卵囊</td><td>JBL GmbH 和 Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 D-67141</td><td>3090700</td><td>可在宠物店购买</td></tr><tr><td>卤虫盐</td><td>JBL GmbH 和 Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 67141</td><td>3090600</td><td>可在宠物店购买</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>VWR 化学品</td><td>CAS：67-68-5</td><td>&amp;nbsp;99% 纯度</td></tr><tr><td>一次性吸头</td><td>钻石</td><td>F171500</td><td>体积范围：100 - 1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Eppendorf 微量离心管</td><td>BRAND</td><td>7,80,546</td><td>微量离心管，聚丙烯材质，2 mL，BIO-CERT认证&amp;nbsp;PCR 质量</td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>VWR 化学品</td><td>4,47,109</td><td>体积：100 mL</td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td>诺马克斯</td><td>3.2111654N</td><td>体积：1000 mL</td></tr><tr><td>手套</td><td>卢娜手套</td><td>GLSP3</td><td>-</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad 软件公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>-</td><td>GraphPad Prism 版本 5.00 for Windows，www.graphpad.com，于 2021 年 2 月 5 日访问；商业统计分析软件</td></tr><tr><td>自制卤虫（A. salina）培养装置</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>自制装置：两个塑料瓶通过一根软管连接</td></tr><tr><td>热熔胶</td><td>帕克斯赛德</td><td>PHP500E3</td><td>230 V，50 Hz，25 W</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Heidolph Instruments，丹麦&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>一台 Heidolph Unimax 1010 设备和一台 Heidolph Inkubator 1006</td></tr><tr><td>光</td><td>Roblan</td><td>SKYC3008FE14</td><td>LED灯泡</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>VWR 化学品</td><td>613-5265</td><td>体积范围：100 - 1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>重铬酸钾（K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cr&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR 化学品</td><td>CAS：7778-50-9</td><td>&amp;nbsp;99% 纯度</td></tr><tr><td>Pump ProAir a50</td><td>JBL GmbH and Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 D-67141</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>包含在 Artemio Set+1 试剂盒中</td></tr><tr><td>橡胶管</td><td>-</td><td>-</td><td>1.3 cm 外径和 0.9 cm 内径</td></tr><tr><td>玻璃棒</td><td>VWR 化学品</td><td>441-0147</td><td>&lt;图像 替代文本=&quot;公式 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/64472/64472eq02.jpg&quot; 样式=&quot;margin: auto;&quot;/&gt; 6 mm，250 mm</td></tr><tr><td>温度计</td><td>VWR 化学品</td><td>620-0821</td><td>0 - 100 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

利用artemia salina l. 进行致死率生物测定

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

天然产物自古以来就被用于药物的制备。如今，已有大量来源于天然物质的化疗药物被用于治疗多种疾病。然而，这些化合物中的大多数往往表现出系统性毒性和不良反应。为了更好地评估选定的潜在生物活性样品的耐受性，可采用卤虫（Artemia）Artemia salina通常被用作致死性研究的模型。 A. salina 该检测基于所研究的生物活性化合物对甲壳类动物幼虫期（无节幼体）的杀灭能力。与许多其他检测方法相比，该方法可作为细胞毒性研究以及合成、半合成和天然产物的一般毒性筛选的简便、快速且低成本的初步手段。体外 细胞或酵母菌株、斑马鱼、啮齿类动物）通常适用于上述目的；此外，该方法即使未经任何专门培训也易于操作。总体而言， A. salina 该检测方法可作为选定化合物初步毒性评价及天然产物提取物生物导向分离的有力工具。

本研究通过卤虫致死生物测定法评估了本课题组近期研究的某些天然产物的一般毒性。测试了已知具有抗氧化活性（未发表结果）的Plectranthus属的四种提取物（Pa- P. ambigerus；Pb- P. barbatus；Pc- P. cylindraceus；和 Pe- P. ecklonii）。此外，还研究了从Plectranthus spp.中获得的两种天然化合物（1和2），以及三种半合成衍生物（3、4、5；图3），这些化合物均在另一项研究中已有描述3。本文报道了它们在潜在细胞毒活性方面的初步评价结果。
所有测试提取物均表现出非常令人鼓舞的结果，死亡率极低，与空白组（盐溶液）和阴性对照组（DMSO）记录的结果相当（图4）。相反，在纯化合物1-5中，只有化合物5在100 ppm浓度下表现出较低的死亡率（2....

本研究旨在评估和综述Artemia salina的致死性生物测定方法，也称为卤虫致死性试验。该方法简单且成本低廉，可用于获取样品（特别是天然产物）的一般毒性信息（被视为初步的毒性评价）。

利用Artemia salina L. 进行致死率生物测定

天然产物自古以来就被用于药物的制备。如今，已有大量化疗药物来源于天然……

该方案是一种对来自不同天然或合成来源的样品（如提取物、组分及化合物）进行初步全面毒性评价的非常有用的工具。本方案的主要优势在于操作简便、成本低廉，并可同时用于大量样品的检测。此外，手工制作的设备提高了实验场所的可靠性。在此技术阶段，我们根据样品的初步总体毒性特征进行筛选，以选择需进一步接受特定测试（如扩展细胞系实验甚至体内实验）的样品。该方法主要应用于药物及其他产品化学领域，用于筛选生物样品。我们的方案也可用于其他类型的样品，例如纳米体系。初次操作时请保持耐心，因为该过程需要细致的观察能力，并密切关注所有报告的参数。我们实验室的博士生 Marcia Filipe 和 Vera Isca 将协助演示此操作流程。首先，将漏斗形容器放入黑色支架中，并将漏斗朝向合适的方向，以便观察液面刻度和活塞。制作手工迁移装置时，将两个 0.5 升的塑料瓶的瓶口部分剪去，使最终高度为 12 厘米。在每个瓶子底部上方7厘米处的一侧开一个直径为1.5厘米的孔，并在两个孔之间插入一段13厘米长的橡胶管。用热熔胶密封孔洞，静置15分钟使其干燥。将瓶子放在平坦的表面上，注满水以检查是否漏水。加入28克盐至800毫升自来水中，配制人工盐溶液，或配制浓度为每升35克的卤虫盐溶液。用玻璃棒搅拌，直至盐完全溶解。为制备样品，将适量的各提取物和化合物二甲基亚砜（DMSO）溶解，终浓度为每毫升10毫克。然后，在新的微量离心管中，用990微升人工盐溶液稀释每份样品各10微升，以获得终浓度为0.1毫克/毫升的溶液。在通风橱内的锥形瓶中，用蒸馏水配制浓度为1毫克/毫升的重铬酸钾溶液。向孵化容器中加入培养基至500毫升刻度线处，并向盐溶液中加入一勺（约0.5克）卤虫卵囊。关闭容器。将一盏灯对准设备并打开光源。将供气系统连接到设备顶部的接口上，并启动泵。卤虫卵在人工盐溶液中，通过强烈通气、持续光照和稳定温度条件下孵化。24至48小时后，当卵孵化完成，关闭气泵，等待无节幼体与空卵壳分离。为分离未孵化的卵与存活的无节幼体，打开漏斗底部的出水阀，将漏斗内的内容物排入自制迁移装置容器的其中一个容器中。确保含有无节幼体和未孵化卵残渣的溶液液面低于试管内液面。将设备放入培养箱中孵育4小时，然后在第二个容器中加入残余盐溶液，使其液面高于试管高度。用铝箔覆盖装有无节幼体和未孵化卵残渣的容器，并将灯放置在仅含有盐溶液的第二个容器上。卤虫会被光线吸引，从一个容器迁移到另一个容器，从而实现卵与活体卤虫的有效分离。从收集容器中吸取含有10至15只无节幼体的900微升盐溶液，将该溶液加入24孔板的一个孔中。所有样品均设置四个重复孔进行检测。向每个孔中加入100微升的每种阴性对照、阳性对照（人工盐溶液）以及每种样品，并在光照条件下孵育24小时。24小时后，在体视显微镜下以12倍放大倍数观察并记录每个孔中死亡幼虫的数量。加入 100 微升重铬酸钾溶液，以诱导残留活幼虫死亡，并静置六小时。在显微镜下计数每个孔中的总死亡幼虫数，并根据屏幕上显示的公式计算死亡率。所有实验均需设置三个重复，计算标准偏差。最后，将结果表示为三次独立实验的平均值，每次实验均设有内部四重复，以均值加减标准差表示。本图展示了从Plectranthus属植物中提取并经半合成获得的选定化合物的结构。该图像显示了在显微镜下观察到的刚孵化的Artemia salina无节幼体。该图示表示在0.1毫克/毫升浓度下，四种Plectranthus物种的甲醇提取物处理24小时后Artemia Salina的死亡率。通过本实验评估，所有提取物在一般毒性方面均可接受。其中“盐”代表盐溶液或空白对照。以重铬酸钾作为阳性对照，DMSO 作为阴性对照。所有受试提取物均表现出非常令人鼓舞的结果，其死亡率百分比数值极低，与空白组和阴性对照组记录的结果相当。本图展示了五种纯化合物在 0.1 毫克/毫升浓度下暴露 24 小时后对 Artemia Salina 的死亡率。从这些数据可以看出，使用该检测方法时，仅有五种表现出极低的毒性。您需要特别记住三个步骤：孵化、迁移和收集。因此，我们已将其他虾类分离，并获得了相应的数量用于实验。该初步检测站点是一种简单且低成本的模型，用于评估通道毒性，相较于细胞培养或斑马鱼等其他检测方法更具优势。此外，还可以利用成本更高的细胞毒性检测位点。

lethality-bioassay-using-artemia-salina-l

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

使用 卤虫 盐L的致死性生物测定。

本研究涉及一种有价值的方法学方案的开发与标准化，用于测定化学物质、工业废水或污水以及液态环境样品对盐水枝角类动物Artemia...

长期致死毒性试验与甲壳类动物 Artemia franciscana

胚胎阶段对异源物质最为敏感。尽管化学毒性依赖于盐度，但目前尚无方法用于检测毒性对水生生物的盐度依赖性。本文中，我们描述了一种测定水生胚胎毒性盐度依赖性的新型高通量方法。...

利用青鳉鱼卵进行银纳米胶体的盐度依赖性毒性检测

内分泌干扰物（EDC）对水生环境构成重大风险。市政污水处理厂是地表水中雌激素活性的主要来源。本文提供的方法可用于评估污水处理工艺在去除内分泌干扰物方面的有效性和适用性。...

采用化学与生态毒理学多方法联用评估废水处理工艺去除雌激素活性效能

本研究介绍了一种利用海洋细菌Vibrio...

利用海洋细菌 Vibrio anguillarum 评估环境污染物急性毒性的生态毒理学方法

本研究中，我们描述了一种用于研究单一及复合应激因素对 turquoise killifish Nothobranchius furzeri...

青鳉鱼 Nothobranchius furzeri 急性与慢性生态毒性测试方案

在本实验方案中，我们演示了如何繁殖墨西哥盲鱼（Astyanax...

培育墨西哥盲鱼 Astyanax mexicanus 以分析仔鱼后表型及进行整体免疫组织化学

斑马鱼胚胎可用于评估化学化合物的毒性。其胚胎体外发育，对化学物质敏感，能够检测出细微的表型变化。该实验仅需少量化合物，可直接加入含有胚胎的培养板中，使检测系统高效且经济。...

利用斑马鱼胚胎快速评估化学化合物的毒性

本方案介绍了常用于评估斑马鱼胚胎（ZEM2S）和斑马鱼肝细胞（ZFL）系在96孔板中细胞毒性的检测方法（Alamar Blue...

斑马鱼细胞系的细胞毒性检测

我们描述了一种基于斑马鱼胚胎振动惊吓反应的化学化合物毒性评估筛选系统的工作流程和数据分析方法。该系统记录斑马鱼胚胎在受到振动刺激时的运动反应，可对总体毒性/致死性以及神经肌肉毒性进行综合评估。...

利用斑马鱼振动惊吓反应筛选系统评估化学品的毒性

该文章提出了一种新颖的方法 体外 基于污染物对生物运动性影响的快速灵敏毒性及生态毒性评估方法 Mytilus galloprovincialis...

一种基于贻贝（Mytilus galloprovincialis）血细胞运动性的毒理学与生态毒理学检测方法

学习使用卤虫盐L进行致死性生物测定的方法，用于天然产物和合成样品的初步毒性筛选。该方法简便经济，可同时检测多个样品，为药物化学研究提供可靠的毒性评估工具。

利用Artemia salina L. 进行致死率生物测定

探索更多视频