Name: 基于靶向质谱的低丰度蛋白质蛋白分析中的微量采样 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习使用抗体包被磁珠和液相色谱串联质谱技术，从微量干血斑样本中富集并定量检测低丰度生物标志物ProGRP的方法。该方案适用于其他蛋白质生物标志物的靶向分析。

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我们非常感谢挪威奥斯陆大学医院挪威镭射医院的Elisabeth Paus教授提供了ProGRP标准品和抗ProGRP单克隆抗体M18。本文的出版费用由Apoteker Harald Conrad Thaulows基金会资助。Trine Grønhaug Halvorsen和Léon Reubsaet是国家先进蛋白质组学基础设施网络（NAPI）联盟的合作伙伴，该联盟由挪威研究理事会INFRASTRUKTUR项目（项目编号：295910）资助。

采用健康献血者的血清制备标准溶液。使用健康献血者的血清严格遵循挪威法律进行。所有受试者均签署了知情同意书。血清样本的分析采用符合相关指南和法规的方法。本方案是对先前研究中描述的方法14的修改版本。补充表 S1中提供了缓冲液和溶液的组成及其配制方法的概述，而材料表则列出了本方案中使用的材料、仪器和试剂。
1. 抗体包被磁珠的制备
<ol>
	<li>计算制备所需数量磁珠所需的抗体用量。每50 mg磁珠使用1 mg抗体。 
	注意：后续实验中，每个样本通常使用 20 µL 浓度为 20 mg/mL 的微珠悬浮液（参见步骤 5.1）。</li>
	<li>计算制备所需数量磁珠所需的抗体体积。 
	注意：抗体用量取决于抗体浓度，需针对每种抗体进行计算。</li>
	<li>将所需体积的抗体溶液转移至一个5 mL低蛋白结合的微量离心管中。例如，若抗体溶液的浓度为1 mg/mL，则取0.4 mL用于制备1.0 mL的磁珠悬浮液（磁珠浓度为20 mg/mL，抗体用量为每50 mg磁珠加入1 mg抗体）。 
	注意：抗体应置于无胺缓冲液中。所有含蛋白质的溶液均应使用低蛋白结合力的微量离心管，以避免因吸附导致分析物损失。</li>
	<li>向抗体溶液中加入一根小型磁力搅拌棒，在持续搅拌下将pH值调节至2.5。使用带有微电极的pH计测量pH值，并通过逐步添加已知体积的1.0 M HCl来调节pH值（初始每次加入10 µL的1.0 M HCl，当pH接近2.5时减少加样体积）。记录将pH值调节至2.5所需的1.0 M HCl总体积。</li>
	<li>取出微电极，将酸化后的抗体置于冰上，在磁力搅拌器上孵育1小时。 
	注意：对抗体进行酸处理旨在促进抗体在磁珠上的正确取向。盐酸（HCl）的浓度可根据抗体溶液中的缓冲液浓度调整为0.5 M或0.2 M。</li>
	<li>中和抗体溶液。使用带有微电极的pH计测量pH值，并通过逐步加入已知体积的1.0 M NaOH将pH值调节至7（初始加入10 µL，当pH接近7时减少每次加入的体积）。记录所添加的1.0 M NaOH的总体积。 
	注意：NaOH 的浓度应与步骤 1.4 中使用的 HCl 浓度相同。NaOH 具有强腐蚀性；操作时应佩戴防护装备，包括手套和适当的眼部防护装置。</li>
	<li>计算所需使用的甲苯磺酰活化磁珠的体积。 
	注意：通常建议在进行小规模偶联时使用 20 mg 珠子/mL。珠子使用量不应少于 5 mg。</li>
	<li>将磁珠悬浮液在涡旋混合器上充分混匀，然后吸取含有所需量磁珠悬浮液的体积。例如，若要制备1 mL磁珠悬浮液，可吸取含有20 mg磁珠的体积（当磁珠浓度为30 mg/mL时，为667 µL）。</li>
	<li>将珠子悬浮液置于磁力架上1分钟，移除上清液。用等体积的I型H洗涤珠子2次。2O（若使用30 mg/mL磁珠溶液制备1 mL浓度为20 mg/mL的抗体包被磁珠，则为667 µL）。每次加入洗涤液后使用涡旋混合器混匀，然后置于磁力架上1分钟，再移除上清液。</li>
	<li>向磁珠中加入以下成分：经酸处理的抗体、0.5 M 硼酸盐缓冲液（pH 9.5）（终浓度为 0.1 M，体积为总体积的1/5；制备 1 mL 磁珠悬液时相当于加入 0.2 mL），以及用于抗体偶联的偶联缓冲液（制备 1 mL 抗体包被磁珠时，偶联缓冲液体积应为 1 mL 减去酸处理抗体体积再减去 0.2 mL 硼酸盐缓冲液）。使用涡旋混合器充分混匀。 
	注意：经酸处理的抗体体积等于抗体溶液体积（使用1 mg/mL抗体溶液制备1 mL珠悬浮液时为0.4 mL）加上用于将pH值调至2.5的1.0 M HCl体积，再加上用于将pH值调至7的1.0 M NaOH体积。 
	注意：0.5 M 硼酸盐缓冲液（pH 9.5）及抗体偶联用偶联缓冲液的配方见于 补充表 S1.</li>
	<li>在室温下使用头尾翻转式样品混合器过夜旋转，最好采用往复旋转并配合振荡。</li>
	<li>239 × g 离心 10 分钟 g将试管置于磁架上2分钟，移除上清液。</li>
	<li>用储存缓冲液旋转洗涤抗体磁珠，每次2小时，共洗2次，再过夜洗涤一次&#160;在室温下使用翻转混匀仪混匀样品。所用体积与步骤1.10中的总体积相同。每次洗涤后将离心管置于磁力架上1分钟，弃去上清液。 
	&#8203;注意：抗体珠储存缓冲液的成分可在 补充表 S1.</li>
	<li>使用所需的缓冲液（例如，与步骤 1.13 中相同的缓冲液）并按照所需的珠子储存浓度（通常为 20 mg/mL）保存。置于冰箱中储存。</li>
</ol>
2. 制备2 mL胰蛋白酶固定化微珠（20 mg/mL微珠）
<ol>
	<li>加入 20 mL 的 1 mM HCl 至 2 mL 的 NHS 活化琼脂糖珠中，以洗涤珠子。</li>
	<li>混匀后在 2,655 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 20 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.8），使用涡旋混合器混匀，并在 2,655 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。 
	注意：0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.8）的组成见补充表 S1。</li>
	<li>加入 2 mL 浓度为 20 mg/mL 的胰蛋白酶（溶于冷的胰蛋白酶偶联缓冲液中）。 
	注意：胰蛋白酶偶联缓冲液的组成见补充表 S1。将缓冲液保存在冰箱中。</li>
	<li>在 22 °C、1,100 rpm 条件下使用温控混合器孵育 25 分钟。在 2,655 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 2 mL 胰蛋白酶珠制备用修饰缓冲液，在 22 °C、1,100 rpm 条件下使用温控混合器孵育 20 分钟。在 2,655 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。 
	注意：胰蛋白酶珠制备用修饰缓冲液的组成见补充表 S1。将缓冲液保存在冰箱中。</li>
	<li>加入 10 mL 胰蛋白酶珠制备用封闭缓冲液，在 22 °C、1,100 rpm 条件下使用温控混合器孵育 10 分钟。在 2,655 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。 
	注意：胰蛋白酶珠制备用封闭缓冲液的组成见补充表 S1。将缓冲液保存在冰箱中。</li>
	<li>加入 2 mL 保存缓冲液，使用涡旋混合器混匀，保存于冰箱中待用。 
	&#8203;注意：胰蛋白酶珠保存缓冲液的组成见补充表 S1。将缓冲液保存在冰箱中。</li>
</ol>
3. DSS/VAMS&#160;采样及干血清的后续提取
<ol>
	<li>通过在血清中添加适当浓度的ProGRP（或目标蛋白）来制备标准品。加标体积应不超过总体积的1%。 
	&#8203;注意：此处使用水中浓度为295 µg/mL的ProGRP储备液来制备加标血清标准品。</li>
	<li>使用涡旋混合器充分混匀标准品。</li>
	<li>按照制造商的操作指南，将10 µL血清（加标标准品）点样至DBS卡片上，或使用VAMS（10 µL）采集10 µL血清。对于DSS，确保斑点位于虚线圆圈内。</li>
	<li>在室温下自然晾干至少2小时。</li>
	<li>剪下整个斑点并转移至一个2 mL低蛋白结合微离心管中，或从支架上取下VAMS并放入一个2 mL低蛋白结合微离心管中。</li>
	<li>加入1,000 µL 100 mM碳酸氢铵（ABC）溶液。在22 °C条件下，使用控温混合仪以1,000 rpm振荡1小时，从斑点或VAMS中提取干燥血清。</li>
	<li>将提取液转移至一个新的1.5 mL低蛋白结合微离心管中，用于胰蛋白酶消化。</li>
</ol>
4. DSS/VAMS 提取物的消化
<ol>
	<li>每个样品使用 30 µL 胰蛋白酶磁珠（按第 2 节制备）。将所有样品所需的胰蛋白酶磁珠转移至一个新的 1.5 mL 低蛋白结合微离心管中，在 2,655 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用 1 mL 冷的 50 mM ABC 缓冲液洗涤胰蛋白酶磁珠 2 次，每次洗涤后在 2,655 × g 条件下离心 5 分钟，并移除上清液，最后将磁珠重悬于先前移除的相同体积中。</li>
	<li>向每个 DSS/VAMS 提取物中加入 30 µL 洗涤后的胰蛋白酶磁珠，以启动消化反应。</li>
	<li>在 37 °C、1,000 rpm 条件下孵育 2 小时，使用温控混匀仪或类似设备。在 2,655 × g 条件下离心 5 分钟，将上清液（不含磁珠）转移至新的 2.0 mL 低蛋白结合微离心管中。</li>
	<li>加入 25 µL 含稳定同位素标记（SIL）肽 ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2] 的 14 ng/mL 内标（IS）溶液，溶于 100 mM ABC 缓冲液中。</li>
</ol>
5. 使用抗体包被的磁珠捕获特征性ProGRP肽段
<ol>
	<li>每次提取使用 20 µL 抗体包被的磁珠（按第 1 节制备，浓度为 20 mg/mL）。将所有抗体包被的磁珠转移至新的 1.5 mL 低蛋白结合微离心管中，置于磁力架上 1 分钟，吸除保存缓冲液。</li>
	<li>用含 0.05% 吐温-20 的 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤磁性抗体包被珠，随后用 2 × 1 mL PBS 洗涤，再用与移除体积相同的缓冲液重悬。每次更换缓冲液时，在涡旋混合器上混匀，并将管置于磁力架上 1 分钟。 
	注：PBS 含有 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4 和 1.8 mM KH2PO4。建议配制 10 倍浓度的溶液以提高稳定性。100 mL 10x PBS 的组成见补充表 S1。将 10x PBS 稀释 10 倍后，pH 值约为 7.4。</li>
	<li>向每个含有经消化的 DSS/VAMS 提取物和内标（IS）的低蛋白结合微离心管中加入 20 µL 洗涤后的磁珠悬浮液。在室温下使用翻转式样品混合器进行 1 小时的免疫提取。</li>
	<li>使用以下溶液洗涤磁珠：500 µL 含 0.05%（v/v）吐温-20 的 PBS、400 µL PBS、300 µL 10 mM Tris HCl（pH 7.4）和 300 µL 100 mM ABC。
	<ol>
		<li>每次加入洗涤液后，将含有磁珠和洗涤液的低蛋白结合微离心管从磁力架上取下，小心倒置直至混合均匀。然后将管放回磁力架上静置 30 秒，倒置混匀 30 秒，再放回磁力架上静置 1 分钟，随后吸除洗涤液。</li>
		<li>用微量离心机短暂离心，使残留悬浮液沉降。置于磁力架上 1 分钟，吸除剩余洗涤液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个样品中加入 15 µL 2%（v/v）甲酸的 Type 1 H2O 溶液，在 22 °C、1,000 rpm 条件下使用温控混合器或类似设备孵育 5 分钟，以洗脱捕获的肽段。将管置于磁力架上 1 分钟，将洗脱液转移至新的 1.5 mL 低蛋白结合微离心管中。重复一次，并将第二次洗脱液转移至与第一次洗脱液相同的低蛋白结合微离心管中。</li>
	<li>向每份洗脱液中加入 20 µL 100 mM ABC（总体积为 50 µL）。</li>
	<li>离心（微量离心机），取 40 µL 洗脱液转移至高效液相色谱（HPLC）小瓶的微量插入管中。</li>
</ol>
6. 采用液相色谱-串联质谱法进行分析
<ol>
	<li>使用配备电喷雾电离源的微流液相色谱三重四极杆质谱仪，以获得高稳健性。</li>
	<li>通过用流动相 A（20 mM 甲酸溶于 H2O 和 MeCN，95:5 v/v）和流动相 B（20 mM 甲酸溶于 H2O 和 MeCN，5:95 v/v）冲洗泵，准备 LC-MS/MS 系统进行分析。</li>
	<li>安装分析柱（C18，50 mm × 1 mm 内径 [ID]，3 µm 填料）。</li>
	<li>按照特定仪器的启动程序继续完成仪器的分析前准备。</li>
	<li>在仪器软件中，将色谱柱温箱温度设为 25 °C，流速设为 50 µL/min（100% 流动相 A）。</li>
	<li>用流动相 A 平衡色谱柱至少 15 分钟。</li>
	<li>将样品放入自动进样器中。</li>
	<li>准备用于分析 ProGRP 特异性胰蛋白酶肽 ALGNQQPSWDSEDSSNFK 及其内标（IS）的仪器方法。 
	注意：多个方法参数依赖于具体仪器，需在所用仪器上进行优化。此处使用的方法参数细节见步骤 6.9 至 6.11。</li>
	<li>对于液相色谱的梯度程序，使用以下设置：流速：50 µL/min；0.0 至 3.0 分钟：100% 流动相 A；3.0 至 18.0 分钟：线性梯度从 0% 到 50% 流动相 B；18.0 至 18.1 分钟：将流动相 B 从 50% 升至 100%；18.1 至 20.0 分钟：100% 流动相 B；20.0 至 20.1 分钟：将流动相 B 从 100% 降至 0%；20.1 至 30 分钟：100% 流动相 A，以重新平衡色谱柱（至少使用 10 倍柱体积）。</li>
	<li>对于 MS/MS 设置，在正离子模式下运行 MS/MS，并采用确保高效电离的仪器参数。为遵循本方案，使用 +4,000 V 的喷雾电压、270 °C 的加热毛细管温度、氮气作为鞘气（5 任意单位），以及氩气（2 mTorr）用于碰撞诱导解离（CID）碎裂。若仪器支持，将液相色谱流路在运行的前 2 分钟（0–2 分钟）和最后 1 分钟（29–30 分钟）导向废液，而非进入质谱。</li>
	<li>对（A）特征肽段（ALGNQQPSWDSEDSSNFK）使用以下选择反应监测（SRM）跃迁：1,005.45→913.3、1,005.45→1,028.3 和 1,005.45→1,398.5；对（B）同位素标记内标肽段（IS SIL 肽段，ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]）使用以下跃迁：1,009.45→921.3、1,009.45→1,036.3 和 1,009.45→1,406.5。所有监测跃迁均使用优化后的碰撞能量（本方案中为 35 V）。</li>
	<li>使用 LC-MS/MS 系统配套软件设置待测样品的进样序列。设定进样体积为 10 µL。 
	注意：根据需要添加空白样品和质量控制样品。</li>
	<li>在仪器软件中点击 &#34;运行序列&#34; 以开始序列分析。</li>
	<li>监测亲和捕获得到的 ProGRP 特异性胰蛋白酶肽 ALGNQQPSWDSEDSSNFK 及其同位素标记内标肽段的峰面积。 
	注意：特征肽段 ALGNQQPSWDSEDSSNFK 的选择与验证已在其他文献中描述14。</li>
</ol>

<ol><li>Bang, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresenius%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+analytische+Chemie%22%5BJournal%5D)">Fresenius.</a> Zeitschrift für analytische Chemie. 52 (7), 521-523 (1913).</li>
<li>Guthrie, R., Susi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+phenylalanine+method+for+detecting+phenylketonuria+in+large+populations+of+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants.</a> Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).</li>
<li>Laurell, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening+test+for+%CE%B11-antitrypsin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">A screening test for α1-antitrypsin deficiency.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 29 (3), 247-248 (1972).</li>
<li>Thielmann, K., Aquino, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+blood+samples+dried+and+stored+on+filter+paper+as+substrate+for+the+electrophoretic+separation+on+hemoglobin+S+from+hemoglobin+A.+A+screening+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Whole blood samples dried and stored on filter paper as substrate for the electrophoretic separation on hemoglobin S from hemoglobin A. A screening procedure.</a> Clinica Chimica Acta. 35 (1), 237-238 (1971).</li>
<li>Wada, Y., Fujita, T., Kidoguchi, K., Hayashi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+hemoglobin+variants+in+80%2C000+Japanese+neonates%3A+High+prevalence+of+Hb+F+Yamaguchi+%28A%CE%B3T+80+Asp%E2%86%92Asn%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fetal hemoglobin variants in 80,000 Japanese neonates: High prevalence of Hb F Yamaguchi (AγT 80 Asp→Asn).</a> Human Genetics. 72 (3), 196-202 (1986).</li>
<li>Halvorsen, T. G., McKitterick, N., Kish, M., Reubsaet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+capture+in+bottom-up+protein+analysis-overview+of+current+status+of+proteolytic+peptide+capture+using+antibodies+and+molecularly+imprinted+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Affinity capture in bottom-up protein analysis-overview of current status of proteolytic peptide capture using antibodies and molecularly imprinted polymers.</a> Analytica Chimica Acta. 1182, 338714(2021).</li>
<li>Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+based+affinity+capture+LC-MS%2FMS+in+quantitative+determination+of+proteins+in+biological+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody based affinity capture LC-MS/MS in quantitative determination of proteins in biological matrices.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 95, Supplement C 132-139 (2017).</li>
<li>Neubert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biomarker+quantification+by+immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%3A+Current+state+and+future+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Current state and future vision.</a> Clinical Chemistry. 66 (2), 282-301 (2020).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+based+targeted+protein+quantification%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications.</a> Journal of Proteome Research. 8 (2), 787-797 (2008).</li>
<li>Enderle, Y., Foerster, K., Burhenne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+feasibility+of+dried+blood+spots%3A+Analytics%2C+validation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Clinical feasibility of dried blood spots: Analytics, validation, and applications.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 130, 231-243 (2016).</li>
<li>Londhe, V., Rajadhyaksha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+obstacles+for+microsampling+techniques+in+bioanalysis%3A+Special+focus+on+DBS+and+VAMS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: Special focus on DBS and VAMS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 182, 113102(2020).</li>
<li>Denniff, P., Spooner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hematocrit+on+assay+bias+when+using+dbs+samples+for+the+quantitative+bioanalysis+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">The effect of hematocrit on assay bias when using dbs samples for the quantitative bioanalysis of drugs.</a> Bioanalysis. 2 (8), 1385-1395 (2010).</li>
<li>Denniff, P., Spooner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+absorptive+microsampling%3A+A+dried+sample+collection+technique+for+quantitative+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Volumetric absorptive microsampling: A dried sample collection technique for quantitative bioanalysis.</a> Analytical Chemistry. 86 (16), 8489-8495 (2014).</li>
<li>Levernæs, M. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+sample+clean-up+in+determination+of+low+abundant+protein+biomarkers-a+feasibility+study+of+peptide+capture+by+anti-protein+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Immunocapture sample clean-up in determination of low abundant protein biomarkers-a feasibility study of peptide capture by anti-protein antibodies.</a> RSC Advances. 9 (60), 34902-34911 (2019).</li>
<li>Conradie, J. D., Govender, M., Visser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elisa+solid+phase%3A+Partial+denaturation+of+coating+antibody+yields+a+more+efficient+solid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Elisa solid phase: Partial denaturation of coating antibody yields a more efficient solid phase.</a> Journal of Immunological Methods. 59 (3), 289-299 (1983).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了如何对干血微样本（DSS 和 VAMS）中的低丰度生物标志物进行分析时执行多个关键步骤，包括胰蛋白酶磁珠和抗体包被磁珠的制备。根据以往经验，我们始终在抗体固定到磁珠之前对其进行酸处理，以改善抗体的定向排列15。
该实验流程中的一个关键步骤是选择最合适的微量采样形式。首先，必须考虑待测分析物是否能够通过全血进行测定，或者其浓度是否受到血细胞的影响，因而必须在血清或血浆中进行检测（例如模型分析物 ProGRP）。
纸质和聚合物基质方法各有优缺点；对于ProGRP而言，VAMS在从采样器中提取后的分析物回收率方面具有明显优势。然而，通过为DSS样本使用不同的提取溶液，这一性能可能得到优化。尽管如此，分析物与采样材料之间潜在的相互作用仍需充分考虑，因其可能导致分析变异增大以及检测限升高。由于所用内标（IS）为一种稳定同位素标记肽（SIL肽），且在消化步骤之后才加入，因此该内标仅能校正消化之后的步骤（如亲和提取和LC-MS/MS分析）。而对于DSS/VAMS中的提取过程及消化步骤，无法实现内标校正。
实验过程中使用两种类型的磁珠：一种是胰蛋白酶磁珠，用于从采样器中提取血清样本后的消化；另一种是抗体包被的磁性磁珠，用于在消化后捕获特征性肽段。使用胰蛋白酶磁珠的主要原因不仅在于加快消化速度，还在于最大限度地减少样品进行亲和捕获时残留的胰蛋白酶活性。这一点至关重要，可避免在亲和捕获过程中单克隆抗体被胰蛋白酶降解。
制备胰蛋白酶微珠使用琼脂糖微珠，而制备抗体包被微珠则使用磁性微珠。琼脂糖微珠的成本低于磁性微珠，但其局限性在于需要通过离心才能将微珠从溶液中分离，这使得微珠与上清液的分离效率低于使用磁性微珠的方法。此外，使用琼脂糖微珠难以实现工作流程的自动化。然而，市面上已有磁性NHS活化微珠，可用于更简化且可自动化的样品制备流程。
微采样是药物和生物标志物生物分析领域的重要发展趋势。当前方法面临的一个挑战是样本体积有限（10 µL），这在检测极低丰度的分析物（如ProGRP，浓度水平为pg/mL至低ng/mL）时可能尤为关键。然而，借助先进的分析设备，这一挑战可以被克服。对于这类低丰度分析物，样品前处理方法的选择至关重要，通常需要通过基于抗体的亲和捕获实现选择性样品净化。由于已有研究显示，与蛋白捕获（使用相同抗体）相比，肽段捕获能够提供更洁净的提取物并实现更低的检测限14，因此本方法聚焦于将肽段捕获与微采样技术相结合。肽段捕获方法的另一优势在于，内标SIL肽段还可对亲和捕获步骤进行校正。
本研究中，使用了一种靶向蛋白质的抗体进行肽段捕获。这种方法具有优势，因为现成的靶向蛋白质的抗体比现成的靶向特征肽（proteotypic peptide）的抗体更易获得。然而，要使抗蛋白抗体有效捕获特征肽，蛋白消化后其表位必须保持完整。此外，许多抗体的精确表位并不明确，这使得寻找合适的抗蛋白抗体过程繁琐。因此，可用于肽段捕获的抗蛋白抗体数量受到限制。本文所述方法以血清为基质，胃泌素释放肽前体（ProGRP）为目标分析物进行演示，但该方法预期可适用于其他基质和其他目标分析物。在亲和捕获特征肽时，除了使用商业化的抗蛋白抗体外，也可使用定制的抗肽抗体。肽段捕获相较于蛋白捕获的净化效率如图5所示。若将用于制备胰蛋白酶珠的琼脂糖珠替换为磁珠，则该方法还可与市场上现有的自动化样品制备工作站兼容。

自1913年Ivar Bang描述了通过干血斑（DBS）监测葡萄糖以来，微采样技术已存在超过100年1。1963年Guthrie和Susi引入DBS技术用于新生儿苯丙氨酸的检测后2，该技术的应用逐渐广泛。关于利用DBS进行蛋白质采样与储存的首批报道出现在20世纪70年代初3,4，十年后的1980年代，出现了首篇将质谱法（MS）用于从DBS中检测蛋白质的报告5。尽管该技术早已被提出，但直到21世纪初，从DBS及其他微采样技术中利用质谱法检测蛋白质才变得更加普遍。
在临床背景下，检测蛋白质对于疾病的诊断与随访、治疗监测以及兴奋剂检测具有重要意义。利用质谱法从小量干燥样品中靶向检测蛋白质分析物仍具挑战性，通常需要在分析前进行复杂的样品前处理。
通过质谱法（MS）对蛋白质进行靶向定量分析通常采用自下而上（bottom-up）策略，即在分析前将蛋白质消化为肽段。该过程会产生大量肽段，使得对消化后的生物样本进行直接分析具有挑战性。为克服这一问题，可在质谱分析之前（消化前或消化后）引入选择性亲和纯化步骤6,7,8。通过该方法，可在分析前从样本基质中选择性地富集目标蛋白质（若亲和捕获步骤在消化后进行，则为目标蛋白质的特征肽段），从而降低检测限9。
与传统血液样本相比，使用干血斑（DBS）卡片进行微采样具有某些优势，包括所需样本量小、采样侵入性低以及样本储存稳定性提高。然而，样本基质不同，可能在分析过程中带来其他挑战（例如.，干燥基质与液态基质、毛细血管血与血清或血浆之间的差异）10,11。DBS应用中另一个观察到的挑战是所谓的红细胞压积效应，即血液红细胞压积会影响后续用于分析的样本体积，从而在分析中引入个体间变异性12。较新的微采样装置，例如2014年推出的VAMS13，通过采集固定体积的血液而非血滴，解决了这一问题。
本方案描述了一种用于分析干式微样本中低丰度生物标志物的实验设置。经过洗脱后，将干燥的样本进行消化，随后通过肽段亲和捕获技术分离特征性肽段。本研究的模型分析物为小细胞肺癌（SCLC）生物标志物ProGRP。由于无法从全血中可靠地检测ProGRP，因此采用血清作为样本基质。文中展示了使用DSSs和VAMS采集的血清样本的代表性结果。

<table><tbody><tr><td>乙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯</td><td>Carbosynt (Staad, 瑞士)</td><td>FA33719</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C 以下的冷冻箱中</td></tr><tr><td>ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6&lt;br/&gt; _15N2] (&amp;ge; 95%)</td><td>Innovagen (Lund, 瑞典)</td><td>不适用</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C 以下的冷冻箱中</td></tr><tr><td>碳酸氢铵 BioUltra (&amp;ge; 99.5%)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>Aquasil C18 色谱柱，3 &amp;micro;m，50 mm x 1 mm</td><td>Thermo scientific (Waltham, MA, 美国)</td><td>77503-051030</td><td>适用于 100% 水相流动相的分析柱</td></tr><tr><td>苯甲脒 (&amp;ge; 95.0%)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>12072</td><td>2-6 &amp;deg;C 冰箱中储存</td></tr><tr><td>氯化钙二水合物&amp;nbsp; (&amp;ge; 99%)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 离心机</td><td>Eppendorf (Hamburg, 德国)</td><td>5804000010</td><td></td></tr><tr><td>克隆的 ProGRP 异构体 1</td><td>Radium 医院，奥斯陆大学医院 (Oslo, 挪威)</td><td>不适用</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C 以下的冷冻箱中</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠二水合物（分析纯）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>30435-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠十二水合物（分析纯）&amp;nbsp;</td><td>Merck (Darmstadt, 德国)</td><td>1.06579.0500</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 甲苯磺酰活化磁珠，10 mL</td><td>Invitrogen (Carlsbad, 美国)</td><td>14204</td><td>2-6 &amp;deg;C 冰箱中储存</td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>Invitrogen (Carlsbad, 美国)</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺（分析纯，&amp;ge; 99%）</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>#02400</td><td></td></tr><tr><td>甲酸 (&amp;ge; 99%)，用于 LC-MS</td><td>VWR International (Radnor, PA, 美国)</td><td>84865.260</td><td></td></tr><tr><td>FTA DMPK-C 纤维素采血卡</td><td>Whatman (Kent, 英国)</td><td>WB129243</td><td>干血斑采样卡</td></tr><tr><td>HPLC 小瓶，透明玻璃，1.5 mL，32 x 11.6 mm，Clean Pack</td><td>Nerliens Meszansky (Oslo, 挪威)</td><td>LPP 11 09 0519</td><td></td></tr><tr><td>Hulamixer 样品混匀仪</td><td>Invitrogen (Carlsbad, 美国)</td><td>101561503016</td><td>具有翻转混匀、往复旋转和振动功能的样品混匀仪</td></tr><tr><td>来自健康献血者的人血清</td><td>血库，Ullev&amp;aring;l，奥斯陆大学医院 (Oslo, 挪威)</td><td>不适用</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C 以下的冷冻箱中</td></tr><tr><td>发烟盐酸 37%（Emsure 分析级）</td><td>Merck (Darmstadt, 德国)</td><td>1.00317.1000</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS/MS 系统：Ultimate 3000 系统（自动进样器 WPS-3000TRS；微泵 LPG-3400M；流路管理器 FLM-3300, MIC, 1X2P-10P）和 TSQ Quantum Access。由 Xcalibur 2.2 SP1.48 控制</td><td>Thermo scientific (Waltham, MA, 美国)</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosolv 乙腈，LC-MS 超纯级</td><td>Merck (Darmstadt, 德国)</td><td>1.00029.2500</td><td></td></tr><tr><td>LL Biotrode，复合玻璃电极</td><td>Metrohm (Herisau, 瑞士)</td><td>6.0224.100</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器，型号 M10</td><td>Franz Morat KG (Eisenbach, 德国)</td><td>10236</td><td></td></tr><tr><td>微量插入管，玻璃（31 x 6 mm，0.1 mL）</td><td>VWR International (Radnor, PA, 美国)</td><td>548-0006</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ integral 3 配 Q-POD</td><td>Merck Millipore (Molsheim, 法国)</td><td>ZRXQ003T0</td><td>用于制备一级水</td></tr><tr><td>单克隆抗体 M18</td><td>Radium 医院，奥斯陆大学医院 (Oslo, 挪威)</td><td>不适用</td><td>2-6 &amp;deg;C 冰箱中储存</td></tr><tr><td>Neoteryx Mitra 微量采样器（10 &amp;mu;L），4 个采样位蛤壳式包装</td><td>Fisher Scientific (Waltham, MA, 美国)</td><td>NC1382947</td><td></td></tr><tr><td>NHS 活化 Sepharose 磁珠 4 快速流速</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>GE17-0906-01</td><td>琼脂糖磁珠，2-6 &amp;deg;C 冰箱中储存</td></tr><tr><td>Optifit，移液器吸头补充装，10 mL</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, 芬兰)</td><td>613-2911</td><td></td></tr><tr><td>Optifit，移液器吸头补充装，10 &amp;mu;L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, 芬兰)</td><td>790012</td><td></td></tr><tr><td>Optifit，移液器吸头补充装，1,000 &amp;mu;L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, 芬兰)</td><td>791002</td><td></td></tr><tr><td>Optifit，移液器吸头补充装，200 &amp;mu;L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, 芬兰)</td><td>790202</td><td></td></tr><tr><td>pH 玻璃电极</td><td>Metrohm (Herisau, 瑞士)</td><td>6.0233.100</td><td></td></tr><tr><td>pH 计 744</td><td>Metrohm (Herisau, 瑞士)</td><td>8.744.1003</td><td></td></tr><tr><td>移液管 10 mL</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, 芬兰)</td><td>725090</td><td></td></tr><tr><td>移液管 m10 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, 芬兰)</td><td>725020</td><td></td></tr><tr><td>移液管 m100 &amp;micro;L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, 芬兰)</td><td>725050</td><td></td></tr><tr><td>移液管 m1,000 &amp;micro;L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, 芬兰)</td><td>725070</td><td></td></tr><tr><td>移液管 m20 &amp;micro;L</td><td>Sartorius Biohit (Helsinki, 芬兰)</td><td>725030</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl &amp;ge; 99.9%)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（分析纯）</td><td>Merck (Darmstadt, 德国)</td><td>1.04873.0250</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Eppendorf 管，0.5 mL</td><td>Eppendorf (Hamburg, 德国)</td><td>525-0133 (0030 108.094)</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Eppendorf 管，1.5 mL</td><td>Eppendorf (Hamburg, 德国)</td><td>525-0132 (0030 108.116)</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Eppendorf 管，2.0 mL</td><td>Eppendorf (Hamburg, 德国)</td><td>525-0134 (0030 108.450)</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Eppendorf 管，5.0 mL</td><td>Eppendorf (Hamburg, 德国)</td><td>525-0792 (0030108.302)</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>Z186716-1EA</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（BioUltra；&amp;ge; 99.5%）</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（用于分析）</td><td>Merck (Darmstadt, 德国)</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物（分析纯）</td><td>Merck (Darmstadt, 德国)</td><td>1.06346.0500</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（AnalaR NORMAPUR）</td><td>VWR International (Radnor, PA, 美国)</td><td>28244.295</td><td></td></tr><tr><td>四硼酸钠十水合物 (&amp;ge; 99.%)</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 小型离心机</td><td>LABNET International (Edison, NJ, 美国)</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>搅拌磁子，25 mm x 6 mm &amp;Oslash;，圆形</td><td>Leybold (Cologne, 德国)</td><td>666&amp;nbsp;851</td><td></td></tr><tr><td>Stuart&amp;nbsp;Scientific SA8 涡旋混合器</td><td>Stuart (Staffordshire, 英国)</td><td>Z648531-1EA</td><td></td></tr><tr><td>SuperClear 离心管（15 mL）</td><td>VWR International (Radnor, PA, 美国)</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>SuperClear 离心管（50 mL）</td><td>VWR International (Radnor, PA, 美国)</td><td>525-0155</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort 1.5 mL 恒温混匀仪</td><td>Eppendorf (Hamburg, 德国)</td><td>53,55,27,831</td><td>温度可控混匀仪</td></tr><tr><td>Trizma 基础缓冲液（试剂级，&amp;ge; 99.0%）</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>T6066</td><td>三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma HCl（试剂级，&amp;ge; 99.0%）</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>T3253-100G</td><td>三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐（Tris HCl）</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（经 TCPK 处理的牛胰腺来源，10,000–15,000 BAEE 单位/mg 蛋白质）</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>T8802</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C 以下的冷冻箱中</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>P7949-500ML</td><td>聚山梨酯 20</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, 美国)</td><td>TEM-78511-27</td><td></td></tr><tr><td>小瓶盖，白色，9 mm</td><td>Nerliens Meszansky (Oslo, 挪威)</td><td>LPP 09 15 0981</td><td></td></tr><tr><td>采用 VAMS（定量吸附微量采样）技术的 Mitra 微量采样器，10 &amp;micro;L，4 个采样位蛤壳式包装</td><td>Neoteryx (Torrance, CA, 美国)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于质谱靶向蛋白质分析中低丰度蛋白质的微采样技术

Microsampling in Targeted Mass Spectrometry-Based Protein Analysis of Low-Abundance Proteins

本文介绍了一种从干样中高效去除低丰度蛋白质杂质的实验方案，该方案在进行特征肽段亲和捕获及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测之前，采用基于微珠的蛋白质水解技术。该方法适用于传统的纸质卡片采集的干样（如干血斑[DBSs]和干血清斑[DSSs]），也适用于采用新型采样技术（如容积吸收式微采样[VAMS]）获得的样本。除详细描述该检测流程外，本文还逐步介绍了胰蛋白酶微珠和抗体包被微珠的制备方法。本方案的优势在于利用微珠实现高效的快速蛋白水解，并通过肽段亲和捕获实现选择性强且稳健的纯化。当前方案以检测干血清样本（包括DSSs和VAMS）中低丰度的小细胞肺癌（SCLC）生物标志物——胃泌素释放肽前体（ProGRP）为例进行说明。详细的微珠制备步骤有助于在新应用或其他实验室中更便捷地实施该工作流程。结果表明，检测效果可能受采样材料的影响；在本研究中，采用VAMS采集的样本相比DSSs显示出更高的信号强度。

使用DSS采样和VAMS的分析工作流程概述见图1。除采样方法不同外，其余操作步骤完全相同。两种采样方法所采集血清样本的图像见图2。
两种采样形式（VAMS 和 DSS）均适用于含 ProGRP 的血清采样。这一点可以从图 3中看出，该图展示了来自 DSS 和 VAMS 采样的蛋白特征性肽段及其内标 SIL 肽段的质谱色谱图。此外，还包含了对照样品的质谱色谱图，该对照样品由 10 µL 加标液态血清样本经与干燥样本相同方式处理后获得。该对照样品用与 DSS/VAMS 提取液体积相同的溶剂稀释，随后使用胰蛋白酶磁珠进行消化，并通过肽段亲和捕获进行纯化。
比较VAMS与DSS采样方法（图4），VAMS提供的蛋白特征性肽段/内标峰面积比高于DSS。这表明目标蛋白ProGRP可能会损失到DSS所用的纸张（纯纤维素）中。与对照样本相比，对照样本的血清在进一步处理和分析前未经过干燥（图4），结果显示VAMS获得的峰面积比与对照样本相似（双尾t检验，p≤0.65），表明目标蛋白未在采样材料上发生损失；而DSS获得的峰面积比显著降低（双尾t检验，p≤0.005），表明存在明显的采样材料吸附损失。
使用 VAMS 进行了简要的评估。线性范围为 10 至 1,000 ng/mL（R2 = 0.9996），检出限（LOD，信噪比 S/N = 3）为 6.7 ng/mL。考虑到分析是在一台较旧的三重四极杆质谱仪（2008 年款）上使用内径 1 mm 的色谱柱进行的，该检出限被认为令人满意。所有信噪比 S/N > 10 的浓度水平的重复性也令人满意，经内标校正后，相对标准偏差（RSD）在 7% 至 17% 之间（n = 3）。
亲和捕获可在消化步骤之前或之后进行，分别通过捕获目标蛋白质或其特征性肽段来实现。本方案描述的是肽段亲和捕获。与蛋白质捕获相比，该方法的优势在于仅捕获目标肽段，从而实现更高效的样品净化。这一点在图5中有所体现，图中显示蛋白质捕获后的全扫描色谱图更为复杂，噪声更多，而肽段捕获后的色谱图则更为清晰。用于图5分析的样品未采用DSS采样或VAMS技术采集，但样品基质同样为血清，且亲和捕获所用抗体与本方案中肽段捕获所用抗体相同。
<img alt="使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行肽段分析的干燥血清斑点工作流程；包括消化、亲和纯化和检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：采用干燥血清斑点（DSS）和容积吸收式微采样（VAMS）的分析工作流程示意图。 缩写：DSS = dried serum spot；VAMS = volumetric absorptive microsampling；LC-MS/MS = liquid chromatography-tandem mass spectrometry。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="血清转移过程，10µL血清点样并被分析装置吸收的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：采用不同方法采集的血清图像。（A）DBS纤维素卡片和（B）VAMS。缩写：DBS = 干血斑；VAMS = 定量吸收式微采样。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱结果、血清分析、方法比较、VAMS 与 DSS、相对丰度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：DSS 和 VAMS 取样后，以及将加标血清样本直接加入提取液后，特征性肽段和内标 SIL 肽段的代表性质谱色谱图。 质谱色谱图显示了 10 µL 血清样本，其中添加了 1.5 µg/mL 的 ProGRP，并应用于（A）VAMS，（B）用于 DSS 的纤维素取样卡，或（C）直接加入提取缓冲液（对照样本）。所有样本在肽段亲和捕获前均加入 25 µL 浓度为 14 ng/mL 的 IS SIL 肽段。缩写：DSS = 干血清斑点；VAMS = 定量吸收式微采样；MS = 质谱法；ProGRP = 前胃泌素释放肽；IS = 内标；SIL = 稳定同位素标记。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血清采集方法比较；柱状图分析 ALGNQQPSWDESDNFK/IS 面积比结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：血清样本中添加ProGRP后测定ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS峰面积比的代表性结果10 µL) 加入VAMS、DSS或直接加入提取溶液（对照样品）。 ProGRP 浓度 1.5 µg/mL，每种条件下 n = 4； 25 µL 在肽段亲和捕获之前，向所有样品中加入14 ng/mL的IS SIL肽。*表示与应用VAMS的样品相比，该面积比具有显著差异（双尾） t-测试， p≤ 0.005）。误差线表示为±标准差。缩写：DSS = 干燥血清斑点；VAMS = 容量吸收式微采样；ProGRP = 胃泌素释放肽前体；IS = 内标；SIL = 稳定同位素标记。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="液相色谱-质谱图，肽段分析，显示相对丰度与时间的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64473/64473fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：完整蛋白质提取（蓝色）与特征性表位肽段提取（红色）后基础峰色谱图（全扫描Orbitrap分析）的比较。 右侧显示了特征性表位肽段（ALGNQQPSWDSEDSSNFK，m/z 1005.45）的提取离子色谱图。样品为添加了150 ng mL−1 ProGRP的血清。该图改编自 Levernæs 等人14。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充表 S1：缓冲液和溶液的组成概述及其配制方法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64473/64473_Supp%20Table%20S1%20Buffers%20and%20solutions.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种从干血清样本中检测低丰度生物标志物的实验方案，以胃泌素释放肽前体（ProGRP）这一生物标志物为例。采用抗体包被的磁珠对特征性ProGRP肽段进行选择性纯化与富集，捕获的肽段随后通过液相色谱-串联质谱法进行分析。

本文介绍了一种从干燥样品中高效去除低丰度蛋白质的样本纯化方案，包含详细的步骤描述。该操作通过……

本方案逐步介绍了如何制备用于亲和纯化和蛋白质蛋白水解的磁珠，以及如何利用这些磁珠从干燥的微量样本中检测低丰度蛋白质。其主要优势在于为您提供了一套工具，可从小体积样本中高效地制备并采集复杂的样品。只要您拥有能够有效捕获目标蛋白质或其特征性肽段的高效抗体，该方法即可适用于其他蛋白质生物标志物。在对抗体进行酸处理调节pH值时需格外小心，尤其是当制备的微珠体积较小时。首先，将所需体积的抗体溶液转移至一个5毫升低蛋白结合的微量离心管中，并向抗体溶液中加入一个小的磁力搅拌子。使用带有微电极的pH计测量pH值，先加入10 µL 1 M盐酸调节pH，随后当pH接近2.5时逐步减少盐酸加入量。记录将 pH 值调节至 2.5 所需的 1 摩尔盐酸的总体积。取出微电极，将酸化后的抗体置于冰上，在磁力搅拌器上孵育 1 小时。为中和抗体溶液，测量其 pH 值，并先加入 10 µL 1 摩尔氢氧化钠将其 pH 值调至 7；随着 pH 值接近 7，逐步减少氢氧化钠的用量。记录所加入的一摩尔氢氧化钠的总体积。在涡旋混合器上充分混匀磁珠悬浮液，并取出含有所需量磁珠悬浮液的体积。例如，若要制备一毫升磁珠悬浮液，应取出含有20毫克磁珠的体积。将磁珠悬液置于磁力架上静置1分钟，移除上清液。用与悬液体积相等的I型水洗涤磁珠两次，每次加入洗液后使用涡旋混合器混匀。然后再次将溶液置于磁力架上静置1分钟，按前述方法移除上清液。加入经酸处理的抗体、0.5摩尔的硼酸盐缓冲液以及用于抗体偶联的偶联缓冲液至磁珠中。使用涡旋振荡器混匀，然后在室温下使用翻转式样品混合器（建议采用往复旋转和振动模式）旋转孵育过夜。随后，在239 g离心力下离心10分钟。将试管置于磁力架上两分钟，移除上清液。洗涤磁珠后，再次将试管置于磁力架上一分钟，按相同步骤移除上清液。将磁珠重悬于所需缓冲液中，按所需的储存浓度保存于冰箱中。按照制造商的说明，使用10微升定量吸收微采样（VAMS）吸头收集10微升血清，并在室温下晾干至少两小时。将VAMS从支架中取出，放入一个2毫升低蛋白结合微离心管中。加入1,000微升100毫摩尔/升的碳酸氢铵溶液，在22摄氏度下以每分钟1,000转的速度使用温控混匀仪提取一小时。将提取物转移至新的1.5毫升低蛋白结合微离心管中，用于胰蛋白酶消化。向每份VAMS提取物中加入30微升洗涤后的胰蛋白酶磁珠以启动消化反应，在37摄氏度、1,000 rpm条件下使用温控混匀仪或类似设备孵育2小时。在2,655 g条件下离心5分钟，将上清液转移至新的2毫升低蛋白结合微离心管中。向每支含有消化后VAMS提取物和内标（IS）的低蛋白结合微离心管中加入25微升含稳定同位素标记肽段的内标（IS）溶液（14纳克/毫升，溶于100毫摩尔/升碳酸氢铵溶液中）。向每支管中加入两份20微升洗涤后的磁珠悬浮液。在室温下使用翻转混样仪进行1小时的免疫萃取。用500微升含0.05%聚山梨酯20的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤磁珠。从磁力架上取下含有磁珠和洗涤液的低蛋白结合微离心管，小心倒置直至溶液均匀。然后将低蛋白结合微离心管放回磁力架上静置30秒，再倒置30秒，再次放回磁力架上静置1分钟。吸除洗涤液，并用PBS、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）和碳酸氢铵对磁珠重新洗涤。向每个样品中加入15微升含2%甲酸的I型水，然后在22摄氏度、1,000 rpm条件下使用温控混匀仪或类似设备孵育5分钟，以洗脱捕获的肽段。将洗脱液置于磁铁上1分钟后，转移至新的1.5毫升低蛋白结合微离心管中。重复一次上述步骤，并将第二次洗脱液与第一次洗脱液合并至同一支低蛋白结合微离心管中。向每份洗脱液中加入 20 微升 100 毫摩尔的碳酸氢铵。离心后，将 40 微升洗脱液转移至 HPLC 小瓶的微插件中。在仪器软件中，将色谱柱温箱温度设置为 25 摄氏度，流速设置为 50 微升每分钟。然后将样品放入自动进样器中。使用LC-MS/MS系统配套的软件，设置待测样品的运行序列，并将进样体积设为10微升。在仪器软件中点击“运行序列”以启动分析，记录亲和捕获的ProGRP特异性胰蛋白酶肽及其内标（IS）的峰面积。此处展示了通过VAMS和干血清斑点（DSS）采样后，以及将血清样本直接添加至提取液中的加标样本所获得的特征肽段和内标的质谱（MS）色谱图。本图展示了将含有 ProGRP 的血清样本添加至 VAMS、DSS 或直接加入提取液后，特征性 ProGRP 肽段与内标（IS）的峰面积比值的代表性结果。从结果可以看出，VAMS 获得的面积比值与对照样本相似，表明采样材料无损失；而 DSS 的面积比值显著降低，表明采样材料存在损失。本图还展示了完整蛋白质提取与特征性表位肽段提取后基峰色谱图的比较。当您自行制备抗体或酶包被的微珠时，可以根据特定需求定制微珠，适用于靶向蛋白质检测和全局蛋白质组学分析。采用VAMS和干血斑样本进行蛋白质检测的高灵敏度方法，使得在更广泛疾病的随访中，能够实现以患者为中心的院外检测等个体化诊疗方案。

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

基于靶向质谱的低丰度蛋白质蛋白分析中的微量采样

稳定同位素标准与抗肽抗体富集技术（SISCAPA）将肽段的亲和富集与稳定同位素稀释质谱法（MRM-MS）相结合，可对肽段进行定量检测，从而间接反映其对应蛋白质的含量。本文描述了使用磁性微粒并在部分自动化条件下进行该实验的操作流程。...

使用肽免疫亲和富集联合质谱法进行蛋白质定量

我们开发了一种基于介孔二氧化硅薄膜的技术，用于从人血清中选择性回收低分子量蛋白质和多肽。通过精细调控介孔芯片的理化性质，可有效控制多肽的富集过程，进而对血清蛋白质组进行分析，用于诊断目的。...

介孔二氧化硅薄膜富集低分子量蛋白质用于生物标志物发现

HaloTag 技术是一种多功能技术，在从哺乳动物细胞中分离大小不同的蛋白质复合物方面已取得显著成功。...

利用 HaloTag 技术发现蛋白质相互作用并表征蛋白质功能

本方案介绍了如何在复杂的生物样品中使用选择反应监测技术对目标蛋白质进行绝对定量分析。该方法已用于准确量化小鼠巨噬细胞趋化信号通路中的蛋白质。文中详细描述了目标肽段的选择、检测方法的建立，以及定性和定量分析过程。...

选择性反应监测质谱法用于蛋白质绝对定量

本文介绍了一种色谱分析方法，该方法结合了肽段前体的离子淌度分离，随后对肽段碎片进行高分辨率（约30,000）质谱检测，用于定量单克隆抗体酶解产物中添加的肽段标准品。...

一种基于液相色谱离子淌度QTOF质谱的HS-MRM方法用于蛋白质类生物制药中宿主细胞蛋白的定量分析

介绍了一种利用单个样品对生物组织中的脂质、代谢物和蛋白质进行综合提取的实验方案。...

一种用于从单个样品中全面分析代谢物、脂质和蛋白质的简单分级提取方法

本文介绍了一种利用自动化免疫基质辅助激光解吸电离（iMALDI）技术对复杂生物液体中蛋白质进行定量的实验方案。...

使用自动化免疫基质辅助激光解吸电离（iMALDI）进行肽和蛋白质定量

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

本文建立了一种基于质谱的蛋白质组学方法，利用福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中分离出的特定区域进行分析。该方案用于分析存档的福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中特定组织区域的蛋白质组。...

一种利用选定组织区域进行质谱法蛋白质组学的简化方法

学习使用抗体包被磁珠和液相色谱串联质谱技术，从微量干血斑样本中富集并定量检测低丰度生物标志物ProGRP的方法。该方案适用于其他蛋白质生物标志物的靶向分析。

基于质谱靶向蛋白质分析中低丰度蛋白质的微采样技术

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