高内涵筛选实验用于鉴定抗体依赖性细胞介导的细胞毒性调节化合物

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）可由自然杀伤细胞（即NK细胞）、粒细胞和巨噬细胞介导，这些细胞即为ADCC的效应细胞。当靶向表皮生长因子受体HER2的抗体（如曲妥珠单抗）与肿瘤细胞结合后，这些效应细胞会通过其FcγR受体识别并结合抗体的恒定Fc区。

抗体连接肿瘤细胞和表达FcγR受体的效应细胞，触发效应细胞释放其细胞毒性颗粒，从而导致癌细胞发生凋亡。ADCC可能对那些对曲妥珠单抗抗增殖作用不敏感的肿瘤有效。

为了建立 ADCC 系统，我们需要在抗 HER2 抗体曲妥珠单抗存在的条件下，将抗 HER2 阳性的 JIMT-1 乳腺癌细胞与 NK-92 细胞系共同孵育。本实验所用的 JIMT-1 细胞系稳定表达绿色荧光蛋白。首先，用 JIMT 培养基对 96 孔高内涵筛选板进行编码。

用移液器将50 µL培养基加入到板的每个孔中。将板放入CO2培养箱中孵育1小时。包被对于JIMT-1细胞在板的玻璃表面附着至关重要。

在包被步骤期间，用胰蛋白酶消化 JIMT-1 细胞。用两毫升无菌 PBS 洗涤细胞。然后，向培养瓶中加入一毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液。

将培养瓶放回CO2培养箱中孵育10分钟。孵育结束后，轻敲培养瓶以检查JIMT-1细胞是否已脱落。加入2毫升JIMT-1培养基终止消化，并将细胞悬液收集至15毫升离心管中。

然后，用台盼蓝在蓝色计数板中对 JIMT-1 细胞进行计数。将细胞浓度调整至每毫升 133,000 个细胞。吸除包被液，每孔加入 75 微升细胞悬液。

在37摄氏度的CO2培养箱中过夜培养，使细胞贴壁。次日，吸除培养基，向各孔加入50微升新鲜的JIMT-1培养基，并将培养板转移至高通量筛选实验室。使用机器人将待测化合物转移至高内涵筛选微孔板中。

利用机械臂，机器人抓取针工具单元，该单元已校准为每次转移25纳升。通过四个步骤，从化合物文库板向检测板总共转移100纳升的待测化合物。确保待测化合物的终浓度为20微摩尔。

每一步之间，先将针具在50% DMSO中清洗，然后在70%乙醇中清洗。将培养板置于37摄氏度的CO2培养箱中孵育一小时。在T25细胞培养瓶中培养NK细胞。

在对 JIMT-1 细胞进行药物处理的同时，将 NK 细胞从 T25 培养瓶收集至 15 毫升离心管中。使用台盼蓝在血细胞计数板中对 NK-92 细胞进行计数。将细胞浓度调整至每毫升 400,000 个细胞。

将含有 400,000 个细胞/毫升的 NK 细胞悬液以 150 ×g 在室温下离心 3 分钟。通过向 JIMT-1 培养基中加入 20 微克/毫升抗 HER2 抗体曲妥珠单抗，制备 ADCC 培养基。用移液器将 50 微升 ADCC 培养基中的 20,000 个 NK 细胞加入靶向的 JIMT-1 GFP 细胞中。

最终体积为100 µL，曲妥珠单抗的终浓度为10 µg/mL。将检测板放入带有内置孵育箱的高内涵分析设备中，孵育温度设置为37 °C。在两个时间点对培养板进行成像。

首先，在将效应细胞加入靶细胞后立即获取图像，第二组图像则在加入NK细胞三小时后获取。首先选择微孔板的类型，使用96孔高内涵筛选板。

选择以确定焦点，因为该检测在非共聚焦模式下使用10倍物镜的培养板中进行。选择二分之一 binning 模式，以使信噪比提高一倍。选择适当的通道、曝光时间、激光功率、焦平面和波长。

在650-760纳米波长下采集明场图像，并使用488纳米激发光和500-550纳米发射波长检测EGFP转导的JIMT-1细胞。在开始测量前，使用快照功能拍摄样本图像，以检查设置是否正确。最后，设定成像的视野数量和时间点数量。

例如，选择九个视野和两个时间点。为分析 ADCC 效率，需计数对照 ADCC 孔中存活的 JIMT-1 细胞。使用精细细胞模块检测图像上对应于细胞的区域。

将图像中荧光强度高于其周围区域的每个区域识别为一个细胞。使用内置的M算法，并以80微米为直径来选择细胞。将分割敏感度设置为0.5，该参数可将较大的对象拆分为较小的对象。

将公共阈值（即像素强度的最低水平）调整为零。通过两个步骤排除高EGFP荧光强度背景区域的检测。首先，应用“计算强度属性”功能，以确定先前选定细胞区域中的EGFP荧光强度。

随后，使用“选择群体”选项设置最小和最大强度阈值，以获得抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）结束时存活的 JIMT-1 GFP 靶细胞数量。通过将三小时后检测到的细胞数除以零时点检测到的细胞数，计算 ADCC 效率。我们希望通过代表性结果展示本方法的实际应用。

我们设置了一个测试板，其中包含从货架上随机选取的16种化合物。此外，我们还加入了三种预期具有ADCC抑制作用的化合物：秋水仙碱（colchicine）、长春新碱（vincristine）和鬼臼毒素（podophyllotoxin）。以DMSO作为阴性对照。

每种药物在平板上进行了四次重复实验。该图显示了初步筛选的结果。在无NK细胞组中，检测了药物对JIMT-1细胞的毒性作用。

在NK细胞阳性组中，加入了NK细胞和曲妥珠单抗，导致约50%的细胞毒性。通过该检测方法可观察到三种待测化合物预期的ADCC抑制效应。我们建立了一种共培养检测体系，用于模拟乳腺癌细胞、NK细胞与治疗性单克隆抗体曲妥珠单抗在临床相关条件下的相互作用。

该检测基于自动显微镜技术结合图像分析，适用于筛选化学化合物文库以鉴定可调节ADCC的药物。该方法还可用于鉴定增强抗肿瘤反应的佐剂分子，或识别具有不良作用的化学物质。