Name: 长期和短期造血干细胞的分离方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学习使用Hoxb5报告基因系统分离长期和短期造血干细胞的方法。该方案通过流式细胞术分选Hoxb5阳性细胞，帮助研究人员深入理解造血干细胞自我更新机制及其异质性生物学基础。

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我们衷心感谢日本理化学研究所生物发育研究中心（RIKEN BDR）的Hiroshi Kiyonari在动物饲养及提供受体小鼠方面的帮助，同时也感谢神户大学的Hitomi Oga、Kayoko Nagasaka和Masaki Miyahashi在实验室管理方面的工作。作者们还非常感谢各方对本研究工作的持续支持。宫西正德获得了日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（JP17K07407 和 JP20H03268）、Mochida 医药研究纪念财团、日本生命科学基金会、武田科学振兴财团、安斯泰来代谢疾病研究财团以及日本医疗研究开发机构（AMED）PRIME项目（资助编号 JP18gm6110020）的支持。坂巻太郎获得了日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（JP21K20669 和 JP22K16334）的支持，并曾获得JSPS核心-核心计划及理化学研究所青年研究者项目的支持。西克之获得了日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（JP18J13408）的支持。

所有所述动物实验均已获得理化学研究所生物系统动力学研究中心的批准。
1. 受体小鼠的预处理
<ol>
	<li>准备8至10周龄的雄性C57BL/6同源小鼠作为受体小鼠。受体小鼠的数量取决于实验方案。我们通常为每种条件准备10至20只小鼠。
	<ol>
		<li>给予小鼠添加恩诺沙星（170 mg/L）的无菌水喂养。由于经照射的受体小鼠极易感染，应尽可能保持笼具清洁。 
		注意：抗生素补充应在照射前24小时开始，并持续至移植后3周，以预防感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全身照射
	<ol>
		<li>全身照射可破坏受体小鼠的骨髓细胞，以确保供体细胞成功植入。将受体小鼠转移至照射专用笼中。在移植前12至16小时，以单次8.7 Gy剂量进行致死性全身照射。 
		注意：辐射剂量和时间可能因设备而异。致死性辐射剂量应根据研究者所使用的照射仪和小鼠品系进行确认。</li>
		<li>全身照射后，将小鼠放回原有笼具中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 供体骨髓细胞的收集
<ol>
	<li>准备一只12周龄的雄性Hoxb5-tri-mCherry小鼠，通过暴露于CO2后进行颈椎脱位，或采用当地动物伦理委员会批准的方法处死小鼠。 
	注意：每只小鼠所用试剂的体积将在后续步骤中说明。</li>
	<li>在无菌条件下去除皮肤，暴露骨骼（股骨、胫骨、骨盆、肱骨）。剪除主要肌肉组织，取出骨骼（股骨、胫骨、骨盆、肱骨），并将其置于含有无Ca2+和Mg2+、预冷的PBS的无菌细胞培养皿中。</li>
	<li>使用镊子、小剪刀和擦拭纸去除骨骼上的肌肉和纤维组织，以防止污染。操作时注意避免骨骼断裂。若骨骼发生断裂，应予以丢弃，以维持无菌状态。</li>
	<li>用70%乙醇（EtOH）对研钵和研杵进行消毒，并使其完全干燥。随后用细胞染色缓冲液（含2%热灭活FBS、2 mM EDTA、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的无Ca2+和Mg2+ PBS）平衡。</li>
	<li>将骨骼放入研钵中，加入3 mL细胞染色缓冲液。用研杵轻轻研磨使骨骼破碎。通过轻柔吹打分散细胞团块，并将细胞悬液经100 µm细胞滤筛过滤至50 mL离心管中。</li>
	<li>重复步骤2.5，直至溶液变澄清。通常重复三次即可。</li>
</ol>
3. 通过磁性分选分离 c-kit+ 细胞
<ol>
	<li>用于磁性分选的抗体染色
	<ol>
		<li>将样品在 400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL 细胞染色缓冲液中。加入 10 µL 大鼠 IgG（5 mg/mL）以减少非特异性抗体结合，使用 P1,000 移液器轻轻吹打混匀。冰上孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入浓度为 4 µg/mL 的 c-Kit 抗体（克隆号 2B8），用 P1,000 移液器混匀。冰上孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入 5 mL 细胞染色缓冲液，充分混匀。将样品在 400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 500 µL 细胞染色缓冲液中。</li>
		<li>加入 35 µL 抗 APC 微珠以富集 c-Kit+ 细胞，用 P1,000 移液器混匀。冰上孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入 4–5 mL 细胞染色缓冲液。将样品在 400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL 细胞染色缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性分选 c-Kit+ 细胞
	<ol>
		<li>按照制造商说明书进行细胞分选。简而言之，先用 3 mL 细胞染色缓冲液预平衡磁性分选柱。将样品（1 mL）经 40 µm 细胞滤网过滤后加载至磁性分选柱上。</li>
		<li>用 3 mL 细胞染色缓冲液洗涤三次。每次需待分选柱储液区完全排空后再加入下一次洗涤缓冲液。</li>
		<li>将磁性分选柱置于预冷的 15 mL 离心管上方，加入 5 mL 细胞染色缓冲液。用力推动柱塞将细胞冲洗下来。将穿流液置于冰上保存。 
		&#8203;注意：若发生样品意外丢失，我们将保留穿流液直至实验结束。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 造血干细胞染色
<ol>
	<li>将步骤 3.2.3 中制备的样品在 400 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入 CD34 抗体（克隆号 RAM34），终浓度为 50 µg/mL，在冰上孵育 60 分钟。 
	注意：建议在 CD34 抗体孵育的第一小时内同步制备辅助细胞，以缩短整体处理时间。</li>
	<li>根据 表 1 配制抗体主混合液。向样品中加入 100 µL 主混合液，在冰上孵育 30 分钟。CD34 抗原抗体（克隆号：RAM34）需要 90 分钟才能实现充分染色。</li>
	<li>加入 4–5 mL 细胞染色缓冲液。在 400 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液。向沉淀中加入链霉亲和素-BUV737，终浓度为 3 µg/mL，在冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>加入 4–5 mL 细胞染色缓冲液。在 400 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 400 µL 细胞染色缓冲液中。将样品置于冰上保存。</li>
</ol>
5. 支持细胞的制备
<ol>
	<li>准备 CD45.1+ CD45.2+ 12周龄的同源近交系小鼠；理想情况下，其年龄应与供体小鼠相同。通过二氧化碳处死小鼠2 暴露后通过颈椎脱位处死，或采用当地动物伦理委员会批准的方法。 
	注意：在提供的示例中，CD45.1+ CD45.2+ 通过将B6.CD45.1同源小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，在本实验室繁育同源小鼠16.</li>
	<li>在无菌条件下，取双侧股骨和胫骨，置于含有 Ca 的无菌细胞培养皿中2+- 和 Mg2+用镊子和小剪刀从骨骼上修剪掉肌肉和纤维组织，使用无菌的冰冷 PBS。</li>
	<li>用锋利且无菌的剪刀剪去骨骼的两端。使用一支装有冰冷细胞悬浮缓冲液（Ca2+- 和 Mg2+用含有2%热灭活FBS、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的无菌PBS冲洗骨髓，将其冲入含细胞悬浮缓冲液的无菌细胞培养皿中。通过轻柔吹打分散细胞团块。</li>
	<li>使用 P1,000 移液器将细胞悬液通过 40 µm 细胞滤网过滤。用血细胞计数板对细胞悬液中的细胞数量进行计数，并制备含有 1 x 10⁶ 个细胞的骨髓细胞悬液。6 cells/mL</li>
	<li>转移200 µL骨髓细胞悬液（2 × 10⁶细胞/200 µL）至1.5 mL微量离心管中5 将细胞加入96孔圆底板中，冰上保存备用。 
	注意：建议使用圆底培养板，以便于收集细胞。</li>
</ol>
6. Hoxb5pos 或 Hoxb5neg pHSC 分选
<ol>
	<li>设门方案
	<ol>
		<li>将步骤 4.5 中制备的样品 400 µL 转移至带有 35 µm 细胞筛网扣盖的圆底聚苯乙烯试管中。配制死细胞染色试剂，并根据制造商说明书在分析前加入样品中。</li>
		<li>打开流式细胞仪，按照制造商说明书启动分析软件。然后点击加载（Load），开始采集数据。 
		注意：建议使用配备五根激光器和 70 µm 喷嘴的流式细胞仪，以提高分选细胞的纯度。</li>
		<li>排除双联体、死细胞和谱系标记阳性细胞后，圈选 Lineage−c-Kit+Sca-1+ 细胞群。接着排除 Flk2+ 细胞群。随后在 CD150+CD34−/low 细胞群中圈选 Hoxb5pos 或 Hoxb5neg pHSCs（图 2）。首次实验时需进行光谱重叠补偿。 
		注意：Hoxb5 阳性细胞预计占 Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/lowFlk2− 细胞群的 20%–25%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoxb5pos 或 Hoxb5neg pHSCs 的分选
	<ol>
		<li>在 1.5 mL 低蛋白结合管中加入 600 µL 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS，补充 10% 热灭活的 FBS。</li>
		<li>将上述 1.5 mL 低蛋白结合管置于分选收集装置上，使用步骤 6.1.3 中设定的设门策略，将 Hoxb5pos 或 Hoxb5neg pHSCs 分选至该 1.5 mL 管中。首次分选时采用分选精度模式中的得率优先模式。</li>
		<li>将步骤 5.5 中制备好饲养细胞的 96 孔板置于自动细胞沉积单元（ACDU）载物台上。将步骤 6.2.2 中准备的 1.5 mL 低蛋白结合管置于流式细胞仪的上样口。</li>
		<li>使用步骤 6.1.3 中设定的设门策略，将 Hoxb5pos 或 Hoxb5neg pHSCs 分选至含有饲养细胞的 96 孔板中。分选 10 个 Hoxb5pos 或 Hoxb5neg pHSCs 以检测其自我更新能力。 
		注意：建议进行二次分选以提高纯度。第二次分选时推荐选择纯度优先的分选精度模式。</li>
		<li>通常情况下，经过两次分选后可获得 500–1,000 个 Hoxb5pos pHSCs 和 1,500–4,000 个 Hoxb5neg pHSCs。分选后应尽快进行移植操作，以提高细胞活力（理想情况下在 1–2 小时内完成）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 移植
<ol>
	<li>将步骤 6.2.4 中制备的 HSC 分选 96 孔板置于冰上。在无菌条件下操作该 HSC 分选 96 孔板，最好在细胞操作台中进行。</li>
	<li>使用含 2% 异氟烷的气体麻醉诱导舱对受体小鼠进行麻醉。当动物完全麻醉后，将其取出并侧卧放置。为确保麻醉充分，需确认其对有害刺激无反应。</li>
	<li>确认麻醉适当后，应尽快进行眶后注射，以防止小鼠恢复意识。眶后注射过程耗时少于 30 秒。 
	&#8203;注意：由于注射时间较短，本实验在操作过程中未使用眼用软膏。但如果操作时间较长，建议使用眼用软膏。</li>
	<li>轻轻吹打 HSC 分选 96 孔板中的细胞使其混匀。使用 30 G 胰岛素注射器吸取分选板中的供体细胞，并将其注入受体小鼠的眶后静脉丛。推荐注射体积为 ≤200 µL。</li>
	<li>观察小鼠直至其清醒并在洁净笼具中自由活动。确认其恢复后，将其放回饲养笼中。</li>
</ol>
8. 外周血分析
<ol>
	<li>从尾静脉采集 50 µL 外周血，并用含 2 mM EDTA 的无 Ca2+ 和 Mg2+ PBS 100 µL 重悬。将所有样品转移至 96 孔板中。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 200 µL 红细胞裂解缓冲液，冰上孵育 3 分钟。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。</li>
	<li>加入 200 µL 细胞染色缓冲液。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>根据 表 2 配制抗体混合液。加入 50 µL 抗体混合液，冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>加入 150 µL 细胞染色缓冲液。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 200 µL 细胞染色缓冲液。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用 200 µL 细胞染色缓冲液重悬细胞，并根据生产商说明书在分析前加入死细胞染色试剂。</li>
	<li>按照先前所述方法16&#160;，使用流式细胞仪分析外周血嵌合率。在移植后 4 周、8 周、12 周和 16 周采集血液，以追踪多谱系重建情况。代表性流式细胞术图示见 图 3。</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Shizuru, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+the+identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%2C+and+their+capability+to+induce+donor-specific+transplantation+tolerance+and+treat+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases.</a> Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241 (4861), 58-62 (1988).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
<li>Ikuta, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+hematopoietic+stem+cells+express+mouse+c-kit+but+do+not+depend+on+steel+factor+for+their+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Christensen, J. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk-2+is+a+marker+in+hematopoietic+stem+cell+differentiation%3A+A+simple+method+to+isolate+long-term+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).</li>
<li>Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+repopulation+of+irradiated+mice+with+limiting+numbers+of+purified+hematopoietic+stem+cells%3A+In+vivo+expansion+of+stem+cell+phenotype+but+not+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function.</a> Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).</li>
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</ol>

作者声明本研究无任何利益冲突。

传统上，人们通过细胞表面标志物来分离造血干细胞（HSCs），以研究其功能，例如自我更新能力和多向分化潜能19,20,21。然而，基于免疫表型定义的HSC群体（Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−）实际上包含两种不同的HSC亚群：长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）9,10。因此，目前尚未实现对真正意义上的HSC——即LT-HSCs——的特异性分析。因此，利用Hoxb5报告系统分离LT-HSCs的方法将极大促进对自我更新能力分子机制的探索。
本...

造血干细胞（HSCs）具有自我更新能力和多向分化潜能，位于造血 hierarchy 的顶端1,2。1988年，Weissman 及其同事首次证明可通过流式细胞术分离小鼠 HSCs3。随后，有研究报道，通过一组细胞表面标志物组合定义的细胞亚群——Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−——包含小鼠体内全部的 HSCs4,5,6,7,8。
免疫表型定义的（Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−）造血干细胞（以下简称 pHSCs）曾被认为在功能上是均一的。然而，近期的单细胞分析表明，pHSCs 在自我更新能力9,10 和多能性11,12 方面仍存在异质性。具体而言，在 pHSC 群体中似乎存在两种具有不同自我更新能力的细胞亚群：长期造血干细胞（LT-HSCs），具有持续的自我更新能力；以及短期造血干细胞（ST-HSCs），具有短暂的自我更新能力9,10。
迄今为止，区分长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的自我更新能力的分子机制仍不清楚。根据这两种细胞群体的自我更新能力对其进行分离，并揭示其潜在的分子机制，具有重要意义。已有多种报告系统被用于富集长期造血干细胞13,14,15；然而，不同报告系统所定义的长期造血干细胞纯度存在差异，迄今为止尚未实现长期造血干细胞的完全特异性纯化。
因此，建立一种分离LT-HSC和ST-HSC的系统将加速对pHSC组分中自我更新能力的研究。在LT-HSC和ST-HSC的分离过程中，一项采用多步骤、无偏筛选的研究鉴定出一个在pHSC组分中呈异质性表达的单个基因Hoxb516。此外，对Hoxb5报告基因小鼠的骨髓分析显示，pHSC组分中约有20%–25%为Hoxb5pos细胞。利用Hoxb5pos pHSC与Hoxb5neg pHSC进行的竞争性移植实验表明，仅有Hoxb5pos pHSC具备长期自我更新能力，而Hoxb5neg pHSC在短期内即丧失自我更新能力，提示Hoxb5可识别pHSC组分中的LT-HSC16。
本文中，我们演示了使用Hoxb5报告系统分选长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。此外，我们介绍了一种竞争性移植实验，用于评估Hoxb5pos/neg 表型造血干细胞（pHSCs）的自我更新能力（图1）。该Hoxb5报告系统使我们能够前瞻性地分离LT-HSCs和ST-HSCs，有助于深入理解LT-HSC特异性特征。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 8联管，凸盖</td><td>SSIbio</td><td>3230-00</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Iinvtrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30G 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>326668</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞筛 snap cap</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD 活性染色液</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底板</td><td>FALCON</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC-MicroBeads</td><td>Milteny biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>带捕集瓶的抽吸装置</td><td>Biosan</td><td>FTA-1</td><td></td></tr><tr><td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103232</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotin (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563894</td><td></td></tr><tr><td>B6.CD45.1 同源小鼠&amp;nbsp;</td><td>Sankyo Labo Service</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 10%</td><td>BAYER</td><td>341106546</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II 特殊订购系统&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant 染色缓冲液</td><td>BD</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotin (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563553</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV711 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td><td>Invitrogen</td><td>56-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td><td>BioLegend</td><td>115943</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td><td>Invitrogen</td><td>56-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>560230</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC (RAM34)</td><td>Invitrogen</td><td>11034185</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100216</td><td></td></tr><tr><td>CD3&amp;epsilon; -Biotin (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>CD3&amp;epsilon; -BV421 (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1/CD45.2 同源小鼠</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>本实验室繁育</td></tr><tr><td>CD45.1-FITC (A20)</td><td>BD Biosciences</td><td>553775</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE (104)</td><td>BD Biosciences</td><td>560695</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100430</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotin (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100730</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Biotin (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-15</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-50</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td><td>Invitrogen</td><td>47117182</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)，不含 Ca 和 Mg，液体&amp;nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46135182</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 版本 10</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td><td></td></tr><tr><td>Gmmacell 40 Exactor</td><td>Best theratronics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Biotin (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Hoxb5&lt;/em&gt;-tri-mCherry 小鼠（C57BL/6J 背景）&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>本实验室繁育</td></tr><tr><td>大鼠血清来源 IgG，技术级，&gt;=80% (SDS-PAGE)，缓冲水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8015-100MG</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Pfizer</td><td>4987-114-13340-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes S200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA&amp;nbsp;</td><td>6-6689-01</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>MACS&amp;nbsp; MultiStand</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>组织培养用多孔板（贴壁细胞用）6孔</td><td>IWAKI</td><td>3810-006</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 分离器</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 Pie 笼</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-331</td><td></td></tr><tr><td>多功能冷冻离心机</td><td>TOMY</td><td>EX-125</td><td></td></tr><tr><td>NARCOBIT-E (II)</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-1071-I</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td><td>BioLegend</td><td>108728</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素混合溶液</td><td>nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>瓷研钵 &amp;phi;120mm 带研杵</td><td>Asone</td><td>6-549-03</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 1.5 mL 管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Sca-I-BUV395 (D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>563990</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢手术刀片</td><td>FastGene</td><td>FG-B2010</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612775</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-red</td><td>Invitrogen</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>小鼠尾静脉固定器（标准型）</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>TCRb-BV421 (H57-597)</td><td>BioLegend</td><td>109230</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Biotin (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 5 ml 同轴鲁尔滑动注射器</td><td>TERUMO</td><td>SS-05LZ</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 皮下注射针头 23G x 1</td><td>TERUMO</td><td>NN-2325-R</td><td></td></tr></tbody></table>

长期与短期造血干细胞的分离方法

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

自我更新能力和多谱系分化潜能通常被认为是造血干细胞（HSCs）的定义性特征。然而，大量研究表明，HSC细胞室中存在功能异质性。近期的单细胞分析报道了在HSC细胞室中具有不同细胞命运的HSC克隆，这些克隆被称为偏向性HSC克隆。目前对导致这些异质性或可重复性差的结果背后的机制仍知之甚少，尤其是在通过传统免疫染色方法移植纯化的HSC组分时，其自我更新持续时间的相关机制尚不明确。因此，建立一种可重复的方法来分离长期HSC（LT-HSCs）和短期HSC（ST-HSCs），&#160;即根据其自我更新持续时间来定义这两类细胞，对于解决这一问题至关重要。通过无偏倚的多步骤筛选，我们鉴定出一个转录因子Hoxb5，它可能是小鼠造血系统中LT-HSCs的特异性标志物。基于这一发现，我们构建了Hoxb5报告基因小鼠品系，并成功分离出LT-HSCs和ST-HSCs。本文详细描述了利用Hoxb5报告系统分离LT-HSCs和ST-HSCs的实验方案。该分离方法将有助于研究人员更深入地理解HSC细胞室中自我更新机制及其异质性的生物学基础。

此前，自我更新能力通常通过竞争性移植实验进行测定，其中认为只有当在受体外周血中观察到多谱系的供体细胞时，供体造血干细胞（HSCs）才保留了其自我更新能力17。此外，已有若干研究报告将长期造血干细胞（LT-HSCs）定义为在第二次骨髓移植后数月仍能持续产生外周血细胞的细胞10,18。因此，为了比较其自我更新能力，将从Hoxb5报告小鼠中分离的10个Hoxb5pos或Hoxb5neg初代造血干细胞（pHSCs）与2 × 105个全骨髓细胞共同移植至致死剂量 irradiated 的初级受体小鼠体内。随后，在初次移植16周后，将初级受体小鼠骨髓中分离的1 × 107个骨髓细胞移植至致死剂量 irradiated 的次级受体小鼠体内，以评估其长期自我更新能力（图1）。图2</s...

我们介绍了一种利用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。

自我更新能力和多谱系分化潜能通常被视为造血干细胞的定义性特征……

长期和短期造血干细胞（HSC）的分离方法将有助于研究人员更好地理解HSC区室中细胞更新机制及异质性的生物学基础。已鉴定出一种转录因子Hoxb5，其可能是长期HSC的特异性标志物。基于此发现，研究人员建立了Hoxb5报告基因小鼠品系，并成功分离出长期和短期造血干细胞。开始收集供体骨髓细胞时，用70%乙醇对研钵和研杵进行灭菌，并使其完全干燥。用含有钙、镁离子-free PBS补充剂的细胞染色缓冲液对研钵和研杵进行平衡。将从供体雄性Hoxb5-tri-mCherry小鼠中分离的骨骼放入研钵中，并加入3毫升细胞染色缓冲液。用研杵将骨组织捣开，然后通过轻柔吹打分散细胞团块，并将细胞悬液经100微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。用新鲜的细胞染色缓冲液重复此操作，直至溶液变澄清。通常重复三次即可获得澄清的溶液。从CD45.1.2同源型小鼠中分离出股骨和胫骨后，用锋利的无菌剪刀剪去骨骼两端。使用装有5毫升冰浴细胞悬浮缓冲液的23号针头和注射器，将骨髓冲洗至含有细胞悬浮缓冲液的无菌细胞培养皿中。通过轻柔吹打使细胞团块分散，然后用P1000移液器将细胞悬液经40微米细胞滤网过滤。进行设门设置时，按照文中提供的说明制备样品，并将400微升样品转移至带有35微米细胞滤网扣盖的圆底聚苯乙烯试管中。在分析前，根据试剂生产商的说明，制备并加入死细胞去除试剂。随后，按照仪器生产商的说明，打开流式细胞仪并启动分析软件。然后，按下“加载”以开始采集数据。在排除双细胞、死细胞和谱系标记阳性细胞后，圈选谱系标记阴性、c-kit阳性、Sca-1阳性的细胞群。接着，进一步排除Flk2阳性细胞群。随后，在 CD150 阳性、CD34 阴性或低表达群体中圈选 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性的 pHSCs。接下来，准备一个 1.5 毫升低蛋白结合离心管，加入 600 微升不含钙和镁的 PBS，其中添加 10% 经热灭活的 FBS。为进行 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性 pHSCs 的分选，将已准备的 1.5 毫升低蛋白结合管置于分选收集装置上，按照前述圈选策略，将 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性的 pHSCs 分选至该管中。在第一次分选时，使用分选精度模式下的得率。将预先准备好的饲养细胞置于自动化细胞沉积单元的载物台上，使用96孔板。然后，将1.5毫升低蛋白结合管置于流式细胞仪的上样口。使用前述的分选策略，将 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性的 pHSCs 与饲养细胞共同分选至 96 孔板中。分选 10 个 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性的 pHSCs，以检测其自我更新能力。供体 Hoxb5-tri-mCherry 小鼠骨髓分析的流式细胞术图显示，在定义为谱系阴性、c-kit 阳性、Sca-1 阳性、CD150 阳性、CD34 阴性或弱阳性、Flk2 阴性的 pHSC 亚群中，约有 20% 至 25% 的细胞为 Hoxb5 阳性 pHSCs。此处展示的是受体小鼠外周血分析的代表性流式细胞术图谱。此外，受体小鼠在初次移植后的外周血分析显示，尽管Hoxb5阳性与Hoxb5阴性的pHSCs在移植后四周表现出相似的供体嵌合水平，但持续性造血仅在Hoxb5阳性pHSC受体小鼠中被观察到。Hoxb5阴性的HSCs在移植八周后开始丧失产生造血细胞的能力。在二次移植分析中，仅Hoxb5阳性的pHSC受体小鼠表现出强大的造血功能。相比之下，在Hoxb5阴性pHSC受体小鼠中几乎观察不到供体细胞，提示Hoxb5阴性pHSC在初次移植后16周内已丧失自我更新能力。该实验方案通常需要9至12小时，因此在整个操作过程中应尽可能将样品保持在4摄氏度，以维持细胞活性。

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科研

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Biology

生物学

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