利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

本方案可精确测定同步化出芽酵母细胞中S期的持续时间。该方法快速、简便且可重复。此外，其灵敏度足以检测到经典方案无法发现的轻微合成缺陷。

该方法将对许多从事酿酒酵母细胞周期调控研究的科研人员具有重要意义。本实验方案将由高级研究员 Nicolas Talarek 和实验室博士生 Juan De Dios Barba Tena 进行示范。将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞以较低细胞浓度接种于10毫升SC培养基中，在30°C、130转/分钟振荡条件下过夜培养。

第二天，将细胞用20毫升新鲜的SC培养基稀释，终浓度为每毫升2×10⁶至3×10⁶个细胞。加入40 µL用蒸馏水稀释的1 mg/mL α因子。然后将细胞在30 °C、130 rpm的振荡条件下培养1小时。

重复此步骤一次。在光学显微镜下观察细胞以监测G1期阻滞。若超过90%的细胞呈现“shmoo”形态，其余细胞为圆形未出芽细胞，则继续后续操作。

将样品在1,500 G离心3分钟。然后用真空移液器弃去上清液，并将细胞重悬于20毫升SC培养基中。重复此步骤一次。每5分钟收集两次细胞，每次1毫升，并进行EDU标记。

在释放后30分钟加入400微升α因子。取1毫升细胞培养物转移至含有1微升10毫摩尔EDU的2毫升微量离心管中，通过倒置充分混匀。为了在Pi-EDU双变量流式图中区分EDU阳性细胞与EDU阴性细胞，另取1毫升细胞培养物转移至含有1微升DMSO的2毫升微量离心管中。

在30°C的摇床水浴中振荡孵育3至5分钟。加入100 µL 100%乙醇以终止反应。在微量离心机中于10,000 ×g离心2分钟，收集细胞沉淀。

使用真空移液器吸除上清液。将细胞沉淀重悬于500微升70%乙醇中，涡旋充分混匀。将样品置于室温下，在可调速摇床上以每分钟20次倾斜的速度摇动至少1小时，以透化细胞。

在微量离心机中以10,000 G离心2分钟收集细胞沉淀，用真空移液器弃去上清液。用500微升10%乙醇和PBS将细胞洗涤两次。在微量离心机中以10,000 G离心2分钟收集细胞沉淀，用真空移液器弃去上清液。

将沉淀重悬于含有RNase A和Proteinase K的200微升PBS中。在50摄氏度孵育1至2小时，期间偶尔振荡，或在37摄氏度过夜孵育。在微量离心机中以10,000 G离心2分钟收集细胞沉淀，并用真空移液器弃去上清液。用500微升PBS洗涤细胞。

然后离心收集细胞，并弃去上清液，操作方法如前所述。将细胞沉淀重悬于200 µL含1% BSA的PBS中，在室温下孵育30分钟。

然后离心收集细胞，弃去上清液（操作方法如前所述），并将沉淀重悬于含有1% BSA的300 µL PBS中。将细胞分装至两个1.5 mL微量离心管中：第一管加入200 µL细胞悬液用于Click反应，第二管加入100 µL细胞悬液用于Sytox Green染色。

然后，离心收集细胞并弃去上清液，操作方法如前所述。进行Sytox Green染色时，将细胞沉淀重悬于100 µL PBS中。随后根据细胞浓度，取10至30 µL重悬液转移至含有300 µL Sytox Green染色液的流式细胞仪检测管中。

将样品在40%至50%的振幅下超声处理两次，每次两秒。避光保存，直至在流式细胞仪上处理样品。进行Click反应时，用40 µL新配制的叠氮染料缓冲液重悬细胞沉淀。室温避光孵育60分钟。

离心收集细胞，并弃去上清液，操作方法如前所述。随后用300微升含10%乙醇的PBS溶液洗涤细胞三次。接着将细胞重悬于100微升含50微克/毫升碘化丙啶的PBS溶液中，避光孵育10分钟。

根据细胞浓度，将10至30微升细胞悬液转移至含有300微升50毫摩尔Tris HCl（pH 7.5）的流式细胞仪管中。在40至50的振幅下，超声处理两次，每次两秒。将样品避光保存，直至在流式细胞仪上进行检测。

使用488纳米的激发蓝激光和530/30带通滤光片读取Sytox Green样品。使用488纳米激发蓝激光和615/20带通滤光片（用于PI X轴），以及640纳米激发红激光和660/20带通滤光片（用于Y轴），在散点图上读取Bavaria Pi EDU样品。在双变量EDU PI流式细胞分析中观察到三群细胞。

在 25 摄氏度时，约 27% 的细胞群体处于 G1 期，29% 处于 S 期，约 44% 处于 G2 期和 M 期。在同步化细胞中，根据 Sytox Green 流式细胞仪图谱上 DNA 含量从 1C 变为 2C 的时间，S 期的持续时间可能约为 25 分钟。EDU 脉冲标记可准确测定 S 期的持续时间。

释放后15分钟，检测到一部分EDU阳性细胞，表明S期开始。在Bavaria Pi EDU图中，细胞群向右上方移动，显示细胞正逐步通过S期。最后，在释放后35分钟，一部分细胞呈EDU阴性，但DNA含量加倍，表明S期结束，细胞已进入G2期和M期。

尽管观察到较高的同步性，但部分细胞在释放后60分钟才完成S期，整个细胞群体的S期在释放后约65分钟完成。实现完美的同步化并防止细胞进入第二个S期至关重要。可使用显微镜对细胞进行成像，以监测并量化细胞核DNA复制进程。

该技术将有助于鉴定那些具有轻度 S 期缺陷以及细胞周期持续时间缺陷的易被忽视的突变体。