Name: 使用酿酒酵母中的5-乙炔基-2-脱氧尿苷掺入测定S相持续时间 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学习使用EdU掺入和点击化学技术在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中精确测定S期持续时间的方法。该方案快速、简便且可重复，能够检测传统方法无法发现的轻微合成缺陷，为细胞周期调控研究提供可靠工具。

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作者感谢法国国家研究署（Agence Nationale de la Recherche，ANR）和法国癌症研究协会（Association pour la Recherche sur le Cancer，ARC）为 J.d.D.B.T. 提供的博士奖学金，以及法国国家研究署（ANR）的经费支持（项目编号：ANR-18-CE12-0018-01）。流式细胞术和显微镜实验在蒙彼利埃 MRI BioCampus 成像中心完成。

1. S. cerevisiae 细胞培养
注意：所用的酵母菌株列于表1中
注意：S期持续时间可通过不同方法进行监测。根据所要解决的问题，细胞可在G1期阻滞之后以异步或同步方式培养。
<ol>
	<li>从异步生长的 S. cerevisiae 细胞中获取 
	注意：该方法可用于测定异步生长细胞群体中处于 S 期的细胞百分比。通过测定倍增时间，可推算出 S 期（及其他时期）的持续时间。
	<ol>
		<li>将 S. cerevisiae 细胞接种于 10 mL 合成完全（SC）培养基中，起始细胞浓度较低（5 × 104 个细胞/mL），在 30 ˚C 下以 130 rpm 的转速振荡培养过夜。 
		注意：细胞浓度使用细胞计数仪测定。为有效计算倍增时间，建议从仍处于对数生长期的过夜培养物中接种（即理想情况下浓度低于 2 × 107 个细胞/mL）。不建议在富含营养的培养基（YPD）中培养细胞，因为 EdU 检测效率较低。</li>
		<li>次日，将细胞稀释至 20 mL 新鲜 SC 培养基中，终浓度为 5 × 105 个细胞/mL。</li>
		<li>在 30 ˚C 下，将细胞置于水平摇动的水浴摇床中，以 120 rpm 的转速培养。</li>
		<li>每小时测定一次细胞浓度，直至达到 1 × 107 个细胞/mL。 
		注意：此步骤可用于绘制细胞浓度随时间增长的曲线图。计算倍增时间所用公式见表 2图注说明。</li>
		<li>当细胞浓度约为 2 × 106–5 × 106 个细胞/mL 时，与步骤 2 平行进行 EdU 标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 G1 期同步化的 S. cerevisiae 细胞中获取 
	注意：该方法可通过流式细胞术和/或显微镜分析确定 S 期的起始和结束时间。
	<ol>
		<li>将 S. cerevisiae 细胞接种于 10 mL SC 培养基中，起始细胞浓度较低（5 × 104 个细胞/mL），在 30 ˚C 下以 130 rpm 的转速振荡培养过夜。 
		注意：参见步骤 1.1.1 后的注释。</li>
		<li>次日，将细胞稀释至 20 mL 新鲜 SC 培养基中，终浓度为 2 × 106–3 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>加入 40 µL 用蒸馏水稀释的 1 mg/mL α-因子。</li>
		<li>在 30 ˚C 下以 130 rpm 的转速振荡培养 1 小时。</li>
		<li>再次加入 40 µL 用蒸馏水稀释的 1 mg/mL α-因子。</li>
		<li>在 30 ˚C 下以 130 rpm 的转速振荡培养 1 小时。</li>
		<li>在光学显微镜下观察细胞，以监测 G1 期阻滞情况。若超过 90% 的细胞呈现“香肠”状（shmoo 形态），其余为圆形无芽细胞，则可继续后续操作。 
		注意：根据菌株背景不同，建议在观察 shmoo 形态前对细胞进行超声处理。对于 W303 背景，建议以 40–50 振幅进行 2 次、每次 2 秒的超声处理。</li>
		<li>以 1,500 × g 离心 3 分钟，用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于 20 mL SC 培养基中。</li>
		<li>重复步骤 1.2.8–1.2.9 一次。 
		注意：通过上述步骤洗去 α-因子，使细胞重新进入细胞周期。或者，也可使用连接真空泵的侧臂烧瓶和 1.2 µm 硝酸纤维素滤膜过滤酵母细胞，以去除 α-因子。</li>
		<li>在释放后，每 5 分钟收集 1 mL 细胞（每个时间点收集两份），并进行步骤 2 的 EdU 标记。 
		注意：仅对两份样品中的一份进行 EdU 脉冲标记。未标记的细胞用于在双变量碘化丙啶（PI）-EdU 图中区分 EdU 阳性与 EdU 阴性细胞。</li>
		<li>在释放后 30 分钟，加入 400 µL 用蒸馏水稀释的 1 mg/mL α-因子。 
		&#8203;注意：需要使用高剂量 α-因子以使细胞在下一个细胞周期的 G1 期发生阻滞，防止其再次进入后续的 S 期。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. EdU 标记
<ol>
	<li>将1 mL细胞培养物转移至含有1 µL 10 mM EdU的2.0 mL微量离心管中。颠倒混匀。 
	注意：为了在PI-EdU双变量流式细胞分析中区分EdU阳性细胞与EdU阴性细胞，另取1 mL细胞培养物转移至含有1 µL DMSO的2.0 mL微量离心管中。</li>
	<li>在30 ˚C的摇床水浴中振荡孵育3-5分钟。 
	注意：使用显微镜检测EdU时，3分钟已足够；而使用流式细胞仪进行EdU检测则需5分钟以获得最佳效果。</li>
	<li>加入100 µL 100%乙醇以终止反应。
	<ol>
		<li>如需测量细胞大小，可通过加入100 µL 20%多聚甲醛终止反应。 
		注意：如果在Click反应后还需进一步分析有丝分裂细胞的核结构，建议在室温（RT）下使用2%多聚甲醛固定细胞，而不是将细胞置于冰上，因为后者会导致微管去聚合。</li>
		<li>在室温下，将细胞置于可调速摇床（20次倾斜/分钟）上轻微振荡10分钟，然后加入100 µL 100%乙醇固定细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞固定与通透化
<ol>
	<li>10,000 × g 离心 2 分钟收集细胞 g 在微量离心机中离心。使用真空移液器移除上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于500 µL 70%乙醇中，涡旋充分混匀。</li>
	<li>在可调速摇床上，室温、20 倾斜/分钟条件下孵育 ≥1 小时，以透化细胞。 
	&#8203;注意：在SC培养基中培养的细胞不易形成沉淀，因其容易粘附于微量离心管管壁。加入乙醇可改善沉淀效果，减少细胞损失。细胞可在4 ˚C短期保存过夜，或在−20 ˚C长期保存。</li>
	<li>将细胞在10,000 × g下离心2分钟 g 在微量离心机中离心。用真空移液器弃去上清液。</li>
	<li>用 PBS 配制的 10% 乙醇溶液洗涤细胞 2 次，每次 500 µL。 
	&#8203;注意：洗涤步骤至关重要，用于去除细胞中未掺入的 EdU。</li>
</ol>
4. 点击化学反应
<ol>
	<li>用于流式细胞术分析
	<ol>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于 200 µL 含有 0.1 mg/mL RNase A 和 0.2 mg/mL 蛋白酶 K 的 PBS 中。</li>
		<li>在 50 °C 下孵育 1–2 小时，期间偶尔振荡（或在 37 °C 下过夜孵育）。</li>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>用 500 µL PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 200 µL PBS + 1% 牛血清白蛋白（BSA）中。室温孵育 30 分钟。 
		注意：更长的孵育时间并非必要，反而可能对 Click 反应效率产生不利影响。</li>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于 300 µL PBS + 1% BSA 中。</li>
		<li>将细胞分装至两个离心管中：200 µL 加入 1.5 mL 微量离心管用于 Click 反应，100 µL 加入另一 1.5 mL 微量离心管用于 Sytox Green 染色。</li>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>用于 Sytox Green 染色 
		注意：我们强烈建议取一份样品进行 Sytox Green 染色（不进行 Click 反应），以获得高质量的 DNA 含量参考图谱。事实上，Click 反应会强烈淬灭嵌入染料的荧光，包括 Sytox Green 和 PI 的荧光。因此，Click 反应可能扭曲 DNA 含量的读数。
		<ol>
			<li>将细胞沉淀重悬于 100 µL PBS 中。</li>
			<li>取 10–30 µL（根据细胞浓度而定）转移至流式细胞仪检测管中，该管内已含有 300 µL 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）和 0.5 µM Sytox Green。</li>
			<li>以 40–50 的振幅超声处理 2 次，每次 2 秒。</li>
			<li>避光保存，直至在流式细胞仪上检测样品。 
			注意：此步骤的细胞可在 4 ˚C 保存数天。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用于 Click 反应
		<ol>
			<li>通过按以下顺序混合试剂，新鲜配制叠氮染料缓冲液（每管用量）：36 µL PBS、2 µL 0.2 M CuSO4、0.2 µL 2 mM Cy5 叠氮化物、2 µL 1 M 抗坏血酸。 
			注意：可预先配制叠氮染料缓冲液的主混合液，但试剂必须按上述相同顺序混合。</li>
			<li>用 40 µL 新鲜配制的叠氮染料混合液重悬细胞沉淀。室温避光孵育 60 分钟。</li>
			<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
			<li>用 PBS 中含 10% 乙醇的溶液洗涤细胞 3 次，每次 300 µL。 
			注意：洗涤步骤至关重要，用于彻底去除可溶性的 EdU-Cy5 叠氮化物。</li>
			<li>将细胞重悬于 100 µL PBS 中含 50 µg/mL PI 的溶液。避光放置 10 分钟。</li>
			<li>取 10–30 µL 细胞悬液（根据细胞浓度而定）转移至流式细胞仪检测管中，该管内已含有 300 µL 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）。</li>
			<li>以 40–50 的振幅超声处理 2 次，每次 2 秒。</li>
			<li>避光保存，直至在流式细胞仪上检测样品。 
			注意：此步骤的细胞可在 4 ˚C 保存数天。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 488 nm 蓝光激光激发和 530/30 BP 滤光片读取 Sytox Green 样品。典型结果见图 1A。使用点图读取双变量 PI-EdU 样品，PI 检测使用 488 nm 蓝光激光激发和 615/20 BP 滤光片（x 轴），EdU 检测使用 640 nm 红光激光激发和 660/20 BP 滤光片（y 轴）。典型结果见图 1B。 
		注意：图 1C 展示了 EdU 阴性细胞典型的 PI-EdU 双变量流式细胞术结果，可用于区分 EdU 阴性细胞与 EdU 阳性细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于显微镜分析
	<ol>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于 200 µL PBS + 1% BSA 中。室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>通过按以下顺序混合试剂，新鲜配制叠氮染料缓冲液（每管用量）：36 µL PBS、2 µL 0.2 M CuSO4、0.2 µL 2 mM Dy-530 叠氮化物、2 µL 1 M 抗坏血酸。 
		注意：可通过按上述顺序混合试剂，新鲜配制叠氮染料缓冲液的主混合液。</li>
		<li>用 40 µL 新鲜配制的叠氮染料缓冲液重悬沉淀。室温避光孵育 60 分钟。</li>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>用 PBS 中含 10% 乙醇的溶液洗涤细胞 2 次，每次 300 µL。 
		注意：洗涤步骤至关重要，用于彻底去除可溶性的 Dy-530 叠氮化物。</li>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于 100 µL PBS 中含 0.5 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的溶液中。室温避光放置 30 分钟。</li>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>用 300 µL PBS 洗涤，以去除过量 DAPI。</li>
		<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。用真空移液器弃去上清液。</li>
		<li>根据细胞浓度，用 10–50 µL PBS 重悬沉淀。</li>
		<li>以 40–50 的振幅超声处理 2 次，每次 2 秒。 
		注意：此步骤的细胞可在 4 ˚C 保存数天。</li>
		<li>取 1.7 µL 细胞悬液滴加至玻璃载玻片上，加盖洁净的盖玻片。</li>
		<li>立即使用配备 DAPI 和 TexasRed 或 Cy3 滤光片的荧光显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

酵母是细胞周期研究的理想模式生物，但长期以来，由于其无法掺入外源核苷类似物（如用于标记DNA复制的BrdU），导致对其S期的表征受到阻碍。通过在酵母中高表达单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）并引入人源核苷转运蛋白（hENT），这一问题已基本得到解决15,16。与BrdU相比，EdU具有更高的适用性，因其可通过小分子荧光叠氮化物与“点击化学”（Click chemistry）进行检测，适用于透化的酵母细胞，并可用于流式细胞术（FACS）分析，而抗BrdU抗体则难以实现这一点17。本文中，我们优化了TK-hENT1菌株中EdU标记与检测的实验条件，并证明利用该方案可通过FACS或显微镜定量检测此前难以发现的DNA复制缺陷。
在生物学研究中，使用可能干扰目标生物学机制的工具来研究该机制是一个常见问题。由于 EdU 具有已知的细胞毒性效应，我们筛选了在慢性暴露条件下对经基因改造的 TK-hENT1 菌株无毒的 EdU 浓度，发现 1...

通过有丝分裂维持基因组稳定性，依赖于将一套完整且均等的染色体传递给两个子代细胞。这一过程依赖于在细胞周期各个阶段特定时间内精确完成一系列事件。在G1期，多个复制起始许可因子（包括Cdc61）被招募，从而完成复制起始位点的许可。在S期，全基因组复制从多个活跃的复制起始位点启动，并由聚集在显微镜下可见的复制工厂（replication factories）中的复制机器执行2。在M期，复制完成的姐妹染色单体附着于有丝分裂纺锤体并实现双向取向，从而使其能够分离至有丝分裂细胞的两极3。各阶段的调控、正确完成及其持续时间对于维持基因组稳定性至关重要。事实上，任一阶段的过早退出均会导致基因组不稳定。例如，通过缺失芽殖酵母CDK抑制因子Sic1或过表达G1期周期蛋白而引起的G1期缩短，将影响后续S期的正常进行4,5,6。因此，这些调控异常——无论是否伴随复制应激——会导致染色体断裂、重排以及错误分离4,5,6。因此，监测S期的持续时间，以及更广泛地监测细胞周期其他各阶段的持续时间，对于识别不同突变体及不同应激条件下发生的缺陷可能至关重要。
一种测量细胞周期时相持续时间的传统方法包括简单的DNA含量流式细胞术（图1A）并依赖于一种拟合算法（大多数流式细胞仪软件中均提供），该算法用于将细胞群体划分为 G1，S 和 G2 + 来自1C和2C峰的M期细胞比例。将这些比例乘以群体倍增时间7然而，该方法仅能提供估算值，要求特定细胞群体内细胞大小分布均一，且不适用于同步培养的细胞。为研究哺乳动物细胞中S期的持续时间，已开发并广泛使用了多种胸腺嘧啶类似物，包括EdU。这些类似物可通过细胞外介质摄取，并由胸腺嘧啶激酶（下文简称TK）催化磷酸化，从而被DNA聚合酶用于在DNA合成位点（复制、重组、修复）掺入DNA。为克服某些细胞缺乏TK基因的问题， 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 细胞，已对酵母菌株进行基因改造以实现单纯疱疹病毒TK的稳定且组成型表达8 人平衡核苷转运蛋白（hENT1）9. 一旦掺入DNA，EdU即可被检测到 通过 选择性点击反应，可将炔基部分与叠氮修饰的荧光染料进行化学偶联10.
本文提供了两种优化的综合性方案，用于对异步和同步的TK-hENT1基因工程细胞进行EdU脉冲标记，从而通过显微镜和流式细胞术在单细胞和群体水平上以高空间和时间分辨率精确可视化并测量DNA复制的持续时间与动态过程，以及其他细胞周期时相的持续时间。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-因子&amp;nbsp;</td><td>Genescript</td><td>RP01002</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Euromedex</td><td>04-100--812-E</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜</td><td>Sigma</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>二磺酸-Cyanine5 叠氮化物（Cy5叠氮化物）</td><td>Interchim</td><td>FP-JV6320</td><td>可替代Alexa647-叠氮化物</td></tr><tr><td>Dy-530 叠氮化物</td><td>Dyomics</td><td>&amp;nbsp;530-10</td><td></td></tr><tr><td>EdU（5-乙炔基-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷）</td><td>Carbosynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Carlo Erba reagents</td><td>P013A10D16</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Euromedex</td><td>EU0090</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>SIGMA</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Invitrogen</td><td>S-7020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>OLS</td><td>CASY</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Agilent</td><td>NovoSampler Pro</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Infors</td><td>444-4230</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>振荡水浴锅</td><td>Julabo</td><td>SW22</td><td>或等效产品</td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Sonics</td><td>Vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>宽场显微镜</td><td>Leica</td><td>THUNDER Imager</td><td>或等效产品</td></tr></tbody></table>

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）的s期持续时间

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

真核生物DNA复制是一个受到高度调控的过程，可确保细胞在染色体分离之前准确复制其遗传蓝图。由于DNA合成缺陷会导致染色体重排，监测DNA复制已成为理解基因组不稳定性基础的关键。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是研究细胞周期调控的经典模型，但一些关键的DNA复制参数，例如处于S期的细胞比例或S期持续时间，仍然难以确定。本实验方案利用短时间且无毒的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）脉冲标记，EdU是一种胸苷类似物，在经过基因工程改造表达TK-hENT1的酵母细胞中引入，随后通过点击化学反应进行检测，从而可在单细胞和群体水平上，利用显微镜和流式细胞术实现对DNA复制的高时空分辨率可视化与定量分析。该方法可识别酵母突变体在S期及细胞周期进程中的先前被忽视的缺陷，进而有助于鉴定对维持基因组稳定性至关重要的新因子。

为确定 S 期持续时间，以及更广泛地确定 G1 期和 G2 + M 期的持续时间（方案步骤 1.1），将 S. cerevisiae W303 野生型细胞（WT，表 1）在 SC 培养基中异步培养 7 小时。每小时监测细胞浓度以确定倍增时间（图 2B）。在此培养条件下，25 °C 时计算得到的倍增时间为 120 分钟 ± 13 分钟（表 2）。当细胞处于对数生长期（2 × 106–5 × 106 个细胞/mL）时，取一部分细胞用 EdU（10 µM）脉冲标记 5 分钟，以特异性标记处于 S 期的细胞，并测定处于 G1、S 和 G2 + M 期的细胞百分比。通过 EdU-PI 双参数流式细胞分析可观察到三群细胞（图 1B）。通过对照实验确定 EdU 阴性与 EdU 阳性细胞群的界限，该对照中细胞未进行 Ed...

我们描述了两种互补的实验方案，可准确测定S期持续时间 S. cerevisiae 使用EdU（一种胸苷类似物），其可被掺入 体内 并通过显微镜和流式细胞术利用点击化学进行检测。该方法可简便地表征DNA复制的持续时间，并发现突变体中被忽视的复制缺陷。

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

真核生物DNA复制是一个受到高度调控的过程，可确保细胞在染色体分离之前准确地复制其遗传蓝图。

本方案可精确测定同步化出芽酵母细胞中S期的持续时间。该方法快速、简便且可重复。此外，其灵敏度足以检测到经典方案无法发现的轻微合成缺陷。该方法将对许多从事酿酒酵母细胞周期调控研究的科研人员具有重要意义。本实验方案将由高级研究员 Nicolas Talarek 和实验室博士生 Juan De Dios Barba Tena 进行示范。将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞以较低细胞浓度接种于10毫升SC培养基中，在30°C、130转/分钟振荡条件下过夜培养。第二天，将细胞用20毫升新鲜的SC培养基稀释，终浓度为每毫升2×10⁶至3×10⁶个细胞。加入40 µL用蒸馏水稀释的1 mg/mL α因子。然后将细胞在30 °C、130 rpm的振荡条件下培养1小时。重复此步骤一次。在光学显微镜下观察细胞以监测G1期阻滞。若超过90%的细胞呈现“shmoo”形态，其余细胞为圆形未出芽细胞，则继续后续操作。将样品在1,500 G离心3分钟。然后用真空移液器弃去上清液，并将细胞重悬于20毫升SC培养基中。重复此步骤一次。每5分钟收集两次细胞，每次1毫升，并进行EDU标记。在释放后30分钟加入400微升α因子。取1毫升细胞培养物转移至含有1微升10毫摩尔EDU的2毫升微量离心管中，通过倒置充分混匀。为了在Pi-EDU双变量流式图中区分EDU阳性细胞与EDU阴性细胞，另取1毫升细胞培养物转移至含有1微升DMSO的2毫升微量离心管中。在30°C的摇床水浴中振荡孵育3至5分钟。加入100 µL 100%乙醇以终止反应。在微量离心机中于10,000 ×g离心2分钟，收集细胞沉淀。使用真空移液器吸除上清液。将细胞沉淀重悬于500微升70%乙醇中，涡旋充分混匀。将样品置于室温下，在可调速摇床上以每分钟20次倾斜的速度摇动至少1小时，以透化细胞。在微量离心机中以10,000 G离心2分钟收集细胞沉淀，用真空移液器弃去上清液。用500微升10%乙醇和PBS将细胞洗涤两次。在微量离心机中以10,000 G离心2分钟收集细胞沉淀，用真空移液器弃去上清液。将沉淀重悬于含有RNase A和Proteinase K的200微升PBS中。在50摄氏度孵育1至2小时，期间偶尔振荡，或在37摄氏度过夜孵育。在微量离心机中以10,000 G离心2分钟收集细胞沉淀，并用真空移液器弃去上清液。用500微升PBS洗涤细胞。然后离心收集细胞，并弃去上清液，操作方法如前所述。将细胞沉淀重悬于200 µL含1% BSA的PBS中，在室温下孵育30分钟。然后离心收集细胞，弃去上清液（操作方法如前所述），并将沉淀重悬于含有1% BSA的300 µL PBS中。将细胞分装至两个1.5 mL微量离心管中：第一管加入200 µL细胞悬液用于Click反应，第二管加入100 µL细胞悬液用于Sytox Green染色。然后，离心收集细胞并弃去上清液，操作方法如前所述。进行Sytox Green染色时，将细胞沉淀重悬于100 µL PBS中。随后根据细胞浓度，取10至30 µL重悬液转移至含有300 µL Sytox Green染色液的流式细胞仪检测管中。将样品在40%至50%的振幅下超声处理两次，每次两秒。避光保存，直至在流式细胞仪上处理样品。进行Click反应时，用40 µL新配制的叠氮染料缓冲液重悬细胞沉淀。室温避光孵育60分钟。离心收集细胞，并弃去上清液，操作方法如前所述。随后用300微升含10%乙醇的PBS溶液洗涤细胞三次。接着将细胞重悬于100微升含50微克/毫升碘化丙啶的PBS溶液中，避光孵育10分钟。根据细胞浓度，将10至30微升细胞悬液转移至含有300微升50毫摩尔Tris HCl（pH 7.5）的流式细胞仪管中。在40至50的振幅下，超声处理两次，每次两秒。将样品避光保存，直至在流式细胞仪上进行检测。使用488纳米的激发蓝激光和530/30带通滤光片读取Sytox Green样品。使用488纳米激发蓝激光和615/20带通滤光片（用于PI X轴），以及640纳米激发红激光和660/20带通滤光片（用于Y轴），在散点图上读取Bavaria Pi EDU样品。在双变量EDU PI流式细胞分析中观察到三群细胞。在 25 摄氏度时，约 27% 的细胞群体处于 G1 期，29% 处于 S 期，约 44% 处于 G2 期和 M 期。在同步化细胞中，根据 Sytox Green 流式细胞仪图谱上 DNA 含量从 1C 变为 2C 的时间，S 期的持续时间可能约为 25 分钟。EDU 脉冲标记可准确测定 S 期的持续时间。释放后15分钟，检测到一部分EDU阳性细胞，表明S期开始。在Bavaria Pi EDU图中，细胞群向右上方移动，显示细胞正逐步通过S期。最后，在释放后35分钟，一部分细胞呈EDU阴性，但DNA含量加倍，表明S期结束，细胞已进入G2期和M期。尽管观察到较高的同步性，但部分细胞在释放后60分钟才完成S期，整个细胞群体的S期在释放后约65分钟完成。实现完美的同步化并防止细胞进入第二个S期至关重要。可使用显微镜对细胞进行成像，以监测并量化细胞核DNA复制进程。该技术将有助于鉴定那些具有轻度 S 期缺陷以及细胞周期持续时间缺陷的易被忽视的突变体。

determination-s-phase-duration-using-5-ethynyl-2-deoxyuridine

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用酿酒酵母中的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入测定S相持续时间

一种用于分析染色体复制时间的定量方法。该方法利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入与荧光 原位...

染色体复制时间分析与荧光原位杂交相结合

本文概述了如何研究一种（细胞周期）激酶在线粒体中的定位，以及如何确定其在线粒体内的亚结构定位和潜在的线粒体底物或靶标。将蛋白强制表达于线粒体中，是研究目的蛋白在线粒体定位后所产生功能效应的有效工具。...

研究核细胞周期激酶Cdk1在线粒体定位与功能的实验方法

本文所述方案基于对经4-硫尿嘧啶标记的酵母细胞中纯化的新生mRNA进行全基因组水平的定量分析。该方法能够将mRNA合成与mRNA降解过程分离，从而准确测量RNA聚合酶II的转录活性。...

Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标

本文描述了一种基于成像的方法，可用于利用胸苷类似物EdU鉴定秀丽隐杆线虫（C.

细胞周期分析在 秀丽隐杆线虫 使用胸苷类似物EdU标记生殖系

本方案将细胞周期检测方法适配于质谱流式细胞技术平台。利用质谱流式细胞技术的多参数检测能力，通过直接测量碘的掺入可识别处于S期的细胞，同时借助细胞内周期标志物，能够在多种实验条件下对各细胞周期时相进行表征。...

利用嘧啶类似物5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）与细胞周期标志物结合在质谱流式细胞平台中确定细胞周期时相

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和磷酸化组蛋白H3（pH3）标记进行细胞周期分析是一种多步骤实验流程，可能需要进行大量优化。本文提供了一个详细方案，描述了该流程的全部步骤，包括图像分析和定量方法，以区分处于不同细胞周期阶段的细胞。...

5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸化组蛋白 H3 双标记细胞周期进程分析方案 果蝇 神经干细胞

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces...

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

延时显微镜是研究芽殖酵母减数分裂的有力工具。本实验方案结合了细胞周期同步化、延时显微镜观察以及目标蛋白的条件性耗竭方法，展示了如何研究特定蛋白在减数分裂染色体分离过程中的功能。...

利用延时显微镜和时期特异性蛋白质核内耗竭研究减数分裂 S. cerevisiae

以下实验方案介绍了通过细胞周期同步化后进行RPA2免疫荧光染色，以检测细胞周期G1期中单链DNA焦点的方法。...

可视化细胞周期G1期中的单链DNA焦点

蛋白相关新生DNA富集与测序技术（eSPAN）旨在检测染色质相关蛋白在两条复制DNA链上的相对丰度，从而揭示染色质复制及其偶联过程的分子机制。本实验方案描述了在酵母和小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中进行eSPAN的操作步骤。...

通过富集和测序蛋白质相关新生DNA方法对复制DNA链上蛋白质进行链特异性分析

RNA二级结构主要通过结构探针技术在成熟RNA中进行观察。共转录结构追踪测序技术（CoSTseq）将已用于研究聚合酶在新生RNA上位置的核内延伸技术与结构探针技术相结合，从而实现了对处于活跃转录过程中的RNA的二级结构的观测。...

新生转录本与成熟转录本的RNA结构比较分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

学习使用EdU掺入和点击化学技术在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中精确测定S期持续时间的方法。该方案快速、简便且可重复，能够检测传统方法无法发现的轻微合成缺陷，为细胞周期调控研究提供可靠工具。

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

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