Name: 肝癌组织来源于小细胞外囊泡的富集方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学习优化差速超速离心法富集肝癌组织来源小细胞外囊泡的技术。该方法操作简便，可获得高纯度囊泡，为肿瘤生物学研究提供可靠方法学支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢赣南医科大学第一附属医院对本工作的支持。&#160;本工作受到国家自然科学基金（项目编号 82260422）的资助。

人肝癌组织来自赣南医科大学第一附属医院诊断为肝恶性肿瘤的患者。所有患者均签署了知情同意书，人组织样本的收集已获得赣南医科大学第一附属医院伦理委员会的批准。有关本实验方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。
1. 准备
<ol>
	<li>将转移脱色摇床放入培养箱中，并将温度设置为 37 °C。所有其他所需设备见图1。</li>
	<li>用 75% 酒精喷洒手术刀和镊子进行清洁。</li>
	<li>通过量取 6 mg 胶原酶 D（4 mg/mL）和 24 µL DNase Ι（80 U/mL），加入 1.5 mL RPMI-1640 基础培养基中，配制消化液。轻轻倒置混匀，直至添加剂完全溶解。</li>
	<li>预先用 1×磷酸盐缓冲液（PBS）润湿 70 µm 和 0.22 µm 细胞筛。</li>
	<li>将一个 100 mm 无菌细胞培养皿置于冰盒上，用于解冻后放置肝组织。</li>
	<li>在肝细胞癌组织分离后的 15 分钟内，用 PBS 冲洗组织块表面的血液，将组织转移至无菌冻存管中，并在 −80 °C 保存，直至实验开始，保存时间不超过 2 周。</li>
</ol>
2. 组织解离
<ol>
	<li>从 −80 °C 冰箱中取出组织样本，将约 400 mg 组织切成 2 mm × 2 mm × 2 mm 的碎片，放入置于冰盒上的 10 cm 细胞培养皿中。</li>
	<li>将组织转移至含有 1.5 mL 消化液的 6 孔板中，然后将板置于转移式脱色摇床（20 rpm/min）上，在 37 °C 下孵育 20 分钟，以实现肝癌组织的完全解离并释放 sEVs。</li>
	<li>从孵育器中取出 6 孔板并置于冰盒上。加入 80 µL 磷酸酶抑制剂和 200 µL 完全蛋白酶抑制剂溶液，以终止消化反应。</li>
	<li>将消化液转移至 70 µm 细胞筛中，缓慢过滤以去除任何大块组织碎片。收集滤液并置于 2 mL 离心管中。</li>
</ol>
3. 差速超速离心
注意：所有离心步骤均需在 4 °C 下进行。
<ol>
	<li>将滤液在 500 × g 10 分钟后收集上清液至新的 2 mL 离心管中。大部分细小的组织碎片即可被去除。</li>
	<li>离心上清液，3,000 × g 孵育20分钟以去除细胞碎片。小心地将上清液转移至新的离心管中，直至移液器吸头即将接触到表面的白色物质为止。</li>
	<li>将剩余液体在3,000 × g离心3分钟，然后吸除上清液以利于囊泡的收集。为确保小细胞外囊泡（sEVs）的纯度，注意勿吸出白色物质。</li>
	<li>将收集的上清液在12,000 × g 孵育20分钟，将900 µL上清液转移至4.7 mL超速离心管中。将剩余液体在12,000 × g 3 分钟后收集并混合两个上清液至同一超速离心管中，用 PBS 完全充满该管。</li>
	<li>将上清液在 100,000 × g 60分钟。弃去上清液，用PBS填充超速离心管以重悬沉淀，再于100,000 × g条件下离心。 g 孵育60分钟。用50 µL PBS重悬沉淀。</li>
	<li>使用1 mL无菌注射器吸取sEV悬液，经0.22 µm膜过滤器过滤。将滤液收集至600 µL离心管中，于−80 °C保存，以备后续分析。</li>
</ol>
4. 富集质量的评估
<ol>
	<li>在透射电子显微镜下观察sEVs的形态。
	<ol>
		<li>取10 µL sEV样品滴加到铜网上，室温孵育10分钟，用无菌蒸馏水清洗，并用吸水纸吸去多余液体。</li>
		<li>向铜网上滴加10 µL 2%醋酸铀溶液进行负染1分钟，用滤纸吸去铜网表面液体，并在白炽灯下干燥2分钟。</li>
		<li>在透射电子显微镜下观察铜网，于80 kV条件下成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用纳米颗粒流式细胞仪测定sEVs的粒径分布和纯度。
	<ol>
		<li>启动仪器前，准备含有以下液体的离心管：200 µL质控品、200 µL二氧化硅纳米球、2 × 200 µL超纯水、2 × 200 µL清洗液以及200 µL PBS。 
		注意：在检测sEV样品前，必须对仪器进行质量控制，并测试粒径标准品（需在相同检测条件下，利用不同直径[68–155 nm]的多种纳米微球生成标准曲线，以计算粒径分布）。质控微球和二氧化硅纳米球用超纯水稀释100倍，总体积为200 µL。</li>
		<li>检查清洗液体积（&#62;10 mL），并注意鞘液与废液液面之间的高度差（20–30 cm）。</li>
		<li>关闭仪器主电源；20秒后开启计算机，等待蜂鸣声提示仪器已正确连接，随后运行软件。</li>
		<li>点击Start Up以开启相机、激光器和气泵。</li>
		<li>点击Sheath Flow-Start Up，并将超纯水置于加样平台。4分钟后（仪器倒计时结束），点击Sample-Boosting | Sample-Unload。</li>
		<li>30秒后，将空白管置于加样平台，点击Sample-Boosting | Sample-Unload。然后将装有超纯水的离心管置于加样平台，同时点击Sample-Boosting | Sheath Flow-Purge。</li>
		<li>点击Manual Operation，将粒子浓度管置于加样平台，点击Sample-Boosting持续1分钟，并同时在&#34;SAMP. Inf.&#34;中选择250 nm Std FL SiNPs质控。</li>
		<li>点击Sample-Sampling，并通过点击SPCM开启检测器。 
		注意：此时可观察到实时信号波形。</li>
		<li>点击Auto Sampling，在Sampling SET中输入1.0，将压力固定为1 KPa。点击toolbar，选择Large Signal。</li>
		<li>调节激光的水平位置，将激光设为2 µm；然后点击L或R，确保信号强且均匀。</li>
		<li>点击Time to Record以采集数据，完成后数据将自动跳转至Buffer。随后将数据保存为Naf文件，并点击Sample-Unload。</li>
		<li>将清洗液管置于加样平台，点击Sample-Boosting，1分钟后点击Sample-Unload。使用超纯水冲洗毛细管尖端残留的清洗液。</li>
		<li>将粒径标准品管置于加样平台，点击Sample-Boosting持续1分钟。</li>
		<li>在&#34;SAMP. Inf&#34;中选择68-155 nm Std FL SiNPs质控，点击Sample-Sampling。然后点击toolbar，选择Small Signal。</li>
		<li>点击Time to Record以采集数据，完成后数据将自动跳转至Buffer。随后将数据保存为Naf文件，并点击Sample-Unload。</li>
		<li>将清洗液管置于加样平台，点击Sample-Boosting，1分钟后点击Sample-Unload。使用超纯水冲洗毛细管尖端残留的清洗液。</li>
		<li>将PBS管置于加样平台，点击Sample-Boosting持续1分钟。</li>
		<li>在&#34;SAMP. Inf&#34;中选择68-155 nm Std FL SiNPs质控，点击Sample-Sampling。然后点击toolbar，选择Small Signal。</li>
		<li>点击Time to Record以采集数据，完成后数据将自动跳转至Buffer。将数据保存为Naf文件，并点击Sample-Unload。</li>
		<li>将清洗液管置于加样平台，点击Sample-Boosting，1分钟后点击Sample-Unload。使用超纯水冲洗毛细管尖端残留的清洗液。</li>
		<li>按照步骤4.2.17–4.2.20所述检查样品信息；将PBS（步骤4.2.17）替换为sEV样品，并分析数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过蛋白质印迹法进一步鉴定sEVs。
	<ol>
		<li>根据BCA蛋白定量试剂盒说明书，测定sEVs和组织的蛋白浓度。</li>
		<li>根据定量结果计算sEVs的上样体积（例如每孔5 µg蛋白），按1:4比例加入上样缓冲液，并涡旋混匀。</li>
		<li>在100 °C金属浴（干式恒温器）中变性10分钟后，于12%聚丙烯酰胺凝胶中以60 V电泳80分钟分离蛋白。</li>
		<li>使用转膜缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20%甲醇），在220 mA电流下将凝胶中的蛋白转移至0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，持续2小时。</li>
		<li>用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水吐温（TBST）溶液室温封闭1小时，随后与一抗（兔单克隆抗人CD9抗体、兔单克隆抗人CD63抗体、兔单克隆抗人TSG101抗体、鼠单克隆抗人GM130抗体）在4 °C孵育过夜。一抗用5%脱脂奶粉按1:1,000比例稀释。</li>
		<li>用TBST洗涤三次后，室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1小时。</li>
		<li>使用ECL化学发光底物检测HRP标记的抗体，随后采集并分析图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
<li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li>
<li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer+development%2C+metastasis%2C+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).</li>
<li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li>
<li>Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver%2C+heart%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li>
<li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
<li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li>
<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一种从肝癌组织中可重复提取小细胞外囊泡（sEVs）的方法。通过精细的组织分离、消化酶处理、差速超速离心以及0.22 µm滤膜过滤与纯化，可获得高质量的sEVs。在进行下游分析时，确保sEVs的高纯度极为重要。在差速离心过程中，上清液表面会出现一层白色物质（成分未知）。由于该层物质会污染sEVs，我们通过多次离心（3,000 × g 和 12,000 × g）并结合0.22 µm滤膜过滤，尽可能将其去除（补充表S1）。由于该白色层的干扰，在吸取上清液时存在损失sEVs的风险。因此，必须谨慎进行多次离心操作，并在不接触白色物质的前提下，尽可能小心地收集上清液。
该方案可纯化高质量的肝脏组织来源sEVs，但也存在一些局限性。在这些实验中，组织块的体积通常约为300–500 mg。从极小的组织块中分离出的sEVs数量过少，难以支持后续研究。考虑到消化液体积对组织来源sEVs产量的影响，过大的组织块应分割为若干部分进行提取，或增加消化酶的用量，以确保充分获取组织来源的sEVs。此外，sEVs的分离方法需根据组织...

小细胞外囊泡（sEVs）直径约为30 nm至150 nm，由多种细胞分泌1。它们可通过向各种器官、组织、细胞及细胞内部位转运脂质、蛋白质、DNA和RNA等重要生物分子，与组织细胞进行通讯，并调控局部或远端微环境，从而改变受体细胞的行为2,3。因此，在研究sEVs于疾病发生和发展过程中的生物学行为时，特异性sEVs的分离与纯化是必不可少的前提。差速超速离心法被视为金标准，常用于从sEVs正常存在的组织中分离sEVs4。该技术可去除组织碎片、细胞碎片、大囊泡及凋亡小体，仅保留sEVs。
研究表明，胶原酶D和DNase I不会影响细胞或囊泡的分子特性，这两种酶的特性均有助于细胞外基质中囊泡的释放5。这些酶已被用于从人类转移性黑色素瘤组织、结肠癌组织以及结肠黏膜组织中提取小细胞外囊泡（sEVs）5,6,7。然而，这些方法中胶原酶D和DNase I的浓度及消化时间存在差异，导致结论不一致。为避免其他sEV亚型的共沉淀，研究人员通过过滤和/或差速离心去除了较大尺寸的细胞外囊泡（直径为0.1 µm或0.2 µm）8。根据组织来源的不同，可能需要采用不同的分离与纯化方法9,10。
采用传统的差速超速离心法从肝组织中提取小细胞外囊泡（sEVs）时，上清液表面会形成一层白色物质，但无法确定其性质。在之前的一项研究11中发现，这层白色物质会影响sEVs的纯度。尽管采用传统方法分离的样本其颗粒数量和蛋白浓度高于本方法，但变异系数较大，可能是因为大量污染物导致实验结果重复性较差。通过去垢剂处理（即检测颗粒在1% Triton X-100中的溶解性）发现，本方法获得的sEVs纯度更高。因此，我们采用该方法分离和纯化来源于结直肠癌组织的sEVs，用于蛋白质组学研究。
目前，关于肝癌中sEVs的研究主要集中于血清、血浆以及细胞培养上清液12,13,14。然而，来源于肝癌组织的sEVs能够更准确地反映肝癌的生理病理状态及其周围微环境，并有效避免其他EVs的降解和污染15,16。本方法通过差速超速离心技术，可提高sEVs的得率并获得高质量的样本，为肝癌的深入研究提供了重要基础。该方法首先通过锐性分离获取肝癌组织，随后使用胶原酶D和DNase I进行组织解离。接着，通过过滤和差速超速离心进一步去除细胞碎片、大囊泡及凋亡小体。最终实现sEVs的分离与纯化，以供后续研究使用。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 膜过滤装置</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 无菌注射器</td><td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td><td>YL01329</td><td></td></tr><tr><td>2% 醋酸铀</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4.7 mL 离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 烧杯</td><td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养皿</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 &amp;micro;L 离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td><td>Beckman&amp;nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini trans-blot 转膜仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean 电泳仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>CD63 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>CD9 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>清洗液</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>铜网</td><td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>干式恒温器</td><td>Hangzhou allsheng instruments company</td><td>AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记抗人 CD9 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）偶联山羊抗小鼠二抗&amp;nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）偶联山羊抗兔二抗&amp;nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纳米颗粒流式细胞仪</td><td>NanoFCM INC</td><td>FNAN30E20112368</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂（PhosSTOP）</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯膜</td><td>Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>质控微球</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 基础培养基</td><td>Biological Industries&amp;nbsp;</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Guangzhou Kehua Trading Company</td><td>NN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅纳米球</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-Exo</td><td></td></tr><tr><td>转移脱色摇床 TS-8</td><td>Kylin-Bell</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Thermo Scientific</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>TSG101 抗体</td><td>Proteintech</td><td>28283-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Guangzhou Lige Technology Company</td><td>LG01-105-4X</td><td></td></tr></tbody></table>

一种源自肝癌组织的小细胞外囊泡富集方法

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

来源于组织的小细胞外囊泡（sEVs）能够反映来源细胞的功能状态以及组织间质空间的特征。高效富集这些sEVs是研究其生物学功能的重要前提，也是开发临床检测技术和治疗载体技术的关键。由于通常存在严重污染，从组织中分离sEVs较为困难。本研究提供了一种从肝癌组织中快速富集高质量sEVs的方法。该方法包括四个步骤：使用消化酶（胶原酶D和DNase Ι）孵育组织，经70 µm细胞筛过滤，差速超速离心，以及通过0.22 µm膜滤器过滤。由于对差速超速离心步骤进行了优化，并增加了过滤步骤，该方法获得的sEVs纯度高于经典差速超速离心法。本研究为组织来源sEVs的研究提供了重要的方法学基础和支撑数据。

来自人肝癌组织的小细胞外囊泡（sEVs）在肝癌患者的诊断、治疗和预后中发挥着关键作用。本方法利用常见的实验室仪器，从肝癌组织中分离和纯化sEVs，可为sEVs的研究提供方法学支持。图2展示了从肝癌组织中富集sEVs的整体流程。通过组织切割和酶解消化，组织间质中的sEVs被充分释放。随后，消化液经70 µm滤膜过滤，以去除较大的组织碎片。此外，通过差速离心步骤（分别在500 × g、3,000 × g 和 12,000 × g 条件下）去除较小的组织残渣、细胞碎片、大囊泡以及凋亡小体（图3A-C）。
为了获得高纯度的小细胞外囊泡（sEVs），先后进行两次差速离心步骤（3,000 × g 和 12,000 × g），每次离心3分钟，重复操作直至去除表面白色物质。收集的上清液在100,000 × g</em...

本文介绍了一种通过优化的差速超速离心法从小鼠肝癌组织中富集小细胞外囊泡的方法。

组织来源的小细胞外囊泡（sEVs）能够反映来源细胞的功能状态以及组织的特征……

该方法可实现肝癌组织来源的小细胞外囊泡的分离，其纯度高于传统的差速超速离心法。该技术操作简便、易于实施，可为小细胞外囊泡的研究提供方法学支持。首先，从-80摄氏度冰箱中取出组织样本。将约400毫克组织置于冰盒上的10厘米细胞培养皿中，用手术刀将组织切碎。将组织转移至六孔板中，加入1.5毫升消化液。然后将六孔板置于转移脱色摇床中，在37摄氏度孵育20分钟，以充分解离肝癌组织并释放小型细胞外囊泡（sEVs）。孵育后，将六孔板置于冰盒上。加入80 µL磷酸酶抑制剂和200 µL完全蛋白酶抑制剂溶液以终止消化。然后，将消化液转移至置于2 mL离心管上的70 µm细胞筛网，缓慢过滤以去除任何大块组织碎片。将滤液在500 g条件下离心10分钟，以去除少量组织碎片，并将上清液收集到一个新的2毫升离心管中。将上清液在3,000 g条件下离心20分钟，以去除细胞碎片。小心地将上清液转移至新的离心管中，直至移液器吸头即将接触到管底的白色沉淀物为止。将剩余液体重复离心后，将上清液收集至离心管中，注意不要扰动沉淀物。将收集的上清液在12,000 g条件下离心20分钟，然后转移900微升上清液至一支4.7毫米超速离心管中。再次对剩余液体进行离心，随后将两次所得上清液一并收集并混合至同一支超速离心管中。用 PBS 完全充满离心管。将上清液在 100,000 g 条件下离心 60 分钟。弃去上清液后，通过用 PBS 填充超速离心管来重悬沉淀。在100,000 g条件下重复离心60分钟后，用50微升PBS重悬沉淀。使用1毫升无菌注射器吸取sEV悬液，并通过0.22微米膜滤器过滤至600微升离心管中。将滤液于-80摄氏度保存，以备后续分析。使用纳米颗粒流式细胞仪测定sEV的粒径分布和纯度。检查清洗液的体积，然后记录鞘液与废液液面之间的高度差。开启仪器主电源后等待20秒，然后打开计算机。等待蜂鸣声提示仪器已正确连接，以运行软件。单击“启动”以开启相机、激光器和气泵。接下来，点击鞘流液（Sheath Flow），然后选择启动（Start Up）。将超纯水放置在加样平台上。四分钟后，点击样本（Sample）和增强（Boosting），然后在样本中选择卸载（Unload）。30秒后，将空白管放置在加样平台上。单击“样品”，选择“增强”，然后在样品中选择“卸载”。接着，将装有超纯水的离心管放置在加载平台上。同时，单击“样品”和“增强”，随后选择“鞘流”和“清洗”。单击手动操作，将颗粒浓度管放置在加载平台上。然后，单击样本，在样本信息中选择增强模式运行一分钟，并同时选择250纳米标准荧光二氧化硅纳米微球作为质控。在样本中选择采样，并通过单击SPCM开启检测器。然后，点击自动采样，在采样设置中输入 1.0，将压力固定在 1 千帕。点击工具栏，选择大信号。调节激光器的水平位置，并将激光器设置为 2 微米。然后，持续点击 L 和 R，以确保信号强且均匀。点击“采集时间”以开始收集数据，采集完成后将自动跳转至缓冲液界面。随后，将数据保存为 Nfa 文件格式，并点击“样品”以选择卸载。将清洗液管置于加载平台。点击“样本”，选择“增强”，一分钟后再次点击“样本”并选择“卸载”。使用超纯水冲洗毛细管尖端，去除残留的清洗液。将粒径标准管放置在加样平台上，点击“样本增强”持续一分钟。在样本信息中选择68至155 S16M-Exo质控，然后点击样本，再点击采样。接着点击工具栏，选择小信号。单击“开始记录时间”以采集数据，采集完成后数据将自动跳转至缓冲区。随后，将数据保存为 Nfa 文件，并单击“样品”选择“卸载”。使用清洗液去除残留物后，将 PBS 管置于加样平台，执行与粒径标准管相同的步骤。接下来，按照之前演示的方法清洗毛细管尖端，并加载sEV样品，以分析之前所述的粒径标准管数据。通过透射电子显微镜观察纯化的sEVs，结果显示存在具有杯状形态的sEVs。随后对sEVs进行了流式细胞术分析。颗粒大小范围为40至200纳米，平均粒径为89纳米。富集的sEVs纯度为68.32%。通过蛋白质印迹法检测了sEVs的蛋白标志物，如CD63、CD9和TSG101。GM130被用作sEVs的阴性对照标志物，该蛋白存在于组织细胞中，但不存在于sEVs中。必须极其谨慎地进行酶消化、差速超速离心和膜过滤等步骤，以确保小细胞外囊泡的纯度。

an-enrichment-method-for-small-extracellular-vesicles-derived-from

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

肝癌组织来源于小细胞外囊泡的富集方法

血浆分离的外泌体可作为一种无创且可重复的方法，用于生物标志物的检测和随访，以实现早期发现和疾病进展监测。本视频介绍了从非小细胞肺癌患者血浆样本中分离外泌体的实验方案，该方法可用于后续的DNA和蛋白质提取。...

外泌体分离：一种从非小细胞肺癌患者血浆中分离外泌体的技术

关键词：外泌体，非小细胞肺癌，血浆，分离技术，生物标志物

本方案用于从肝脏中分离组织来源的细胞外囊泡（EVs）。该方案描述了一个两步法流程，包括先进行胶原酶灌注，再通过差速超速离心，以分离肝脏组织中的细胞外囊泡。...

从肝脏中分离组织细胞外囊泡

外泌体是一种新一代的药物递送载体。我们建立了一种高产量、高纯度的外泌体分离方案，用于siRNA递送。我们还将荧光标记的非特异性siRNA封装入外泌体中，并研究了负载siRNA的外泌体在癌细胞中的细胞摄取情况。...

外泌体的制备及其向癌细胞递送siRNA

本文提供了一种从完整组织（包括脑组织和肿瘤样本）中分离小细胞外囊泡（EVs）的详细方案。该方法可重复地从实体组织中提取EVs，用于后续下游分析。...

从完整组织中提取细胞外囊泡

本实验方案描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡，并对其表面抗原和蛋白载荷进行分析的方法。...

从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

本方案展示了如何在简单的实验室台式条件下分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。通过纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量检测、蛋白质印迹以及透射电子显微镜，分别对分离得到的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物及形态进行表征。...

一种简易台式过滤法从人源间充质干细胞分离小细胞外囊泡

本方案描述了通过差速离心法从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中分离和表征典型细胞外囊泡（EVs，包括外泌体和微囊泡）的方法。本文还介绍了这些细胞外囊泡的进一步应用。...

从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

本方案提供了在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡时如何避免内毒素污染以及如何对其进行正确评估的指导。...

低内毒素含量的癌细胞系来源细胞外囊泡的分离

本文介绍了一种利用I型胶原酶消化与超速离心相结合的方法，从小鼠脾脏中分离外泌体的实验方案。...

从小鼠脾组织中分离和表征外泌体

本方案描述了从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡的方法，该方法结合酶消化和尺寸排阻色谱技术，能够从结构复杂且产量较低的组织中可重复地回收富含囊泡的组分，用于后续分子分析。...

通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

学习优化差速超速离心法富集肝癌组织来源小细胞外囊泡的技术。该方法操作简便，可获得高纯度囊泡，为肿瘤生物学研究提供可靠方法学支持。

一种源自肝癌组织的小细胞外囊泡富集方法

探索更多视频