一种源自肝癌组织的小细胞外囊泡富集方法

该方法可实现肝癌组织来源的小细胞外囊泡的分离，其纯度高于传统的差速超速离心法。该技术操作简便、易于实施，可为小细胞外囊泡的研究提供方法学支持。首先，从-80摄氏度冰箱中取出组织样本。

将约400毫克组织置于冰盒上的10厘米细胞培养皿中，用手术刀将组织切碎。将组织转移至六孔板中，加入1.5毫升消化液。然后将六孔板置于转移脱色摇床中，在37摄氏度孵育20分钟，以充分解离肝癌组织并释放小型细胞外囊泡（sEVs）。

孵育后，将六孔板置于冰盒上。加入80 µL磷酸酶抑制剂和200 µL完全蛋白酶抑制剂溶液以终止消化。然后，将消化液转移至置于2 mL离心管上的70 µm细胞筛网，缓慢过滤以去除任何大块组织碎片。

将滤液在500 g条件下离心10分钟，以去除少量组织碎片，并将上清液收集到一个新的2毫升离心管中。将上清液在3,000 g条件下离心20分钟，以去除细胞碎片。小心地将上清液转移至新的离心管中，直至移液器吸头即将接触到管底的白色沉淀物为止。

将剩余液体重复离心后，将上清液收集至离心管中，注意不要扰动沉淀物。将收集的上清液在12,000 g条件下离心20分钟，然后转移900微升上清液至一支4.7毫米超速离心管中。再次对剩余液体进行离心，随后将两次所得上清液一并收集并混合至同一支超速离心管中。

用 PBS 完全充满离心管。将上清液在 100,000 g 条件下离心 60 分钟。弃去上清液后，通过用 PBS 填充超速离心管来重悬沉淀。

在100,000 g条件下重复离心60分钟后，用50微升PBS重悬沉淀。使用1毫升无菌注射器吸取sEV悬液，并通过0.22微米膜滤器过滤至600微升离心管中。将滤液于-80摄氏度保存，以备后续分析。

使用纳米颗粒流式细胞仪测定sEV的粒径分布和纯度。检查清洗液的体积，然后记录鞘液与废液液面之间的高度差。

开启仪器主电源后等待20秒，然后打开计算机。等待蜂鸣声提示仪器已正确连接，以运行软件。单击“启动”以开启相机、激光器和气泵。

接下来，点击鞘流液（Sheath Flow），然后选择启动（Start Up）。将超纯水放置在加样平台上。四分钟后，点击样本（Sample）和增强（Boosting），然后在样本中选择卸载（Unload）。30秒后，将空白管放置在加样平台上。

单击“样品”，选择“增强”，然后在样品中选择“卸载”。接着，将装有超纯水的离心管放置在加载平台上。同时，单击“样品”和“增强”，随后选择“鞘流”和“清洗”。

单击手动操作，将颗粒浓度管放置在加载平台上。然后，单击样本，在样本信息中选择增强模式运行一分钟，并同时选择250纳米标准荧光二氧化硅纳米微球作为质控。在样本中选择采样，并通过单击SPCM开启检测器。

然后，点击自动采样，在采样设置中输入 1.0，将压力固定在 1 千帕。点击工具栏，选择大信号。调节激光器的水平位置，并将激光器设置为 2 微米。

然后，持续点击 L 和 R，以确保信号强且均匀。点击“采集时间”以开始收集数据，采集完成后将自动跳转至缓冲液界面。随后，将数据保存为 Nfa 文件格式，并点击“样品”以选择卸载。

将清洗液管置于加载平台。点击“样本”，选择“增强”，一分钟后再次点击“样本”并选择“卸载”。使用超纯水冲洗毛细管尖端，去除残留的清洗液。

将粒径标准管放置在加样平台上，点击“样本增强”持续一分钟。在样本信息中选择68至155 S16M-Exo质控，然后点击样本，再点击采样。接着点击工具栏，选择小信号。

单击“开始记录时间”以采集数据，采集完成后数据将自动跳转至缓冲区。随后，将数据保存为 Nfa 文件，并单击“样品”选择“卸载”。使用清洗液去除残留物后，将 PBS 管置于加样平台，执行与粒径标准管相同的步骤。

接下来，按照之前演示的方法清洗毛细管尖端，并加载sEV样品，以分析之前所述的粒径标准管数据。通过透射电子显微镜观察纯化的sEVs，结果显示存在具有杯状形态的sEVs。随后对sEVs进行了流式细胞术分析。

颗粒大小范围为40至200纳米，平均粒径为89纳米。富集的sEVs纯度为68.32%。通过蛋白质印迹法检测了sEVs的蛋白标志物，如CD63、CD9和TSG101。GM130被用作sEVs的阴性对照标志物，该蛋白存在于组织细胞中，但不存在于sEVs中。

必须极其谨慎地进行酶消化、差速超速离心和膜过滤等步骤，以确保小细胞外囊泡的纯度。