Name: 用于重组G蛋白偶联受体高通量筛选的双加法钙荧光测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 了解用于重组G蛋白偶联受体高通量筛选的双加法钙荧光测定方法。该技术可在CHO-K1细胞中同时检测激动剂和拮抗剂，为神经科学和药理学研究提供可靠的药物筛选工具。

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本工作获得了美国农业部国家食品与农业研究所动物健康与福祉奖（资助号 2022-67015-36336，PVP [项目负责人]）以及德克萨斯农工大学动物科学系的竞争性资金支持。&amp;#38;M 得克萨斯农工大学农业生命研究昆虫媒介疾病资助计划（2022-2023 财年）对 P.V.P. 的资助。感谢得克萨斯农工大学农业与生命科学学院 A.W.E.S.O.M.E. 教师团队在稿件编辑过程中提供的帮助。 补充表 S2 包含来自德克萨斯农工大学James Sacchettini博士实验室内部随机小分子化合物库的数据&amp;#38;M 大学和德克萨斯农工大学&amp;#38;M 德州农工大学农业生命研究部

1. 细胞培养与维护
注意：Holmes 等人建立了一种稳定表达微小牛蜱（R. microplus）激肽受体的 CHO-K1 细胞系，命名为 BMLK316。该细胞系的构建细节见其他文献14。以下所有步骤均须在 II 级生物安全柜内的无菌条件下进行。
<ol>
	<li>在选择性培养基（含10%胎牛血清[FBS]和800 µg/mL G418硫酸盐的F-12K培养基）中培养重组细胞系，以确保目标受体的表达。将稳定表达受体的细胞置于含1 mL冻存液（90% FBS和10%二甲基亚砜[DMSO]）的2 mL冻存管中，于−80 °C冰箱中保存。 
	注意：如需长期保存冻存细胞，应将其置于液氮中储存。</li>
	<li>细胞培养前将所有培养基预热。在生物安全柜中，将13 mL预热的选择性培养基（含10% FBS和800 µg/mL G418硫酸盐的F-12K培养基）加入T-75培养瓶中，并置于生物安全柜内。在37 °C水浴中解冻一支冻存的BMLK3细胞（约1.5 × 106个细胞），时间约为2–3分钟。将解冻后的细胞转移至T-75培养瓶中。除非另有说明，否则将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中维持培养。</li>
	<li>当细胞达到90%融合度（1–2天）时，除杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）保持室温外，将所有培养基预热至37 °C。在生物安全柜中，从T-75培养瓶中移除用过的培养基，加入10 mL DPBS轻轻旋转培养瓶洗涤细胞5秒，然后用移液管吸除DPBS。 
	注意：CHO-K1细胞在90%融合度时的图像见Lu等14的研究。</li>
	<li>向T-75培养瓶中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，于培养箱中37 °C孵育3–5分钟，使细胞脱落。随后加入8 mL选择性培养基，使用同一支移液管轻柔吹打2–3次，充分混匀细胞悬液。</li>
	<li>从步骤1.4中取出2 mL细胞悬液（约1 × 106个细胞），接种至另一含有10 mL温热选择性培养基的新T-75培养瓶中。在培养箱中继续培养1–2天，直至细胞达到90%融合度。</li>
	<li>可直接使用细胞进行后续检测，或在用于检测前重复步骤1.4–1.5一次或两次。 
	注意：传代次数不应超过三至四代，因为某些细胞系的检测信号可能随传代增加而减弱。</li>
</ol>
2. 钙荧光检测
<ol>
	<li>包被细胞培养板。
	<ol>
		<li>在384孔板的所有移液步骤中，使用置于生物安全柜内的液体处理系统。针对384孔板的移液操作创建自定义程序31 (补充表 S1）。提前包被无菌的384孔板。在生物安全柜中，加入 10 µL/well 向每孔中加入0.05 mg/mL的聚-D-赖氨酸（PDL）水溶液，并在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将培养板快速倒置并轻轻在无菌纸巾上拍打，以排空孔内液体。随后，用缓冲液冲洗各孔 10 µL 水，倒空培养板，将培养板在生物安全柜中敞口过夜干燥。盖上盖子，于 4 °C 在冰箱中。 
		注意：包被好的板可在 4 °C 长达6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>取出药物板（100 µM 在90% DPBS + 10% DMSO中，HTS时孔中的终浓度将为 2 µM) 储存在 −20 °C 冷冻机，置于室温下。 
		注意：药物板布局：每块384孔板（24列 × 16行）包含320个含有不同文库化合物的孔和64个含有空白溶剂（含10% DMSO的DPBS）的孔，空白孔 arranged 成四列，每侧边缘各两列。参见 补充表 S2 用于平板布局。</li>
		<li>当T-75培养瓶中的细胞生长至约70%–90%融合度时，按以下方法从T-75培养瓶中消化细胞。将所有培养基预热至 37 °C 除DPBS（室温）外。
		<ol>
			<li>移除旧培养基，用 10 mL DPBS 洗涤细胞，然后吸除 DPBS。在 37 °C 下，加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 3–5 分钟，使细胞从 T-75 培养瓶上脱落 37 °C 在培养箱中加入8 mL选择性培养基，将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，在1,000 × g 3 分钟。</li>
			<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 含 1% FBS 的 F-12K 培养基中 400 µg/mL G418硫酸盐。在测定细胞数量时，将悬浮液置于生物安全柜中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测定悬浮液的细胞密度以进行后续稀释：混匀 20 µL 细胞悬液的注入 20 µL 0.4% 台盼蓝，然后上样 20 µL 将混合液加入细胞计数板中，使用细胞计数仪测定细胞密度。</li>
		<li>用相同的培养基（F-12K 培养基含 1% FBS）稀释细胞悬液 400 µg/mL G418硫酸盐）加至终体积至少15 mL，细胞密度为4 × 105 cells/mL</li>
		<li>将细胞接种至PDL包被的384孔板中。取15 mL上述细胞悬液（4 × 105 细胞/mL）加入一个150 mL适配自动化的试剂储液槽中。分装 25 µL 使用液体处理系统分两步将细胞悬液（约10,000个细胞/孔）加入板的384孔中的每个孔。加载384/12.5 µL 低吸附枪头安装到液体处理仪探头，吸取 12.5 µL 来自储液器（速度 5.2 µL/s），并加入到每个孔中（速度： 3.1 µL/s).</li>
		<li>重复上一步2.2.5中的移液操作，以达到 25 µL 每孔。然后，将培养板在过夜（14–16 小时）于 37 °C 和5% CO2 在湿润的培养箱中。 
		注意：由于最大移液量为 12.5 µL 针对此特定头部，移液操作为 25 µL 分两步进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>次日早晨，在显微镜下检查盖好的细胞培养板；若未达到融合，需等待细胞融合度达到90%。</li>
		<li>制备荧光染料储备液：将冻干荧光染料溶于 100 µL 避免将DMSO暴露于直射光下，并用铝箔包裹试管以防止光漂白。 
		注意：可将储备液分装成若干份 15 µL 每次板式检测使用分装样品，以避免反复冻融；分装样品可保存于−80 °C 长达1个月。</li>
		<li>在关闭光源的生物安全柜中，用铝箔包裹的15 mL锥形管配制上样染料（1x），混合 15 µL 来自步骤 2.3.2 的荧光染料储备液以及其余预热的试剂盒组分37 °C13.5 mL 1× HHBS（含20 mM HEPES的Hank缓冲液）和1.5 mL 试剂B（染料外排抑制剂）。 
		注意：此步骤中保持房间灯光开启。</li>
		<li>盖上管盖，轻轻倒置管子数次（通常3-5次）以充分混匀。 
		注意：室温保存，并在30分钟内使用上样染料混合物。</li>
		<li>当细胞达到90%融合度时，通过快速翻转384孔检测板并在无菌纸巾上轻轻按压的方式移除用过的培养基；重复此操作2至3次，以彻底去除板内所有液体。丢弃已湿润的纸巾。</li>
		<li>关闭房间内大多数人工直射光源（仅保留一盏柔和的台灯或类似光源以提供可见的工作条件），并在整个实验过程中（约1.5小时，直至实验结束）保持生物安全柜内光源关闭。</li>
		<li>将步骤 2.3.3 中的 15 mL 上样缓冲液（1x）加入一个 150 mL 适配自动进样系统的储液槽中。
		<ol>
			<li>转移 25 µL 将上样染料（1x）从储液槽通过液体处理系统加入每个孔中，使用384/12.5 µL 低吸附枪头通过移液 12.5 µL 向每孔中加入（吸液和加液速度： 3.8 µL/s).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>重复2.3.7.1中的移液步骤，直至达到最终体积 25 µL 在板的每个孔中加入。盖上盖子，并用铝箔包裹整块板，以避免暴露于环境光下。</li>
		<li>将盖好的细胞培养板孵育于 37 °C 在 CO2 在加湿培养箱中孵育30分钟后，从培养箱中取出，置于酶标仪内或实验台面上，室温平衡30分钟，期间保持微孔板加盖并用铝箔包裹。随后细胞即可用于高通量筛选（HTS）。</li>
		<li>化学试剂制备：将2.2.1步骤中的药物板在1,200 × g条件下离心 g 在室温下，使用平板离心机离心1分钟。
		<ol>
			<li>配制 Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) 激动剂肽的 10 倍浓度溶液10 µM通过将100 nmol冻干肽重悬于含0.1% DMSO的10 mL 1x HHBS中，并将溶液转移至150 mL适配自动进样器的储液槽中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测量背景信号：在整个HTS检测中，使用酶标仪进行测定时，需在 实验方案，选择 终点荧光模式. 
		注意：荧光信号在495 nm激发波长和525 nm发射波长下从培养板底部读取。
		<ol>
			<li>将细胞板放入酶标仪中。在 仪表盘，选择 调节增益，选择一个 随机孔位 在平板上，分配它 5%–10% 的 最大可测荧光值，然后选择 调节（读数）高度.</li>
			<li>点击 开始测量 读取整块板的背景荧光信号，单位为相对荧光单位（RFU）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>“双加样”检测法
		<ol>
			<li>使用液体处理系统进行384/12.5 µL 用移液器将药物板各孔中的药物溶液上下吹打3次，以混匀 10 µL 药物溶液（溶于含10% DMSO的DPBS中）（移液速度： 5.2 µL/s）和“吸出” 1.5 µL 从药物板的每个孔中（吸取速度： 1.0 µL/s).</li>
			<li>分配 0.5 µL 将化合物加入细胞检测板中（移液速度： 1 µL/s) 以达到最终浓度 2 µM 在0.2% DMSO中。</li>
			<li>加入筛选化合物后，立即将检测板放入酶标仪中。对同一块板分别以正向和反向读板模式进行检测。为获得这些读数，需设置程序，分别从“孔1-384”和“孔384-1”连续读取。 
			注意：两个方向的读数总共需要 2 min。此读数设计旨在补偿在每个方向进行板读时信号强度的下降。读数分析详见步骤 3.1。</li>
			<li>处理剩余的 1 µL 通过将吸头浸入含有约50 mL DPBS的150 mL废液槽中，以去除吸头尖端的药物溶液（分配速度： 1.0 µL/s).</li>
			<li>在生物安全柜中，于室温避光条件下将筛选化合物与细胞共同孵育，总时长为5分钟（包含2分钟的读板时间）。加入 3 µL 激动剂肽Rhimi-K-1（QFSPWGamide）从储液器中吸取（吸液速度： 3.1 µL/s) 使用液体处理系统（分配速度： 3.1 µL/s) 与 384/12.5 µL 提示</li>
			<li>加入激动剂肽后立即将酶标板放入酶标仪中。使用与步骤 2.3.12.3 相同的程序，以正向和反向读取酶标板。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>使用安装在计算机上的酶标仪配套分析软件，计算第一次加入化合物后两次读数的细胞荧光反应（以 RFU 为单位）（第一次读数； RFU之前 [补充表 S2]) 以及添加激动剂步骤之后（第二次读数 = RFU蚂蚁 [补充表 S2每条读数均通过取自步骤 2.3.12.3 和步骤 2.3.12.6 的正向和反向板读数所获得的两个数值的平均值（未显示）得出。 
	注意： RFU之前, RFU蚂蚁 分别参考潜在激动剂命中物（步骤 2.3.12.3 中读取）和潜在拮抗剂命中物（步骤 2.3.12.6 中读取）的相对荧光单位。</li>
	<li>导出全部三组数据， RFUbg, RFU之前，以及 RFU蚂蚁，从分析软件导出为三个独立的电子表格。每个电子表格仅包含两列：孔位和原始相对荧光单位（RFU）（此处未显示文件）。 
	注意： RFU背景 指步骤 2.3.11.2 中测得的背景荧光强度（RFU）。</li>
	<li>将三个电子表格中的数据进行格式化，并将上述数据整理到一个 csv 文件中（参见示例） 补充表 S2）。从读取的背景信号中减去 RFU之前 和 RFU蚂蚁，分别对应图G和图H中的列 补充表 S2).</li>
	<li>将 csv 文件导入到一种市售的“在线高通量筛选数据平台”（参见 材料表）用于下游数据分析（表1）和储存。</li>
	<li>使用公式（手动计算每块板检测的质量控制 Z'-因子1): 
	方程 (1): 
	<img alt="Z&#x27;因子方程，用于评估检测质量，生物统计学中的公式。" src="/files/ftp_upload/64505/64505eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">    (1) 
	注意： µc- 和 µc+ 表示相同孔位读数的平均相对荧光单位（RFU），这些孔位在加入溶剂后的第一次加样中作为阴性对照（空白溶剂，n = 64；蓝色数字） 补充表 S2）并在加入激动剂后作为阳性对照（空白溶剂 + 激动剂，n = 64；品红色数字），分别进行处理。此外， σc- 和 σc+ 代表其对应的标准差（SD）。</li>
	<li>从“在线高通量筛选数据平台”的热图中手动选择命中分子，并计算归一化百分激活率（NPA）和抑制活性Io) 计算激动剂命中和拮抗剂命中的方程（2）和公式（3): 
	<img alt="静态平衡公式，NPA方程，教学示意图，科学百分比计算" src="/files/ftp_upload/64505/64505eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">    (2) 
	<img alt="静态平衡；公式：Io=[1-(RFUant-RFUbg)/µC+]×100%；示意图；科研计算" src="/files/ftp_upload/64505/64505eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3">    (3)</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

高通量筛选（HTS）的目标是通过大规模筛选大量小分子来鉴定出阳性分子。因此，本示例的结果仅代表一次常规HTS实验的一小部分。此外，所鉴定出的阳性分子还需在下游实验中进行验证，例如在同一重组细胞系以及仅携带空载体的CHO-K1细胞系中进行剂量依赖性检测，这些检测可同时开展以节省小分子样品。细胞毒性检测将有助于证明第二次加样时无反应并非由细胞死亡所致。还应开展其他生物活性检测，以验证化合物在分离组织中的活性。 体外，或通过向活体节肢动物施用或喂食小分子化合物。蜱虫激肽受体的小分子配体鉴定完整流程可参见先前发表的研究。31通过该筛选流程，共鉴定出36种蜱虫激肽受体拮抗剂。其中三种拮抗剂进一步在组织收缩抑制实验中进行了测试，结果显示其对蚊虫后肠具有抗肌活性，而蚊虫后肠中表达有同源的蚊虫激肽受体。31.
在进行高通量筛选（HTS）之前，应对每种表达G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞系验证其适宜的实验条件。这些条件包括细胞密度（每孔10,000个细胞）、待筛选化合物的浓度（2 µM）...

G蛋白偶联受体（GPCRs）存在于从酵母到人类的多种生物中，是许多生物体内最大的受体超家族1。它们在调控动物几乎所有的生物学过程中发挥关键作用。节肢动物基因组中含有50至200个GPCR，使其成为最大的膜受体超家族2。根据序列相似性和功能，GPCRs被分为六大类：A至F类3。GPCRs可转导多种胞外信号，包括激素、神经肽、生物源性胺类、谷氨酸、质子、脂糖蛋白以及光子等信号4。GPCRs通过与异源三聚体G蛋白（Gα、Gβ和Gγ）偶联来传递下游信号。与Gαs或Gαi/o蛋白偶联的GPCRs分别通过激活或抑制腺苷酸环化酶来升高或降低细胞内3',5'-环磷酸腺苷（cAMP）水平。与Gαq/11偶联的GPCRs通过激活磷脂酶C（PLC）-肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）通路，诱导内质网钙库中的钙离子释放。与Gα12/13偶联的GPCRs可激活RhoGTP酶鸟苷酸交换因子5,6。超过50%的人类药物以及杀螨剂阿米特拉嗪均以GPCRs为靶点4。由于GPCRs能够转导如此多样化的信号，因此它们是开发干扰无脊椎动物特异性生理功能的新型杀虫剂的潜在靶标。
高通量筛选（HTS）的目标是鉴定能够调节受体功能的命中分子。HTS包括检测方法的开发、微型化和自动化7。节肢动物神经肽G蛋白偶联受体（GPCR）参与调控大多数生理功能，如发育、蜕皮与蜕皮行为、排泄、能量动员以及繁殖4。大多数节肢动物及后生动物的神经肽GPCR通过钙信号级联通路进行信号传导2,6,8,9,10，例如黑足蜱Ixodes scapularis的肌抑制肽（myoinhibitory peptide）和SIFamide受体；在后肠运动检测中，它们的配体表现出拮抗作用，SIFamide引起收缩，而MIP则抑制收缩11,12。黄热病蚊子Aedes aegypti的一种类NPY受体可调控雌蚊寻找宿主的行为13。与其他钙动员检测方法（如水母素钙生物发光检测14）相比，钙荧光检测操作简便，无需转染其他重组钙检测蛋白，且成本较低。与水母素钙生物发光检测所获得的快速动力学信号相比，钙荧光检测产生的信号持续时间更长14,15。
在此示例中，牛蜱（Rhipicephalus microplus）的激肽受体在CHO-K1细胞系中进行了重组表达，并用于钙荧光检测。在R. microplus中仅发现一种激肽受体基因；该受体通过Gq蛋白依赖性信号通路进行信号传导，触发钙库中的Ca2+释放至细胞内空间16。此过程可通过荧光染料进行检测和定量，当荧光染料与钙离子结合时会发出荧光信号（图1）。
缓激肽受体是一种无脊椎动物特有的G蛋白偶联受体，属于A类视紫红质样受体。缓激肽是一种古老的信号神经肽，存在于软体动物门、甲壳亚门、昆虫纲和蜱螨目中。4,17,18鞘翅目昆虫（甲虫）缺乏激肽信号系统；而在蚊子中 埃及伊蚊， 只有一个激肽受体能够结合三种埃及伊蚊激肽，而 黑腹果蝇 具有一个缓激肽受体，其特异性配体为果蝇缓激肽（drosokinin）19,20,21。脊椎动物中不存在同源的激肽或激肽受体。尽管激肽在蜱虫中的确切功能尚不清楚，但激肽受体RNAi沉默的雌性蜱虫 R. microplus 表现出显著降低的繁殖适合度22激肽是昆虫中具有多种功能的肽类。在 黑腹果蝇，它们参与中枢和外周神经调节系统23，前蜕皮期24，喂养25，代谢26，以及睡眠活动模式26,27以及幼虫运动行为28激肽调节蚊虫后肠收缩、利尿及摄食行为 A. aegypti29,30,31激肽类肽具有一段保守的C端五肽Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2，这是生物活性所需的最小序列32节肢动物特异性、内源性配体的较小分子尺寸（使其易于受到小分子干扰）以及在昆虫中多效性的功能，使激肽受体成为害虫控制的一个有前景的靶点4.
“双加样”检测法（图2）可在同一高通量筛选（HTS）实验中识别激动剂或拮抗剂15。该方法改编自制药工业药物发现中常用的“双加样”检测法33。简而言之，首先将化合物加入细胞板中，若检测到的荧光信号高于溶剂对照组，则可识别化学文库中潜在的激动剂。在这些小分子孵育5分钟后，向所有孔中加入已知的激动剂（缓激肽）。在首次加样时随机加入拮抗剂的孔，在后续加入激动剂后，其荧光信号低于首次加样时加入溶剂的对照孔。因此，该检测法可利用相同的细胞同时识别潜在的激动剂和拮抗剂。在标准的高通量筛选项目中，这些命中分子需通过剂量-反应实验及其它生物学活性实验进一步验证，但此处未展示这些步骤。
<img alt="激肽受体信号通路示意图；GPCR、配体结合、Ca2+释放、PLC通路、细胞反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：钙荧光检测机制示意图。 Gq蛋白触发细胞内钙信号通路。激肽受体（G蛋白偶联受体）在CHO-K1细胞中被重组表达。当激动剂配体与受体结合后，与激肽受体偶联的Gq蛋白激活磷脂酶C（PLC），催化PIP2分子转化为IP3和DAG。IP3随后结合至内质网表面的IP3R，导致Ca2+从内质网释放到细胞质中，Ca2+离子与荧光探针结合并产生荧光信号。该荧光信号可通过490 nm激发光激发，并在514 nm处检测。缩写：GPCR = G蛋白偶联受体；PLC = 磷脂酶C；PIP2 = 磷脂酰肌醇4,5-二磷酸；IP3 = 肌醇三磷酸；DAG = 二酰甘油；IP3R = IP3受体。由BioRender.com创建。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基于细胞的检测流程图；CHO-K1细胞、荧光染料、RFU测量、双加样检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：在CHO-K1细胞中表达的G蛋白偶联受体上进行小分子高通量筛选的工作流程。（A）使用液体处理系统将稳定表达缓激肽受体的重组CHO-K1细胞加入384孔板中（每孔10,000个细胞，25 µL/孔），并在加湿的CO2培养箱中孵育12–16小时。（B）使用液体处理系统向细胞板中加入含荧光染料的检测缓冲液（25 µL/孔）。将板在37 °C孵育30分钟，随后在室温平衡30分钟。（C）使用酶标仪测量每孔细胞的背景荧光信号。（D）使用液体处理系统将来自384孔文库板的药物溶液及空白溶剂（均为0.5 µL/孔）加入细胞检测板中。（E）在加入药物溶液后立即使用酶标仪测量细胞内钙离子荧光反应；荧光信号高于平均水平的化合物被选为激动剂候选物。在步骤G中加入肽类激动剂后，可识别出阻断GPCR（下方图标）的拮抗剂候选物。（F）在同一检测板中，细胞与筛选化合物孵育5分钟后，向每孔加入蜱虫缓激肽受体的内源性激动剂肽Rhimi-K-1（QFSPWGamide）（1 µM）。（G）在加入激动剂肽后立即使用酶标仪测量细胞荧光反应。抑制荧光信号的化合物被选为拮抗剂候选物。缩写：GPCR = G蛋白偶联受体；RT = 室温；RFU = 相对荧光单位。由BioRender.com创建。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15050-065</td><td>含酚红</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154</td><td>液体，无菌</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12400</td><td>无RNase微离心管</td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Corning</td><td>29443-045</td><td>Corning Costar Stripette，单独包装&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Corning</td><td>29443-047</td><td>Corning Costar Stripette，单独包装&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>无菌</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>USA Scientifc Inc.</td><td>P1121</td><td>无菌，带屏障</td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>Corning</td><td>29443-049</td><td>Corning Costar Stripette，单独包装&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>带刻度，无菌</td></tr><tr><td>150 mL 自动化兼容储液槽</td><td>Integra Bioscience</td><td>6317</td><td>无菌，单独包装，用于第1天细胞接种</td></tr><tr><td>150 mL 自动化兼容储液槽</td><td>Integra Bioscience</td><td>6318</td><td>无菌，叠放式，用于第2天加载染料</td></tr><tr><td>384/12.5 &amp;micro;L 低吸附吸头</td><td>Integra Bioscience</td><td>6405</td><td>长型，无菌滤芯</td></tr><tr><td>384/12.5 &amp;micro;L 吸头</td><td>Integra Bioscience</td><td>6404</td><td>长型，无菌滤芯</td></tr><tr><td>384孔板</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>CELLSTAR，透明聚苯乙烯，&amp;micro;Clear，黑色/平底</td></tr><tr><td>铝制板封膜</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td>聚酯基</td></tr><tr><td>铝箔包裹</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>NuAire</td><td>NU-540-300</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Nexcelom</td><td>AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数载玻片</td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>20 &amp;micro;L 样品室</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 恒温培养箱（带湿度控制）</td><td>Thermo Fisher</td><td>Forma Series II</td><td></td></tr><tr><td>台灯</td><td>SunvaleeyTEK</td><td>RS1000B</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>MilliporeSigma</td><td>276855</td><td>无水，&gt;99.9%</td></tr><tr><td>药物板</td><td>Corning</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>DPBS，1×，不含钙和镁</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Koptec</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>F-12K 培养基&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>45000-354</td><td>（Kaighn改良型），含L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Equitech-Bio</td><td>SFBU30</td><td></td></tr><tr><td>荧光钙检测试剂盒</td><td>ENZO Lifescience</td><td>ENZ-51017</td><td>10×96 次检测</td></tr><tr><td>G418 硫酸盐</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10131-027</td><td>遗传霉素选择性抗生素，50 mg/mL</td></tr><tr><td>亨氏缓冲液</td><td>MilliporeSigma</td><td>55037C</td><td>改良HBSS，含钙、含镁，不含酚红</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>1 摩尔</td></tr><tr><td>高通量筛选数据存储平台</td><td>CDD vault&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://www.collaborativedrug.com/</td></tr><tr><td>液体处理系统</td><td>Integra Bioscience</td><td>Viaflo</td><td>384/12.5 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>板式离心机</td><td>Thermo Fisher</td><td>Sorvall ST8</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BMG technology</td><td>Clariostar</td><td></td></tr><tr><td>多聚赖氨酸</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rhimi-K-1 激动剂肽</td><td>Genscript</td><td>定制订单</td><td>QFSPWGamide</td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于高通量筛选重组g蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的受体超家族，也是多种人类药物的作用靶点。制药行业利用针对GPCRs的随机小分子文库高通量筛选（HTS）进行靶向药物发现。本研究采用高通量筛选方法，旨在鉴定特异性作用于无脊椎动物神经肽G蛋白偶联受体的新型小分子配体，以作为研究致命性人类和动物病原体传播媒介生理功能的探针。
选择无脊椎动物特异性的缓激肽受体作为靶点，是因为它调控无脊椎动物中许多重要的生理过程，包括利尿、摄食和消化。此外，许多无脊椎动物G蛋白偶联受体（GPCR）的药理学特性尚未被充分表征甚至完全未知；因此，这些受体家族相对于其他后生动物（尤其是人类）中相关GPCR所表现出的差异性药理学特性，有助于增进对GPCR这一超家族结构-活性关系的理解。本研究建立了一种适用于384孔板细胞的高通量筛选（HTS）检测方法，用于发现牛蜱或称南方牛蜱Rhipicephalus microplus缓激肽受体的配体。该蜱类缓激肽受体在CHO-K1细胞中实现了稳定表达。
激肽受体在被内源性激肽类神经肽或其他小分子激动剂激活后，可触发Ca2+ 从钙库释放到细胞质中的钙离子。该钙荧光检测法结合一种 &#34;双加法&#34; 该方法可检测功能性激动剂和拮抗剂 &#34;命中&#34; 同一块检测板中的分子。每次检测均使用含有320种随机小分子的药物板进行。在高通量筛选（HTS）中，当终浓度为2 µM时，获得了可靠的Z'因子0.7，并鉴定出三个激动剂和两个拮抗剂命中分子。本文所述的钙荧光检测法可适用于筛选其他能够激活Ca²⁺信号通路的GPCR。2+ 信号级联

以一个内部药物筛选板（SAC2-34-6170），其中包含320种随机小分子化合物为例，用于演示本高通量筛选（HTS）实验。该HTS实验具有优异的检测质量，Z'因子为0.7（表1）。此Z'因子反映了检测质量，且不受被测化合物影响34。Z'因子大于或等于0.5表明阳性对照与阴性对照之间的相对荧光单位（RFU）具有良好的信号动态范围。Z'因子小于0.5的实验其信号动态范围次优，通常无法为阳性结果筛选提供有效信息，因此会被舍弃。阳性对照的响应（以相对荧光单位RFU测量，64个阳性对照响应的平均RFU，µc+ = 130,139）平均比阴性对照（64个阴性对照响应的平均RFU，µc- = 6,675）高出19倍。选择“激动剂阳性结果”的荧光阈值设定为归一化百分比激活度（NPA）最大比值 >50%。选择“拮抗剂阳性结果”的荧光阈值设定为观察到的抑制活性（Io）>50%。最终筛选出三个激动剂阳性分子和两个拮抗剂阳性分子：SACC-009023...

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus microplus的激肽受体为靶点，在CHO-K1细胞中表达。该方法利用同一批细胞，通过一种“双加样”检测方式同时鉴定激动剂和拮抗剂。

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的受体超家族，也是多种人类药物的作用靶点。高通量筛选……

高通量筛选钙荧光双加样检测法可用于鉴定通过细胞内钙信号级联途径发挥作用的G蛋白偶联受体的新型小分子配体。双加样检测法的主要优势在于，只要荧光信号持续两分钟，即可利用同一批细胞在单次检测中同时实现激动剂和拮抗剂的高通量筛选。该方法适用于所有通过钙信号级联途径传导信号的G蛋白偶联受体，其中包括大多数节肢动物神经肽家族G蛋白偶联受体。为了确保检测的可重复性，优化细胞密度、加样速度以及第二次加入的已知激动剂浓度非常重要。本实验操作将由本实验室的博士后研究人员 Bianca Henriques-Santos 演示。开始钙荧光检测时，从含有70%至90%融合度的BMLK三细胞的T-75培养瓶中移除用过的培养基。用 10 毫升杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate-buffered saline，DPBS）洗涤细胞。移除 DPBS 后，加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）溶液，于 37 摄氏度孵育 3 至 5 分钟以使细胞脱落。加入 8 毫升筛选培养基，将细胞悬液转移至 15 毫升锥形离心管中。将细胞悬液在1000 × g离心3分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于10毫升含1%胎牛血清（FBS）和400微克/毫升G418硫酸盐的F-12K培养基中。为确定细胞悬液的密度以进行后续稀释，取20微升细胞悬液与20微升0.4%台盼蓝混合，然后将20微升混合液加入细胞计数板，用细胞计数仪测定细胞密度。使用相同的F-12K培养基稀释细胞悬液，并将最终体积调至15毫升，细胞密度为每毫升4 × 10⁵个细胞。将细胞接种至多聚-D-赖氨酸（Poly-D-lysine）或PDL包被的384孔板中。使用液体处理系统，向该板的384个孔中每孔加入25微升稀释后的细胞悬液。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育过夜。次日，迅速倒置融合度达90%的384孔板，以去除用过的培养基，并在无菌纸巾上轻压2至3次，彻底吸干板内所有液体。在生物安全柜内的柔和弱光条件下进行后续步骤。随后，使用液体处理系统将25微升上样染料加入每个孔中，以每秒3.8微升的吸液和排液速度向每个孔中加入12.5微升。重复该移液步骤，使每个孔中的最终体积达到25微升。完成后，用铝箔覆盖培养板以避光，并在37摄氏度、含加湿二氧化碳的培养箱中孵育30分钟。将覆盖后的培养板再平衡30分钟，细胞即可用于高通量筛选（HTS）。接下来，在板式离心机中以1200 × g离心药物板1分钟。将 Rhimi-K-1 的 10 倍激动剂肽溶液转移至 150 毫升适合自动进样的储液槽中。在酶标仪中，点击“管理方案”。然后在终点荧光强度方案中选择 Flow Forte 预读，点击“开始测量”，以测定整个高通量筛选实验的背景信号。将细胞板插入酶标仪中。在仪器面板上，单击板上的任意一个孔，然后单击“新建聚焦高度”。接着单击“聚焦调整”。单击增益调节。将其设置为最大可测荧光值的5%至10%。单击开始调节。单击“开始测量”以读取整块板的背景荧光信号，单位为相对荧光单位（RFU）。在读板过程中，可单击“当前状态”以查看实时读数。对于双加样检测，使用液体处理系统将10微升药物溶液上下移液三次，并以每秒1.0微升的吸液速度从药物板的每个孔中吸取1.5微升。 将化合物以每孔0.5微升的量加入细胞检测体系中，使终浓度达到2微摩尔，并含有0.2%二甲基亚砜（DMSO）。加入筛选化合物后，立即将检测板放入酶标仪中。点击预设的读板程序，以正向和反向两种读板模式进行检测。将移液枪头中残留的1微升药物溶液排入含有约50毫升DPBS的150毫升废液储液槽中。将筛选化合物与细胞共同孵育总共5分钟，包括在生物安全柜内关闭光源的酶标仪中的孵育时间。接下来，使用液体处理系统和384个12.5微升枪头，从储液槽中向检测板中加入3微升激动剂肽Rhimi-K-1。将酶标板立即放入酶标仪中。点击预设的读板程序，分别在正向和反向读板方向上读取数据。完成后，手动计算每块酶标板检测的Z'因子，以进行质量控制。从在线高通量筛选（HTS）数据平台的热图中手动选择命中分子，并计算激动剂命中分子和拮抗剂命中分子的归一化百分激活率（NPA）以及抑制活性（I0）。本研究使用了包含320种随机小分子的内部药物板SAC2-34-6170来演示该高通量筛选实验。该筛选实验具有优异的实验质量，Z'因子为0.7，表明实验质量不受测试化合物的影响。加入激动剂后必须立即读取酶标板，因为荧光信号持续时间较短。完成此步骤后，应通过剂量反应实验对筛选出的阳性分子进行验证，并在不表达目标G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞中进行测试，以排除脱靶效应的假阳性结果。

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用于重组G蛋白偶联受体高通量筛选的"双加法"钙荧光测定

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。...

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

本视频提供了使用 FlexStation 3 研究人源 TRPA1 通道药理学特性的详细实验方案。该方案涵盖了细胞制备、染料加载以及微孔板读板仪 FlexStation 3...

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一种基于动力学荧光的 Ca2+ 流动检测方法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂

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一种高通量钙流检测法，用于研究对甘氨酸/D-丝氨酸和谷氨酸敏感的NMDA受体

GPCR与β-阻遏蛋白相互作用是GPCR药物发现领域的一个新兴方向。为了在活体系统中监测此类相互作用，亟需准确、精确且易于建立的方法。本文展示了一种结构互补检测法，可用于实时监测活细胞中GPCR与β-阻遏蛋白的相互作用，并且该方法可拓展应用于任何GPCR。...

实时监测活体系统中G蛋白偶联受体与β-阻遏蛋白1/2的相互作用以加速药物发现

鉴于G蛋白偶联受体（GPCRs）是极具潜力的药物靶点，因此GPCR配体筛选对于发现先导化合物以及开展孤儿受体去孤儿化研究至关重要。为此，我们介绍了PRESTO-Tango，这是一个开源资源平台，利用基于TEV的报告基因检测方法，可同时对近300种GPCR上β-阻遏蛋白2（β-arrestin2）的瞬时招募进行分析。...

使用PRESTO-Tango检测技术在全GPCR范围内并行检测β-阻遏蛋白2招募以进行配体筛选

已开发出一种改良的内皮细胞钙流测定实验方案，用于鉴定蛋白酶激活受体（PARs）的配体。新方案将总检测时间缩短了90至120分钟，并可获得可重复的浓度-反应曲线。...

利用酶标仪通过钙流测定法表征蛋白酶激活受体调节剂

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基于BRET的G蛋白生物传感器用于活细胞中G蛋白偶联受体活性的检测

了解用于重组G蛋白偶联受体高通量筛选的双加法钙荧光测定方法。该技术可在CHO-K1细胞中同时检测激动剂和拮抗剂，为神经科学和药理学研究提供可靠的药物筛选工具。

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

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