Name: 使用新型3D打印支架对完整的 离体 地球仪进行活细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 了解使用新型3D打印支架对完整离体眼球进行活细胞成像的方法。该技术可实时监测角膜上皮损伤后的钙信号传导和细胞迁移，为研究角膜损伤修复机制提供高分辨率成像支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）提供的以下基金支持：RO1EY032079（VTR）、R21EY029097-01（VTR）、1F30EY033647-01（KS）和5T32GM008541-24（KS）。我们还感谢马萨诸塞州狮子会眼科研究基金和新英格兰角膜移植基金的支持。

涉及动物受试者的实验程序已获得眼科护理与视觉研究动物使用协会（Association for Research in Vision and Ophthalmology）以及波士顿大学IACUC方案（201800302）的批准。
1. 设计3D打印支架和覆盖条
<ol>
	<li>根据小鼠眼球的平均直径设计3D打印支架和覆盖条，并进行3D打印（图1A，B）。</li>
	<li>支架内壁的直径应略大于眼球的平均直径，以适应不同个体小鼠的尺寸差异。支架高度约为眼球直径的一半，确保在使用3D打印的覆盖条固定时，眼球能够紧密贴合。</li>
	<li>覆盖条的长度应与支架外径一致，宽度为支架直径的1/4至1/2。覆盖条的尺寸设计应便于实验过程中对固定在支架内的眼球进行加湿操作，并在实验结束时方便摘除眼球。</li>
	<li>打印支架和覆盖条。</li>
</ol>
2. 样本采集
<ol>
	<li>采用符合机构指南的既定方案处死小鼠（本研究使用9至12周龄及27周龄的雄性C57BL/6小鼠）。在本方案中，先使用二氧化碳实施安乐死，随后进行断头。</li>
	<li>取下小鼠头部并立即置于冰上，以保持组织活性。使用解剖工具摘除眼球，操作过程中避免组织损伤。</li>
	<li>用镊子将眼球突出。用解剖剪在镊子夹持位置稍下方剪断视神经。 
	注意：为确保安全，后续步骤应在超净工作台内进行。</li>
	<li>将眼球置于含2 mL培养基的p35细胞培养皿中，在37 °C、5% CO2、低光照条件下孵育1小时，培养基中加入钙离子指示剂和/或细胞膜染料。确保眼球完全浸没于染色液中，以实现均匀染色。
	<ol>
		<li>本实验所用钙离子指示剂为Fluo4-AM（1:100）2，细胞膜复染染料为深红色质膜染料（1:10,000）2，终浓度含1% (v/v) DMSO和0.1% (w/v) 普流罗尼克酸（pluronic acid），溶于2 mL无血清角质形成细胞培养基（KSFM）中，并添加以下生长补充物：25 µg/mL牛垂体提取物、0.02 nM表皮生长因子、0.3 mM CaCl2，以及青霉素-链霉素（分别为100单位/mL和100 µg/mL）。 
		&#8203;注意：孵育条件和时间可根据所用钙离子指示剂、组织类型和样本体积进行调整。使用普流罗尼克酸时需谨慎，因其可增加组织通透性。本方案使用10%普流罗尼克酸。实验表明，较低浓度无效，而较高浓度可能损伤组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品支架的制备
<ol>
	<li>使用未使用过的胶水将支架粘附到干净的玻璃底盖玻片上。本方案中使用的胶水来自一次性容器，以确保无菌，每次均使用新的未开封容器。</li>
	<li>用70%乙醇清洗支架。将胶水涂在支架上，并将支架粘附到玻璃底盖玻片上。确保支架内区域无胶水残留，因为胶水可能产生荧光，干扰成像。</li>
	<li>等待胶水固化，确认支架牢固地固定在盖玻片上。 
	注意：本研究中使用的实验材料为P35细胞培养板，其带有玻璃底盖玻片。可根据实验需求替换为其他玻璃底载玻片和/或培养板。</li>
</ol>
4. 眼球的损伤处理
<ol>
	<li>使用无菌滴管将眼球从染色液中取出，注意避免损伤目标区域的组织。用无菌磷酸盐缓冲液在室温下清洗眼球 5 分钟，以去除多余的染料，并将眼球置于运输介质中，送往显微镜进行观察。</li>
	<li>使用无菌 25 G 针头在目标区域对眼球进行造伤。
	<ol>
		<li>使用无菌滴管从眼球后部夹取并固定眼球，以保持眼球稳定，防止其滚动，从而确保造伤的一致性。在此操作方式下，视神经将位于滴管喷嘴内部，角膜则朝向外侧。</li>
		<li>对于划痕损伤，轻轻将无菌 25 G 针头在暴露的角膜表面划过；对于穿刺损伤，轻轻将针头垂直压入角膜中央区域。注意确保伤口未穿透角膜。 
		&#8203;注意：如果实验无需损伤反应或损伤环境，可跳过此步骤。既往研究表明，采用该方法对小鼠角膜造成的划痕和穿刺损伤在直径和深度上均具有一致性10。不同眼球间伤口尺寸的一致性已通过目标区域分析得到验证。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 样品在样品台上的放置
<ol>
	<li>将角膜或角膜缘区域放置在支架内区的盖玻片上，并使用3D打印的盖子固定（图1C-H）。</li>
	<li>确认眼球位置正确，且感兴趣区域与玻璃盖玻片接触。一旦将眼球放入支架中，切勿尝试取出，以免造成组织损伤。</li>
	<li>使用胶水将3D打印的盖子粘附到支架上，确保固定牢固。注意盖子的横杆应粘附在支架上，而非眼球上。 
	&#8203;注意：成像区域朝下放置，因为本方案适用于倒置显微镜。若需适配直立显微镜，可使用内径较小的支架并移除盖子横杆，但会导致眼球稳定性降低。</li>
</ol>
6. 样品成像
<ol>
	<li>打开显微镜和环境培养箱，并确认培养箱已加湿。将环境培养箱设置为 35 °C 和 5% CO2，并在整个实验过程中维持该条件。 
	注意：建议使用配备环境培养箱的显微镜进行本操作，以防止样品脱水并维持眼球组织在最佳温度条件下，但此设备并非必需。</li>
	<li>将盖玻片、支架及稳定的眼球组织置于环境培养箱内的显微镜载物台上，采用活细胞成像技术进行观察9。</li>
	<li>向盖玻片上额外添加培养基，以防止脱水并维持组织活性。确保孔内有足够的培养基覆盖支架中的眼球组织。根据成像持续时间，在实验过程中按需补充新鲜培养基。</li>
	<li>采用活细胞成像技术和相关实验方案开始实验。使用较低的激光功率设置，以保护组织并避免长时间实验中造成组织损伤。选择适合长工作距离的物镜。本研究中使用的实验条件采用 20 倍物镜。 
	注意：激光功率与增益、实验持续时间、成像位置和成像平面等参数均需根据具体实验条件进行调整。以往文献已成功报道对完整眼球组织进行持续 1 至 4 小时的成像实验10。</li>
	<li>以首选文件格式记录并保存数据。显微镜所用软件生成 .czi 格式文件用于数据记录。</li>
	<li>实验结束后，按照所在机构的标准操作规程处理眼球组织样本。</li>
</ol>

<ol><li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Ca2%2B+mobilizations%3A+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422(2019).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2%2B+waves+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+changes+in+Ca%282%2B%29+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li>
<li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li>
<li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li>
<li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73(2018).</li>
<li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin1%3A+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338(2021).</li>
<li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721(2022).</li>
<li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14(2020).</li>
<li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca%282%2B%29+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li>
<li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li>
</ol>

我们没有需要披露的利益冲突。

本方案描述了一种&#160;一种活细胞成像技术，利用3D打印支架固定和稳定完整的动物眼球。该技术旨在克服以往活细胞成像方案中存在的若干显著缺陷 离体 角膜组织。该方案为完整眼球的活细胞成像提供了多种优势。它显著减少了可能干扰实验性划痕伤口愈合反应的非必要组织损伤，包括因解剖操作和暴露于紫外光所导致的神经和上皮损伤。此外，该方案通过固定组织的方式，使培养基能够定期添加而不干扰实验进程，从而维持组织的水合状态和活性。通过调整眼球在支架中的方向，该方案可实现对眼球不同区域的成像。结合共聚焦显微镜使用，该方法可对眼球的不同层面进行成像，从而观察组织结构间的相互作用。该方案具有高度通用性，可适用于小鼠及其他物种不同大小的眼球。支架和盖片可轻松从成像孔中取出，经灭菌后重复使用。3D打印方案高效且节省时间，便于一次性批量制备多个支架。若需保存样本并在日后再次成像，眼球可在支架内进行固定。固定后的组织在固定后数周内仍可保留深红色质膜染料及Fluo4-AM染色信号，这些信号可在针对特定蛋白(s)染色时作为标记物使用。
既往方案要求解剖眼球，随后使用紫外光激活的聚乙二醇（PEG）凝胶...

角膜 
角膜是覆盖在眼球前表面的一层透明、无血管的结构，具有屈光作用，可使光线聚焦以实现视觉功能，同时保护眼球内部免受损伤。由于角膜直接暴露于外界环境，因此容易受到机械性损伤（如划伤）和感染的影响。在其他方面健康的患者中，角膜损伤通常可在1-3天内愈合。然而，对于患有角膜缘干细胞缺乏症或II型糖尿病等基础疾病的患者，角膜伤口的愈合过程可能显著延长1。由于角膜富含神经，这些难以愈合的角膜溃疡和复发性角膜上皮脱落会引发剧烈疼痛，极大降低患者的生活质量1。
细胞信号传导 
当原本健康的角膜受到损伤时，伤口周围细胞中的钙信号事件会先于细胞迁移发生，并促使这些细胞移入伤口区域，从而在无瘢痕风险的情况下闭合损伤2,3这些信号事件已在角膜上皮细胞培养模型中通过活细胞成像得到充分表征。2初步实验表明，与糖尿病细胞相比，非糖尿病细胞在损伤后表现出显著增强的钙信号传导。然而，对细胞信号转导事件的表征仍需进一步研究。 离体 眼球的制备已被证明是一项技术挑战。
活细胞成像 
以往的研究已成功记录了角膜创伤愈合的体外细胞培养模型中的钙信号事件4,5,6。开发一种用于在离体组织中获取这些信号事件高质量图像的方法具有重要意义，因为它能够在更复杂且更接近真实的生命系统中研究这些事件。以往的方法包括将角膜解剖后，固定于紫外光诱导的聚乙二醇（PEG）凝胶中7,8,9。在活体组织实验中，固定是一个关键但具有挑战性的步骤，因为组织在整个实验过程中必须保持活性和充分水合状态。此外，固定过程不得对组织造成损伤。尽管PEG溶液能够实现组织固定，但所获得图像的分辨率和质量并不稳定。因此，研究人员开发了3D打印支架，用于固定完整的眼球，以在降低组织损伤风险的同时获得更高质量的图像。
该方法 
一种独特的3D打印支架被开发用于固定完整的 离体 用于活细胞成像的眼球固定装置。该固定装置可防止来自两个主要来源的损伤：它能够在无需解剖角膜的情况下对去核眼球进行成像，并避免样品暴露于紫外光下。由于消除了这些损伤因素，所获得的图像能更准确地反映实验中划痕损伤后的细胞反应。此外，该3D打印固定装置根据小鼠眼球的精确尺寸进行校准，相比聚乙二醇（PEG）溶液固定法，能实现更佳的贴合效果，从而在较低倍物镜下即可获得更高质量的图像，原因在于组织移动显著减少。固定装置顶部附带的覆盖条可确保眼球在整个实验过程中保持静止，并在添加培养基以维持组织水合状态和活性时防止眼球发生位移。该装置可根据精确尺寸进行打印的特性，还使我们能够针对因年龄或疾病状态不同而导致眼球尺寸差异的小鼠，制作出最适配的固定装置。该技术亦可进一步推广，用于根据不同物种眼球的尺寸开发相应的成像固定装置。

<table><tbody><tr><td>1.75 蓝色聚乳酸（PLA）塑料</td><td>Creality (中国深圳)</td><td>N/A</td><td>支架材料</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿，No. 1.5 盖玻片，玻璃直径 14 mm，聚-D-赖氨酸包被</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>用于成像的培养小室。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360 软件</td><td>Autodesk (San Rafael, CA)</td><td>N/A</td><td>用于打印支架的软件</td></tr><tr><td>BD 25 G 7/8 无菌一次性针头，100 根/盒</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>305124</td><td>用于实验性眼球损伤造模</td></tr><tr><td>CellMask DeepRed</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>C10046</td><td>细胞膜反染染料。钙离子指示剂。使用浓度为 1:10,000，终浓度为 1% (v/v) DMSO 和 0.1% (w/v) 普流罗尼克酸</td></tr><tr><td>Complete Home 超强胶水</td><td>Walgreens (Deerfield, IL)</td><td>N/A</td><td>用于将支架固定在成像培养皿上</td></tr><tr><td>Ender 3 Pro 3D 打印机&amp;nbsp;</td><td>Creality (中国深圳)</td><td>N/A</td><td>用于打印支架</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ</td><td>ImageJ (Bethesda, MD)</td><td>许可证编号：GPL2</td><td>用于通过感兴趣区域分析，验证不同独立眼球之间伤口深度和直径的一致性</td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>F14201</td><td>钙离子指示剂。使用浓度为 1:100，终浓度为 1% (v/v) DMSO 和 0.1% (w/v) 普流罗尼克酸</td></tr><tr><td>角质形成细胞无血清培养基</td><td>Gibco (Waltham, MA)</td><td>17005042</td><td>添加了 25 mg/mL 牛垂体提取物、0.02 nM EGF、0.3 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 以及青霉素-链霉素（分别为 100 单位/mL，100 &amp;micro;g/mL）的培养基</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td><td>21-040-CV</td><td>用于成像前清洗角膜上多余的染料</td></tr><tr><td>蔡司 AiryScan 共聚焦 880 显微镜</td><td>Zeiss (Thornwood, NY)</td><td>N/A</td><td>使用 20 倍物镜</td></tr></tbody></table>

活细胞成像技术在完整样本中的应用 离体 使用新型3d打印支架的球形体培养

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

角膜上皮伤口愈合是一种由上皮细胞表面表达的嘌呤能受体激活所启动的迁移过程。受体激活引发钙离子动员事件，并在细胞间传播，这对于启动细胞向伤口区域移动、促进高效伤口愈合至关重要。Trinkaus-Randall 实验室已建立一种成像方法，用于观察角膜伤口愈合反应 离体 小鼠眼球的实时成像。该方法包括按照既定方案实施安乐死的小鼠中完整摘除眼球，并立即用钙离子指示剂染料孵育眼球。在此阶段可施加一种复染剂，以标记细胞的其他结构特征，辅助成像并显示细胞解剖标志。本方案已成功结合多种不同的活细胞染料用于复染，包括SiR-肌动蛋白（SiR actin）用于标记肌动蛋白，以及深红细胞膜染料（deep red plasma membrane stain）用于标记细胞膜。为研究伤口反应，使用25 G针头损伤角膜上皮，随后将眼球置于3D打印的固定装置中。该3D打印装置的尺寸经过校准，可在整个实验过程中确保眼球的稳定固定，并可根据不同大小的眼球进行调整。利用共聚焦显微镜，对伤口反应进行随时间推移的多深度连续活细胞成像。本方案可使用共聚焦显微镜配备的20倍空气物镜获得高分辨率、适合发表的图像。其他物镜也可用于本方案。该方法显著提升了活细胞成像的质量 离体 小鼠眼球，并可识别神经和上皮组织。

该方案已持续用于获得可发表质量的数据和图像10。所获得的图像与以往方法相比具有显著改进（图2）。利用3D打印支架，可对角膜各层进行成像，并可在不同z平面观察钙离子动员情况（图3）。该方法已用于比较年轻和老年小鼠角膜伤口处顶端与基底细胞层之间的细胞间信号传导10。
改进后的稳定性还使得眼球成像时间显著延长，远超以往可能实现的时长。这使得对细胞迁移进入伤口床的研究得以比以往延长数小时。借助这一延长的时间线，可在角膜损伤后观察到年轻小鼠与老年小鼠在伤口愈合反应中细胞行为的显著差异10。在本实验方案中，每5分钟采集一次数据，持续4小时。使用该固定装置时，在整个实验过程中，x、y或z轴方向均未观察到明显的漂移（图4，视频1）。
<p...

本研究描述了一种利用3D打印支架实现去核眼球高分辨率活细胞成像的新型实验方案。通过该方案，可观察角膜上皮损伤后去核眼球中细胞钙信号活动 离体 眼球可在实时下被观察到。

活细胞成像技术在完整样本中的应用 离体 使用新型3D打印支架的球形体培养

角膜上皮伤口愈合是一种由上皮细胞表达的嘌呤能受体激活所启动的迁移过程。这种激活……

本方案中使用的3D打印支架可实现实时监测角膜损伤后的短期细胞信号传导和长期细胞迁移事件。通过保持眼球完整、存活且固定不动，该方案能够获得高质量的角膜活细胞实时图像，包括上皮细胞和神经。该3D打印支架可轻松修改以适配不同大小和物种的眼球。我们还可以调整眼睛的方向，以成像其他区域或进行纳米压痕实验。首先，在处死小鼠并取下头部后，立即将其置于冰上，以保持组织的活性。然后使用镊子通过推进的方式摘除眼球。用解剖剪在镊子夹持位置下方剪断视神经。将眼球置于含钙离子指示剂和/或细胞膜染料的培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳及低光照条件下，于P-35细胞培养皿中孵育一小时，总体积为两毫升，确保眼球完全浸没于染色液中以实现均匀染色。为将样品托固定于洁净的玻璃底盖玻片上，需先用70%乙醇清洗托架，然后在托架上滴加胶水。然后，将支架粘附到玻璃底盖玻片上，确保支架内侧区域无胶水残留，因为胶水可能产生荧光，干扰成像。待胶水固化后，确认支架已牢固固定在盖玻片上。使用无菌滴管从染色液中取出组织球，注意避免损伤感兴趣区域的组织。用无菌磷酸盐缓冲液在室温下洗涤眼球5分钟，以去除多余的染料，并将眼球置于运输介质中，送往显微镜处。使用无菌25号针头在目标区域对眼球进行损伤时，应从眼球后部夹起并固定眼球，同时使用无菌滴管稳定眼球，防止其滚动。对于划痕损伤，轻轻将无菌25号针头划过暴露的角膜表面；对于穿刺损伤，则轻轻将针头垂直刺入中央角膜，注意避免刺穿角膜基底膜。将角膜或角膜缘区域放置在支架内侧的盖玻片上，同时确认眼球位置正确，且目标区域与玻璃盖玻片接触。使用胶水将3D打印的盖子固定在支架上以保持稳定。切勿尝试取出眼球，以免造成组织损伤。打开显微镜，将环境培养箱设置为35摄氏度和5%二氧化碳，并确认加湿培养箱正常工作。将盖玻片支架和稳定球体置于环境培养箱内的显微镜载物台上，使用活细胞成像技术进行成像。通过向盖玻片上添加额外的生长培养基以防止脱水并维持组织活性，确保孔内有足够的培养基覆盖支架中的球体。采用活细胞成像技术开始实验，使用低功率激光设置以保护组织并防止组织损伤，同时选用适合长时间实验的物镜。以CZI文件格式记录并保存数据。通过对由3D打印支架固定的离体角膜进行成像，获得了高质量的多层结构图像，展示了角膜上皮层、基底层和基质层中的钙信号事件。对固定在3D打印支架中的角膜在划痕伤口处进行Z轴层扫成像，以观察角膜各层中的细胞膜和钙信号，以及不同Z平面内的钙离子动员情况。对角膜进行时间序列实验，以研究在愈合反应过程中细胞向伤口床的迁移，结果显示眼球在X、Y或Z方向上的移动极小。观察发现，将眼球置于支架中后，可清晰观察角膜的不同区域，包括中央区域和角膜缘区域。本方案使我们能够对表现出伤口愈合差异的疾病模型的眼睛进行成像。我们可以在活体组织中表征细胞信号传导和细胞运动性方面的异常。

live-cell-imaging-intact-ex-vivo-globes-using-novel-3d-printed

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用新型3D打印支架对完整的 离体 地球仪进行活细胞成像

本方案描述了三种黑腹果蝇（Drosophila）样品制备方法：1）成年果蝇脑组织解剖，2）成年果蝇视网膜解剖，以及3）发育中眼盘-脑复合体解剖。重点介绍了适用于活体成像的特殊制备技术和条件，尽管所有样品制备方法也可用于固定组织的免疫组织化学染色。...

发育期与成年个体的制备 果蝇 用于活体成像的大脑与视网膜

活细胞成像与胚胎上皮细胞的定量分析 Xenopus laevis

细胞迁移等细胞过程传统上是在二维刚性塑料表面进行研究的。本报告描述了一种技术，可直接观察蛋白质定位，并分析在更接近生理条件的三维基质中迁移细胞内的蛋白质动态变化。...

活细胞成像观察在三维基质中迁移并表达荧光标记蛋白的细胞

长时间实时成像胚胎组织具有挑战性。本文介绍一种可在较长时间内以高空间和时间分辨率监测鸡胚脊髓中细胞及亚细胞水平变化的检测方法。该技术可适用于神经系统及其他胚胎发育区域的研究。...

发育中的神经上皮内细胞行为的高分辨率活体成像

我们描述了小鼠胚胎皮肤的分离及ex...

离体 小鼠胚胎皮肤培养及黑素母细胞迁移的活体成像

造血干细胞与祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间相互作用的性质尚不明确。通过定制的硬件改装和多步骤采集方案，可结合双光子显微镜与共聚焦显微镜进行成像 离体...

体内 成年小鼠颅骨骨髓中造血干细胞与祖细胞的四维追踪

我们报道了一种用于研究细胞和胚胎的装置及新方法。单个细胞被精确地排列在微腔阵列中。这种三维限制更接近生理条件下的三维环境，有助于细胞器的定向排列。通过控制细胞形态，该装置可最大限度地减少标准检测中常见的变异性。...

在三维限域中排列单细胞与单胚胎：一种用于高内涵筛选的新装置

我们介绍一种在三维细胞外基质中控制初始细胞簇形状的方法，以获得可重复的模式形成。采用包含两种不同水凝胶的立方体装置，实现组织模式形成的多方向成像。...

用于可重复图案形成的混合凝胶立方体装置中初始三维细胞簇的控制

本方案描述了在培养的斑马鱼神经元和幼体中使用基因编码的过氧化氢（H2O2）生物传感器，以评估H2O2在神经系统发育过程中生理信号传导的作用。该方法可应用于不同类型的细胞，并可通过实验处理进行改良，以研究活性氧（ROS）在一般发育过程中的作用。...

神经元发育过程中的活性氧活细胞成像

我们提供了一种小鼠胚胎培养与成像的详细方案，可实现心脏前体细胞的三维加时间（3D +...

小鼠胚胎早期心脏前体细胞的活体成像

鸡胚被用于研究人类胶质母细胞瘤（GBM）脑肿瘤 在卵内 以及在 离体 脑片共培养。通过延时显微成像可记录胶质母细胞瘤细胞的行为， 离体 共培养，且两种制备物均可在实验终点通过详细的三维共聚焦分析进行检测。...

利用鸡胚脑作为模型 在体 内 和 离体 人类胶质母细胞瘤细胞行为分析

了解使用新型3D打印支架对完整离体眼球进行活细胞成像的方法。该技术可实时监测角膜上皮损伤后的钙信号传导和细胞迁移，为研究角膜损伤修复机制提供高分辨率成像支持。

活细胞成像技术在完整样本中的应用离体使用新型3D打印支架的球形体培养

探索更多视频

活细胞成像技术在完整样本中的应用 离体 使用新型3D打印支架的球形体培养

探索更多视频

活细胞成像技术在完整样本中的应用离体使用新型3D打印支架的球形体培养