评估新热带 Anurans 不同尺度生物标志物的生态毒理学方法

虽然评估生化生物标志物的技术被广泛使用，但该协议为在新热带 anurans 中标准化和复制该方法提供了关键细节。这种技术的主要优点是成本低、可复制性和应用性。该技术可用于获取定量数据以评估内部黑色素的变化。

彗星测定是一种灵敏、通用且简单的技术，可以确定特定化合物诱导的遗传毒性作用。它可以应用于任何类型的真核细胞，以监测 DNA 损伤、DNA 修复和评估细胞的抗氧化状态。首先，打开软件 Image-Pro Plus 6.0 并选择菜单和工具栏作为生物。

要量化黑色素占据的面积，请选择 measure，然后选择用于拍摄显微照片的放大倍数的空间校准。打开组织学图像后，选择工具计数，然后选择测量对象。使用 Select colors and dropper 工具在图像中标记要测量的颜色，然后关闭窗口。

通过单击 count、view 和 statistics 来可视化结果。将 PBS、过氧化氢和样品的混合物放入光程为 1 厘米的 3 mL 石英比色皿中孵育。然后取出保存在 500 微升离心管中的样品，并将其添加到石英比色皿中。

在紫外分光光度计中读取 240 纳米处的过氧化氢酶动力学 2 分钟，并使用屏幕上所示的方程计算酶活性。用 1 毫升 PBS 稀释收集的血液样品。以 381 G 离心 9 分钟，然后用 50 mL PBS 重悬沉淀。

将 30 微升血液样品与 70 微升浓度为 0.5% 琼脂糖的低熔点琼脂糖或 LMPA 混合，形成第二层。将 50 微升第二层放在载玻片上，该载玻片之前涂有含有 100 微升 0.5% 正常熔点琼脂糖的第 1 层。用盖玻片盖住载玻片，并将其置于 4 摄氏度的低温中 10 分钟以固化第 2 层。

凝固后，取下盖玻片。通过放置 100 微升 0.5% LMPA 形成第三层，然后再次覆盖载玻片。第三层凝固后，取下盖玻片，将每张玻片浸入 100 毫升 Coplin 染色缸中，该罐含有当天制备的裂解液。

将 Coplin 罐放入 4 摄氏度的冷水浴中，在黑暗中放置 1 小时以进行裂解。裂解结束时，取出载玻片，将其浸入电泳槽中的电泳缓冲溶液中，在 4 摄氏度下浸泡 15 分钟，以使 DNA 解散。细胞核 DNA 解旋后，在 4 摄氏度的同一缓冲液上以 25 伏特和 250 毫安电流进行电泳 10 分钟。

电泳结束时，加入 2 毫升 tris 盐酸溶液 3 次，持续 5 分钟，中和玻片中的样品。将样品放入 100 毫升含 95% 酒精的 4 摄氏度 Coplin 罐中，使样品脱水。通过在载玻片中心添加 10 μL DAPI 对样品进行染色。

然后用盖玻片将染料涂抹在整个样品中。在带有 NU 滤光片的荧光显微镜下检查载玻片。通过评估 DNA 从类核迁移的长度来量化 DNA 损伤。

在这种情况下，在 100 个随机选择的单元格上直观地确定它，没有重叠。然后将 DNA 损伤分为四类，其中 0 到 1 表示无损伤，2 表示最小损伤，3 表示中等损伤，4 表示最大损伤。将数据表示为每个治疗组的平均受损细胞数和平均彗星评分。

最后，根据这些数据，使用屏幕上显示的方程计算每个测试生物体的遗传损伤指数或 GDI。Boana pulchella 和 Leptodactylus luctator 成虫的缩放质量指数如图所示。为了分析缩放质量指数，进行了非线性回归分析，证明了物种的 SVL 和体重之间的幂函数关系，以确定缩放指数。

缩放质量指数可用于比较来自同一物种的成鱼或幼鱼组。此处介绍了 Boana raniceps 肝脏的组织学切片。从这些切片中可以观察到更多的 c 和更大的肝细胞和肝细胞核的尺寸。

该图显示了 Boana pulchella 除草剂情况下细胞遗传学生物标志物的不同和互补反应。此处，黑色条表示 48 小时，灰色条表示 96 小时。暴露时间和浓度应始终被视为一个因素，因为特定的时间或浓度可能不足以引起损害。

代表性图像描述了生物标志物与生物标志物反应指数的关系。在这里，蓝色表示对照组，而橙色、黄色和绿色表示暴露于 BDE 209 的情况。该数据表明，过氧化氢酶是压力源以最高浓度存在的应激情况下的有效生物标志物。

在计算身体状况指数时，请始终从相同的距离拍摄照片。在蝌蚪中，测量 SVL 体长，直到泄殖腔管，不包括领鳍。这种方法安全地解决了两栖动物的生理学和环境变化的影响。

虽然存在替代的潜在侵入性生物标志物，但这些方法提供了对氧化应激、毒理动力学和毒理原学的见解。与氧化应激相关的其他酶测量可以作为替代方法。色差分析技术根据色差评估显微照片中的组织反应。

对于颜料系统，请确保程序的校准与显微照片一致。这种先进的技术有助于研究外源性生物是否直接影响不同细胞类型的 DNA，解决其他细胞遗传学技术无法解决的有关遗传物质氧化损伤和修复过程的问题。