Name: 评估新热带 Anurans 不同尺度生物标志物的生态毒理学方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习评估新热带无尾目动物生态毒理学生物标志物的标准化方法，利用彗星实验和Image-Pro Plus软件检测DNA损伤与黑色素变化。该技术成本低且可重复，适用于监测遗传毒性和细胞抗氧化状态。

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作者谨此致谢圣路易斯化学研究所（Instituto de Química de San Luis） &#34;Dr. Roberto Olsina&#34;- 感谢国家科学技术研究委员会（INQUISAL-CONICET）、圣路易斯国立大学（项目PROICO 2-1914）、南马托格罗索联邦大学生物科学研究所实验病理学实验室（LAPEx-INBIO-UFMS）、拉普拉塔国立大学细胞学讲席、国家科学促进署（FONCYT；PICT-2018-02570 和 PICT-2018-01067）提供的经费支持。我们还要感谢圣路易斯国立大学科学写作协助中心（GAECI-UNSL）以及母语为英语的Lidia Unger对稿件进行的校对工作。

作者声明无竞争利益。

个体水平的生物标志物非常易于测定且成本低廉，因为检测这些生物标志物仅需少量设备，而这些设备通常在任何科研实验室中都具备。此外，这些生物标志物可提供有关动物健康状况和适应性的总体信息。每个实验方案中所使用的动物数量对于获得可靠结果至关重要。由于数据存在变异性，每种处理组至少需要五只动物（N = 5）。具体而言，个体水平生物标志物测定中的一个关键步骤是测量SVL以计算体况指数，因为相机拍摄角度的变化可能导致SVL测量值的偏差。必须确保同一研究中所有个体的图像均以相同的方式拍摄，即采用相同的拍摄角度和相同的物距。然而，出于节省时间的考虑，通过图像分析法测量SVL优于使用卡尺进行测量。因此，采用这种图像分析方法将有可能增加被研究动物的数量，从而获得更稳健和可靠的结果。
肝体指数可用于比较同一物种的成体、幼体甚至幼虫群体，由于肝脏是主要的解毒器官，该指数的显著变化可能提示组织学和生物化学水平的改变。性腺指数适用于比较同一物种的成年无尾目动物群体，由于卵巢与睾丸在尺度上存在差异，雌性和雄性必须分别进行比较。该指数的显著变化可能提示性腺发生过程的改变，进而影响生物体的繁殖能力。
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环境胁迫因子进入天然水体可能影响水生生态系统的健康1。这些环境胁迫因子可通过不同的毒性机制影响水生生物的存活或适应性，包括短期和长期的直接暴露2。因此，基于实验室的标准生物测定法评估与适应性和存活相关的毒理学终点，可能无法可靠地反映野外环境中胁迫所导致的多种间接效应。此外，生理水平的正常变化以及对个体的影响（例如捕食能力的变化）可能是评估生物体存活和繁殖适应性的更佳长期指标，并最终反映生态系统健康的状况1,3。基于已知的一组环境参数和污染物浓度，预测生态系统组成与功能以及生物体健康状况的变化，对于改进污染管理具有重要意义1。
生物标志物是指由于暴露于异源化学物质或受其影响而产生的生化、生理或组织学上的变化4,5。生物标志物已被证明可作为有效的早期预警信号4,5。生物标志物有助于回答的一个重要问题是：环境中某些应激因子的浓度是否已达到足以引发有害效应的水平。这些信息有助于评估是否值得进一步调查损害的性质与程度以及致因因子，或是否应在该情况下停止投入更多资源6,7,8。此外，由于将单一生物标志物作为生物指示剂进行评估的概念可能并不充分5,7,8,9,10，目前日益倾向于对多个生物标志物进行综合评估，以检测早期预警信号，从而防止对生态系统造成不可逆的影响。
必须注意，所有毒性效应均始于应激因子与生物分子的相互作用。从这一意义上讲，效应会逐级级联传递，贯穿生化、亚细胞、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统、景观乃至生物圈等各个组织层次。细胞是环境应激因子与生物系统相互作用的主要场所。因此，理解分子与遗传效应有助于研究人员关联不同生态组织层次，并预测尚未经过测试的环境污染物对人类健康等可能产生的影响5。此外，由于细胞具有高度特异性，它们不仅可用于评估环境污染物，也可用于评估人类健康状况5,11。因此，理解应激因子在生化水平上的效应，可为揭示所观察到效应的成因提供线索，并将其与更高层次的效应相联系5。此外，通过了解应激因子的生化作用机制，还可基于新应激因子与已知污染物在功能上的相似性，预测尚未进行毒理学评估的新型应激因子可能产生的效应。在多种环境应激因子存在的情况下，遗传与生化生物标志物可为所观察到的特定效应提供有价值的信息。除此之外，与生化变化相关的组织化学评估还可提供有关毒物动力学的信息5。总之，必须对细胞、生化及组织学生物标志物进行综合分析10,12，而此类分析也应纳入针对本地物种的生物监测项目中5,13,14。
然而，在实验室条件下研究生物标志物可能会遇到一些困难，包括在污染物暴露后难以检测亚致死效应和慢性影响、所用方法的验证与标准化困难，以及复杂的时间或剂量依赖性反应、与适合度之间关系不明确或未确定，还缺乏整合的机制模型1,4。解决这些问题的方法并非增加所测定生物标志物的数量，而是应精心设计研究方案和可检验的假设，以阐明化学物质对完整生物体产生效应的机制基础4。
生态毒理学中的新问题凸显了应用一组生物标志物的重要性，以生成生态毒理学预测，从而更好地解释环境胁迫因子对生物体的影响，并支持关于其潜在影响的决策。此外，在环境风险评估和生物监测中结合使用生物标志物与生物指示物这两个概念的重要性在于，这将使研究人员能够判断特定关注环境中的生物体在生理上是否正常或处于应激状态。本研究采用的方法类似于对人体进行的生化分析。从这一角度而言，可分析一组生物标志物，以判断生物体在野外和实验室条件下是否健康6。最后，生物标志物将在两个方面有助于生态风险评估：（1）评估稀有和/或长寿命物种的暴露情况；（2）检验关于化学物质在不同生物组织水平上产生影响的机制假设4。
近十年来，生物标志物已被用于无尾目动物中监测其对细胞毒性和基因毒性污染物的暴露情况。其中，应用最为广泛的技术包括微核（MN）试验以及彗星试验，即通过单细胞凝胶电泳（SCGE）检测单链DNA断裂。此外，这些技术已成功用于评估多种新热带区无尾目动物在不同环境胁迫因子作用下所诱导的DNA损伤14,15,16,17,18,19。其他生物标志物还可用于检测暴露于环境污染物后生物体氧化状态的变化16,17,18,19。氧化应激是生物体暴露于不同外源性物质后产生的反应，可导致多种有害效应，包括影响暴露个体的抗氧化能力5,6,7,19,20。
在生态毒理学研究中，生物指示物种被用于识别环境胁迫因子在较高组织水平（如个体、种群、群落和生态系统水平）上的长期相互作用和有害效应10,20,21。通过整合生物标志物和生物指示物这两个概念，可以对物种进行筛选，以广泛界定与一个或多个生物组织水平上观测到的生物学效应相关或关联的生化、生理或生态结构及过程。最后，利用这两个概念以提高对胁迫因子毒性效应评估准确性的重大挑战，在于分析那些在生态风险评价中具有高实用价值的生物标志物和生物指示物20。在此意义上，学界普遍认为，将生物标志物和生物指示物作为早期预警信号具有重要意义，因为它们能够提供有关测试生物对环境胁迫因子响应的重要信息12,20,21。
两栖动物是全球最受威胁且数量下降最快的生物类群之一。导致其数量下降的主要原因之一是进入其栖息地的污染物，例如杀虫剂、重金属和新兴污染物22,23,24,25。无尾目动物具有多种使其可作为生物指示物种的特征，例如其皮肤具有通透性、与水环境关系密切，以及对环境污染高度敏感2,23,24。这些特征使两栖动物成为评估环境健康状况的有效生物指示剂7,8,22,23,24,26。
然而，不仅需要考虑基础操作流程的优化以及对照组历史数据的生成，还必须采用特定的生物测定方法来评估器官和组织的反应，以阐明在生物指示物中观察到的效应的性质和变化。基于此，本研究旨在描述一系列可在不同生态水平下应用于新热带无尾目动物各个生活阶段的生态毒理学方法，并验证这些方法作为在野外和实验室条件下均适用的有效生物标志物。本研究提出了一组可整合的生物标志物，这些标志物已在暴露于环境胁迫因子的无尾目动物的实验室和野外生物监测中得到验证。

<table><tbody><tr><td>分析级</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>&amp;nbsp;耐力</td><td>&amp;nbsp;E0203-250V&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>伊红&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>&amp;nbsp;奥林巴斯</td><td>&amp;nbsp;BX50</td><td>配备合适的滤光片组合</td></tr><tr><td>哈里斯苏木精</td><td>默克</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高分辨率照相机&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;&gt;1600万像素</td></tr><tr><td>匀浆器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水平电泳槽</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>丹佛仪器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>DM4000 B</td><td>配备 Leica DFC 280 图像采集系统</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>2265</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>P3558</td><td></td></tr><tr><td>个人计算机</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;配备 Mac OS X、Lynux 或 Windows 系统</td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外&amp;ndash;可见光分光光度计</td><td>瑞利</td><td>723G</td><td>使用紫外灯</td></tr></tbody></table>

评估新热带无尾两栖类不同尺度生物标志物的生态毒理学方法

Ecotoxicological Methodologies to Evaluate Biomarkers at Different Scales in Neotropical Anurans

生态毒理学中的新问题凸显了应用一系列生物标志物的重要性，因为这不仅能改进对环境胁迫因子对生物体影响的解释，还能提高对其潜在影响进行判定的能力。众所周知，在不同组织水平上使用生态毒理学生物标志物，可预测生物体对环境胁迫因子的生物学响应，这在环境风险评估中具有重要价值。
然而，有必要优化基本实验流程，建立对照组的历史数据，并采用特定的生物测定方法来评估器官和组织的反应，以阐明所观察效应的本质及其变异性。因此，本研究旨在描述在不同生态水平下应用于新热带无尾两栖类各个生活阶段的一系列生态毒理学方法，并验证这些方法作为生物标志物在野外和实验室条件下的适用性。在本研究中，这些生物标志物被应用于个体/有机体水平（体况指数）、组织学/生理学水平（组织病理学、组织形态测量学和色素分析）、生化水平（氧化应激相关酶）以及遗传水平（通过彗星实验检测DNA的直接损伤和氧化损伤）。
尽管这些方法因物种不同而存在细微差异或修改，但这些技术为评估外源性物质对无尾目动物的影响提供了有效的生物标志物。无尾目动物具有一些特定特征，使其成为水生和陆地生态系统的有用指示物种。总之，本研究中采用的一组生物标志物已被证明适用于评估新热带区无尾目动物的毒性反应，可进一步推荐作为生物指示物，用于识别污染物对区域水生生态系统的不利影响。最后，建议在特定区域内实现这些重要生物标志物的标准化，并可考虑将其纳入风险评估和决策过程之中。

本文介绍的所有生物标志物检测技术均为简单、快速、便捷、灵敏、低成本且准确的方法。对于每种生物标志物，需注意以下事项。
个体水平 
标准化质量指数 
在毫米尺度上拍摄照片非常重要，因为该数值将用于校准软件，从而在测量SVL变量时相比游标卡尺测量获得更高的客观性。此外，在实验室或野外研究中，个体处理过程中的采样时间往往至关重要，而使用照片进行后续分析可节省处理时间。为了进行标准化质量指数的分析，需进行非线性回归分析，以揭示SVL与体重之间的幂函数关系，进而确定缩放指数（b）（图2）。标准化质量指数适用于比较同一物种的成年或幼年群体。
标准化肝脏指数 
标准化肝脏指数（SLI）反映了肝脏质量相对于标准体长（SVL）的相对大小。尽管该指数可用于成体个体和幼体，但由于幼体体型较小，对成体无尾目动物进行SLI研究更为方便。该参数的改变可能提示在较低水平（如组织学...

本文介绍了用于评估新热带蛙类物种生物标志物的标准化生态毒理学方法。具体而言，本文详细阐述了在不同尺度上的多种生态毒理学评价方法，包括基因水平、细胞-组织学水平、生物化学水平、形态学水平以及个体水平。

生态毒理学中的新问题凸显了应用一组生物标志物的重要性，因为这能够实现更准确的生态毒理学预测……

尽管生化生物标志物的检测技术已得到广泛应用，但本方案提供了在新热带无尾目动物中标准化和重复该方法的关键细节。该技术的主要优势在于其低成本、可重复性及适用性。该技术可用于获取定量数据，以评估体内黑色素的变化。彗星试验是一种灵敏、通用且简单的技术，可用于检测特定化合物诱导的基因毒性效应。该方法可应用于任何类型的真核细胞，以监测DNA损伤、DNA修复以及评估细胞的抗氧化状态。首先，打开Image-Pro Plus 6.0软件，并将菜单和工具栏选择为生物学模式。为了量化黑色素所占的面积，选择“测量”功能，然后选择用于拍摄显微照片的放大倍数对应的空间校准。打开组织学图像后，选择“工具计数”功能，然后选择“测量对象”。使用“选择颜色”和“吸管工具”在图像中标记需要测量的着色区域，然后关闭窗口。通过点击计数、查看和统计来可视化结果。将 PBS、过氧化氢和样品的混合物在容积为三毫升、光程为一厘米的石英比色皿中孵育。然后取出保存在 500 微升离心管中的样品，并将其加入石英比色皿中。使用紫外分光光度计在 240 纳米波长下读取两分钟内的过氧化氢酶动力学，并利用屏幕上显示的公式计算酶活性。用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）稀释采集的血液样本，在 381 ×g 条件下离心九分钟，然后用 50 毫升 PBS 重悬沉淀物。取30微升血液样本与70微升低熔点琼脂糖（LMPA）混合，使琼脂糖终浓度为0.5%，形成第二层。将50微升第二层混合液加至已预先涂有第一层的载玻片上，第一层含100微升0.5%正常熔点琼脂糖。盖上盖玻片，置于4摄氏度低温环境中10分钟，使第二层凝固。凝固后，移除盖玻片。加入100微升0.5%低熔点琼脂糖（LMPA）形成第三层，并再次覆盖载玻片。待第三层凝固后，移除盖玻片，将每张载玻片浸入盛有当日新鲜配制裂解液的100毫升柯铂林罐（coplin jar）中。将Coplin染色缸置于4°C的冷浴中，在避光条件下放置1小时，以使细胞裂解。裂解结束后，取出载玻片并浸入电泳槽中的电泳缓冲液内，在4°C下孵育15分钟，使核DNA解旋。DNA解旋后，在相同缓冲液中于4°C、25伏特和250毫安条件下进行电泳，持续10分钟。电泳结束后，通过每次加入两毫升三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液，重复三次，每次五分钟，中和载玻片上的样品。将样品置于含有95%酒精的100毫升柯普林瓶中，在4°C下脱水。在载玻片中央加入10微升DAPI对样品进行染色。然后用盖玻片将染料均匀分布于各样本中。使用配备NU滤光片的荧光显微镜观察载玻片。通过评估DNA从核样结构迁移的长度来定量DNA损伤程度。在此情况下，从100个随机选择且无重叠的细胞中进行目视判定。然后将DNA损伤分为四类：0至1分为无损伤，2分为最小损伤，3分为中等损伤，4分为最大损伤。以每个处理组的受损细胞平均数和平均彗星评分来表示数据。最后，根据屏幕上显示的公式，利用这些数据计算每种测试生物的遗传损伤指数（GDI）。本图展示了成年美丽树蛙（Boana pulchella）和勒氏细趾蟾（Leptodactylus luctator）的标准化质量指数。在分析标准化质量指数时，进行了非线性回归分析，以揭示该物种SVL与体重之间的幂函数关系，从而确定缩放指数。加权质量指数可用于比较同一物种的成年或幼年群体。此处展示了拉氏沼蛙（Boana raniceps）肝脏的组织学切片。从这些切片中可以观察到肝细胞及其细胞核的c含量更高，且肝细胞和细胞核的尺寸更大。本图展示了在除草剂暴露情景下，美丽雨蛙（Boana pulchella）中细胞遗传学生物标志物的不同且互补的反应。其中，黑色柱状图表示暴露48小时，灰色柱状图表示暴露96小时。暴露时间和浓度在此应始终被视为影响因素，因为特定的暴露时间或浓度可能不足以诱导损伤。代表性图像描述了生物标志物与生物标志物响应指数之间的关系。其中，蓝色代表对照组，而橙色、黄色和绿色代表暴露于BDE 209的不同情景。该数据表明，过氧化氢酶是一种有效的生物标志物，适用于应激源浓度最高时的应激状况。计算体型状况指数时，应始终从相同距离拍摄照片。对于蝌蚪，测量从吻端到泄殖腔管的SVL体长，不包括背鳍褶。该方法可安全地反映两栖动物的生理特征及其对环境变化的响应。尽管存在其他可能具有侵入性的生物标志物，但这些方法可提供关于氧化应激、毒物动力学和毒物遗传学的信息。与氧化应激相关的其他酶学检测可作为替代方法。色差分析技术基于颜色差异，对显微照片中的组织反应进行评估。对于色素系统，需确保程序的校准与显微照片一致。该先进技术在研究外源性物质是否直接作用于不同类型细胞中的DNA方面具有重要作用，可解答其他细胞遗传学技术无法涉及的关于遗传物质氧化损伤及修复过程的问题。

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