Name: 大肠杆菌中天然偶联质粒介导的水平基因转移检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 了解检测大肠杆菌中天然偶联质粒介导的水平基因转移方法。该技术利用差异标记高效识别接合事件，为研究抗生素耐药性进化和流行病学监测提供高灵敏度工具。

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LM-B、IMG、AT 和 IS 获得了由 NIH 基金 GM055246（授予 LM-B）的支持。GC-C 连续两年获得了加州大学墨西哥与中美洲研究中心（UC MEXUS）-墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）博士后奖学金：2017-18 学年和 2018-19 学年。我们衷心感谢由基因泰克基金会（Genentech Foundation）资助的学术启迪网络（GAIN）导师项目的学生 Sage Chavez 和 Pepper St. Clair 在实验中提供的技术支持。

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<li>de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+DNA+metabolism+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).</li>
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<li>Koraimann, G., Wagner, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+behavior+and+decision+making+in+bacterial+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Social behavior and decision making in bacterial conjugation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54(2014).</li>
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<li>Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mobility of plasmids.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).</li>
<li>Balbuena-Alonso, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+plasmid+content+in+food+isolates+of+E.+coli+strongly+supports+its+role+as+a+reservoir+for+the+horizontal+transfer+of+virulence+and+antibiotic+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes.</a> Plasmid. 123-124, 102650(2022).</li>
<li>San Millan, A., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+costs+of+plasmids%3A+A+limit+to+plasmid+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission.</a> Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).</li>
<li>Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+plasmid+mobility%3A+Origin+and+fate+of+conjugative+and+nonconjugative+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids.</a> Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).</li>
<li>Bevan, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+plasmids+encoding+blaCTX-M+from+faecal+Escherichia+coli+in+travellers+returning+to+the+UK+from+South+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia.</a> The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).</li>
<li>Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+plasmids+disseminating+CTX-M-15+among+human%2C+animals+and+the+environment+in+Mwanza+Tanzania%3A+a+need+to+intensify+one+health+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach.</a> Antibiotics. 10 (7), 836(2021).</li>
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<li>Alderliesten, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+donor-recipient+relatedness+on+the+plasmid+conjugation+frequency%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis.</a> BMC Microbiology. 20 (1), 135(2020).</li>
<li>Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+influencing+bacterial+conjugation+in+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 673260(2021).</li>
<li>Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-induced%2C+increased+conjugative+transfer+is+common+to+diverse+naturally+occurring+ESBL+plasmids+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2119(2019).</li>
<li>Suchman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+for+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction protocol.</a> American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).</li>
<li>Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+heredity+of+multiple+drug+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria.</a> Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).</li>
<li>Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+rate+of+plasmid+transfer%3A+an+end-point+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method.</a> Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).</li>
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<li>Jung, B., Hoilat, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MacConkey+medium%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">MacConkey medium.</a> StatPearls. , StatPearls Publishing. (2022).</li>
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<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+extended-spectrum+beta-lactamases+in+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

接合质粒通过重组和水平基因转移，使得细菌能够在特定环境条件下获取一个共有的基因库34。因此，接合质粒是一类具有进化能力的实体，可在数小时内获得并赋予细菌多种功能，使其适应多种环境条件（包括对抗生素的抗性、对金属的抗性、金属的获取、生物膜形成以及致病基因等）。
本研究提出了一种用于鉴定细菌中接合质粒的实验方案。该方案的成功实施依赖于所用标记能够有效区分供体菌株和受体菌株，如培养基A和B中的对照所示。这些标记还需能够有效筛选出携带质粒的细胞。接合反应至关重要，在此过程中，供体与受体必须通过菌毛进行长时间的细胞间接触，才能实现质粒的转移。任何可能破坏细胞间接触的因素，例如孵育时间不足，或对培养物进行振荡或搅拌，均会降低接合效率。受体菌株的选择同样关键，因为某些受体菌株对接合过程具有抗性35,36。LMB100被推荐为首选受体菌株，因其能够接收多种不相容性类型的质粒。
接合率因质粒-供体染色体组合、受体及环境条件的不同而异。已发现特定质粒的接合过程对多种变量敏感，包括生长阶段、细胞密度、供体与受体比例、接合是在液体还是固体培养基中进行、碳源、氧气、胆盐、金属离子浓度、哺乳动物细胞的存在与否、温度、pH值以及接合时间13,14,15。对这些相互作用的研究依赖于首先检测到可深入研究的接合性质粒。因此，本文所述方案也可修改用于探究不同实验变量的影响，尽管这会限制被筛选供体的数量。该方法还可用于鉴定携带辅助性质粒的宿主中的可移动质粒（即&#160;能够通过反式提供可移动质粒所缺失的功能从而促进其接合的质粒in trans6）。
建议了解接合质粒的序列（但如上所述，检测接合现象并非必须）。当供体菌为乳糖阴性（在麦康凯琼脂上形成黄色菌落）时，可使用乳糖阳性受体菌（在麦康凯琼脂上形成粉红色菌落）来区分真正的接合子与能够在筛选接合子的培养基上生长的供体菌。此处描述的方案旨在检测肠杆菌科（Enterobacteriaceae）中环境来源、共生或致病成员的接合质粒；然而，该方案也可用于其他任何具有合适供体、受体、抗生素和颜色标记的细菌种类。在其他细菌中鉴定这些关键组分需要采用多个供体、受体和标记（抗生素和颜色）进行系统的研究所。本方案尚未在革兰氏阳性菌中进行测试。
文献中已报道了本方法的多种变体，近期已有综述20。定性结果也可用不同方式表述（例如，接合子频率和基因转移频率），接合效率可用无量纲单位（mL/CFU × h）表示20。
本文所述方案解决了现有方法此前未能解决的若干局限性16,18,19,20。首先，已确定了合适的受体菌株。其次，通过使用两种抗生素（利福平和链霉素）筛选真正的接合子，可最大限度地降低供体菌因自发突变而对用于筛选接合子的其中一种抗生素产生耐药性的可能性。此外，假阳性接合子也可能源于旁观者保护效应，即供体菌大量产生的酶（如β-内酰胺酶）水解用于筛选接合子的抗生素所致。第三，本方案包含多个实验对照，以确保接合反应的产物为真正的接合子（即已稳定整合供体接合质粒的受体细胞）。本文提供了两种独立的方法来验证接合子的真实性：一是利用麦康凯琼脂中的显色标记，二是通过PCR检测受体菌中接合质粒的复制子及抗生素抗性基因。此外，本文所述方案旨在从肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的环境菌、共生菌和致病菌成员（如大肠杆菌 Escherichia、克雷伯氏菌 Klebsiella、肠杆菌 Enterobacter、柠檬酸杆菌 Citrobacter、沙门氏菌 Salmonella、志贺氏菌 Shigella 及其他物种）中分离和鉴定接合质粒。
为了理解接合作用的机制，研究人员已通过计算机模拟对实验观察结果进行建模。这些预测模型可估算在给定的供体、受体和接合子生长密度条件下的质粒转移频率。一种称为终点模型（endpoint model）的模型发现了液体培养中质粒转移率的阈值，并得出结论：当超过该阈值后，质粒转移速率不受&#160;细胞密度、供体与受体比例以及接合时间的影响19。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）已被用作检测接合子中质粒的替代方法。FISH 通过 DNA 探针与靶 DNA 的杂交，利用荧光显微镜实现对质粒的可视化观察。因此，FISH 可实现对不同细胞群体间质粒流动的直观检测37，但如果通过肉眼筛选而非选择性培养来鉴定接合子，则其灵敏度不及本文所述方法。
迫切需要深入了解接合性质粒的生物学特性，这些质粒正在生态系统各个组成部分（临床环境、农业、污水、野生动物、家养动物、土壤、河流和湖泊）中传播抗生素抗性基因。总之，本文所述方案中提供的简化实验条件有助于大规模筛选供体菌，因此成为研究来源于多种来源接合性质粒的水平基因转移的关键工具。这些方法可用于调查来自不同来源和细菌的接合性质粒中抗生素抗性基因或其他临床相关基因的流行情况，也可被调整用于接合转移的研究。 体内 （例如在脊椎动物肠道中）研究调控接合效率的条件。这些研究将极大增进我们对接合型多药耐药质粒的移动性如何促进多药耐药性传播的理解。

1946年，Lederberg 和 Tatum1描述了大肠杆菌（Escherichia coli）K-12中的一种有性过程，该过程现被称为接合。细菌接合是指一个细菌细胞（供体）通过直接的细胞间接触，单向地将遗传物质转移给另一个细胞（受体）的过程。接合现象在细菌中广泛存在2,3，但通常表达接合机制的供体细胞比例非常小4。
质粒是能够自主复制的染色体外DNA元件。除了含有与质粒复制和维持相关的基因外，质粒通常还携带一系列与适应环境压力相关的基因，例如抵抗重金属或抗生素暴露的基因5。接合型质粒是一类具有特定基因集合的质粒，能够实现向受体细胞的转移，并在转移后维持自身的稳定存在6。在假单胞菌门（Pseudomonadota，同义于变形菌门 Proteobacteria）的细菌中，接合型质粒的大小范围从21.8 kb到1.35 Mb不等，中位长度约为100 kb5,7。这类质粒通常拷贝数较低，可能是为了尽量减少对宿主细胞的代谢负担8,9。
典型的接合装置包含四个组分：转移起始位点（oriT），一种松弛酶、一种IV型偶联蛋白和一种IV型分泌系统（一种称为菌毛的管状结构，可使供体与受体接触）6只有极少数携带接合质粒的细胞会表达接合装置4，但如果质粒提供了适应性优势，接合子便能在群体中迅速扩增。介于35%至超过80%的 E. coli 从不同生境中分离的菌株含有携带至少一种抗生素抗性基因的接合性质粒10,11因此，由接合性质粒介导的水平基因转移是推动抗生素抗性基因全球传播的主要机制12.
在实验室培养中进行的交配实验表明，接合频率受多种因素影响，包括受体细胞的性质、生长阶段、细胞密度、供体与受体比例、接合反应在液体或固体培养基中进行、碳源、氧气、胆盐、金属离子浓度、哺乳动物细胞的存在、温度、pH值以及交配时间13,14,15。
本研究描述了检测特定宿主菌株中接合性质粒存在的方案，定量固体培养条件下接合转移频率的方案，以及验证其向受体细胞转移的确认方法。这些方案可作为筛选适用于科研的天然接合性质粒的第一步。由于这些方案旨在大规模（数十至数百个供体菌株）筛选来自多种来源（环境、共生和致病菌）的细菌中接合性质粒的存在，因此采用了最少且简化的操作步骤。
此外，还展示了检测特定接合质粒的转移是否独立于用于检测的抗生素（即所选择的抗生素抗性基因的相关性）的实验方法，以及比较来自不同环境分离株的两种接合质粒接合转移速率的实验方案。
根据相关接合质粒的遗传组成（质粒复制子和抗生素抗性基因的构成），本方案的每个步骤均可进行修改，以研究多种可能影响接合频率的因素的作用。
通用实验设计： 
进行接合实验所需的基本组分包括供体细胞、受体菌株以及用于筛选供体（抗生素 A）、受体（抗生素 B）和接合子（抗生素 A 和 B）的固体培养基。接合子是指稳定携带供体接合性质粒的受体细胞。
供体细胞对一种抗生素（抗生素A）具有抗性，而对用于筛选受体细胞的标记物或标记物（抗生素B）敏感。抗生素抗性基因的基因组位置（即.，无论其位于供体细胞的染色体还是质粒上）均无需知晓 先验的因为抗生素抗性标记物在供体与受体直接接触后转移到受体，表明供体提供的标记物位于质粒上。
受体菌株（已知能够接收接合质粒）必须具有供体菌株中不存在的稳定可筛选标记；该可筛选标记通常对染色体上携带的抗生素或杀菌剂具有抗性。在接合实验中，受体菌株的选择至关重要，因为不同 E. coli 菌株接收接合质粒的能力存在差异16。
一旦这些条件确立，在供体与受体细胞对接触后，能在同时含有两种抗生素（A 和 B）的培养基上生长的任何菌落均为潜在的接合转接子（图 1）。此结论的前提是：供体能在含抗生素 A 的培养基上生长，但不能在含抗生素 B 的培养基上生长；而受体能在含抗生素 B 的培养基上生长，却不能在含抗生素 A 的培养基上生长。接合转接事件可通过两种诊断试验加以确认。第一种试验是通过聚合酶链式反应（PCR）扩增基因或其他方法，检测接合转接子菌落中是否存在接合性质粒所携带的基因。第二种试验则利用基于乳糖代谢的菌落颜色差异标记。该颜色差异可通过使用麦康凯琼脂（MacConkey agar）显现：琼脂中的乳糖可被能够发酵乳糖（lac+）的微生物作为发酵底物利用。这些微生物产生有机酸（尤其是乳酸），导致 pH 下降。中性红是一种添加于培养基中的 pH 指示剂，当 pH 降至 6.8 以下时，其颜色由微白色变为鲜红色或粉红色17。因此，乳糖阳性的大肠杆菌（E. coli）菌株在麦康凯琼脂上形成较大的粉红色菌落，而乳糖阴性菌株则形成浅黄色且较小的菌落。
<img alt="接合质粒转移示意图；质粒交换、抗生素抗性、PCR分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：用于检测供体菌株中接合质粒存在的实验设计。 在本示例中，供体携带一种含有抗生素抗性基因的接合质粒，该基因赋予其对抗生素A的抗性，但对抗生素B敏感。相反，受体具有染色体上的抗性决定因子，可抵抗抗生素B，但对抗生素A敏感。接合子对两种抗生素（A和B）均具有抗性，因为它们获得了供体的接合质粒（赋予对抗生素A的抗性）以及受体的染色体（提供对抗生素B的保护）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
对于一对供体-受体菌株（在给定实验条件下），接合率可通过将接合子数量除以供体数量或除以受体数量来计算；前者表示供体细胞中功能性表达接合装置的比例16,18，而第二个速率则表示受体菌接受接合质粒的能力19,20在本研究中，除非另有说明，接合率表示转变为接合子的受体细胞所占的比例（即.，每位受者发生率。
本文报道了两个独立的接合实验，涉及一种 E. coli 受体菌和两种 E. coli 供体菌。此外，针对其中一种供体菌使用了不同的抗生素来筛选接合子，以证实单个多重耐药质粒可通过该接合性质粒中存在的任意一种抗生素抗性基因进行筛选。
本研究所使用的供体和受体菌株均已进行全基因组测序，以明确该实验系统的所有组分；然而，这些实验方案的设计旨在筛选序列未知宿主中接合性质粒的存在，也可在此类实验背景下使用；但在这种情况下，需首先对相关基因进行测序。
本方案中使用的供体菌株和受体菌株如下：
供体 1。E. coli SW4955 分离自美国路易斯安那州巴吞鲁日市的一处湖泊。该菌株携带一个大小为 134,797 bp 的接合质粒（p134797），含有 IncFIC(FII) 和 IncFIB (AP001918) 复制子。该接合质粒携带赋予对第三代头孢菌素（blaCTX-M-55）、氨基糖苷类（aac(3)-IIa 和 aadA1）、苯酚类（catA2）、四环素类（tet(A)）、甲氧苄啶（dfrA14）以及磺胺类药物（sul3）耐药性的基因。p134797 的完整图谱详见 图 2A。E. coli SW4955 为乳糖阳性，在麦康凯琼脂培养基上形成粉红色菌落。
供体2。E. coli SW7037 采自美国俄亥俄州奥塔瓦县的伊利湖。该菌株携带一个101,718 bp的接合性质粒（p101718），具有IncI1-I(Alpha)复制子。该接合性质粒含有一个赋予β-内酰胺类抗生素抗性的基因（blaCMY-2）。p101718的完整图谱见图2B。E. coli SW7037 还能发酵乳糖，在麦康凯琼脂平板上形成粉红色菌落。
<img alt="带有标注的耐药基因的大肠杆菌质粒图谱，大小分别为 134797 bp 和 101718 bp，以比较图示呈现。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：本研究中使用的接合质粒的遗传图谱。（A）质粒 p134797，来源于大肠杆菌（E. coli）菌株 SW4955 的接合质粒。（B）质粒 p101718，来源于大肠杆菌（E. coli）菌株 SW7037 的接合质粒。抗生素抗性基因以蓝色标出，属于接合装置的基因以红色标出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
受体菌。使用E. coli LMB100作为受体菌。该菌株不含质粒，对利福平（100 mg/L）和链霉素（100 mg/L）具有抗性。对两种抗生素的抗性可降低供体菌产生抗性突变的可能性，从而避免干扰实验结果的解读。此外，E. coli LMB100为乳糖阴性菌，在麦康凯琼脂培养基上形成的菌落呈淡黄色且较小（与之相对，两种供体菌形成较大、粉红色的菌落），因此可据此与两种供体菌株相区分。
当供体菌为乳糖阴性时，我们建议使用乳糖阳性受体菌（例如 E. coli J53）。LMB100 和 J53 菌株可供其他实验室使用。请将请求连同收件地址和联邦快递（FedEx）账号一并发送至 Gerardo Cortés-Cortés 博士。
用于筛选和计数供体、受体及接合子的固体培养基为直径100 mm的培养皿中的麦康凯琼脂。需添加以下抗生素：(i) 培养基A：羧苄西林（100 mg/L），用于计数供体并确保受体无法在此抗生素条件下生长；(ii) 培养基B：利福平（100 mg/L）+ 链霉素（100 mg/L），用于计数受体并确保供体无法在这两种抗生素条件下生长；(iii) 培养基AB：羧苄西林（100 mg/L）+ 利福平（100 mg/L）+ 链霉素（100 mg/L），用于获得并计数接合子；(iv) 培养基C：不含抗生素，用于划线接种所有被研究的分离株。
比较了 E. coli SW4955 和 E. coli SW7037 中接合性质粒向 E. coli LMB100 的接合转移率。此外，在 p134797 接合性质粒（SW4955 菌株）的情况下，后续实验中将抗生素羧苄西林（100 mg/L）分别替换为庆大霉素（2 mg/L）、氯霉素（25 mg/L）、四环素（10 mg/L）、甲氧苄啶（20 mg/L）或磺胺甲噁唑（100 mg/L），以确定用于筛选的抗生素抗性标记是否对结果产生影响。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管架</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-313630</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>2.0 mL 冻存管</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>14 mL 锥形离心管</td><td>FALCON</td><td>149597</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>14 mL 管架</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8850</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>1 kb DNA Marker</td><td>New England Biolabs</td><td>N0552G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 无菌烧瓶&amp;nbsp;</td><td>PYREX</td><td>5320</td><td>可替换为其他永久性记号笔品牌</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38SI-212</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>琼脂糖（分子生物学级，多用途）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>C-103-50</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>一次性接种环：1 &amp;micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-595</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>DNA 凝胶上样缓冲液 6x&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP119-500</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-2001</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>Eppendorf 锥形离心管：1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>14-282-302</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳设备</td><td>Fisher Scientific</td><td>FP300</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>耐乙醇记号笔</td><td>Sharpie</td><td>37001; 37002; 37003</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>凝胶成像系统（UVP GelSolo）</td><td>Analytakjena</td><td>SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>手套</td><td>X-GEN</td><td>44-100M</td><td>任何品牌的腈手套均可使用</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>432128</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>麦康凯琼脂&amp;nbsp;</td><td>BD DIFCO</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>Master Mix&amp;nbsp;</td><td>BioLabs</td><td>M0496S&amp;nbsp;</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>微量离心管：2.0 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-138</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>穆勒-欣顿琼脂</td><td>BD DIFCO</td><td>DF0479-17-3</td><td></td></tr><tr><td>穆勒-欣顿肉汤</td><td>BD DIFCO</td><td>275730</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 质粒小量提取试剂盒（用于质粒DNA）</td><td>Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL</td><td>740588. 250</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管架</td><td>AXYGEN&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;R96PCRFSP</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>PCR 管（0.2 mL）</td><td>AXYGEN&amp;nbsp;</td><td>PCR-02-C</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>利福平</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-164-7517</td><td></td></tr><tr><td>一套可分别移取 1 - 10 &amp;mu;L（P10）、2&amp;ndash;20 &amp;mu;L（P20）、20&amp;ndash;200 &amp;mu;L（P200）和 200&amp;ndash;1000 &amp;mu;L（P1000）的移液器</td><td>RAININ</td><td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td><td>移液器应经过校准；可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>335905P</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>用于 10 &amp;mu;L、200 &amp;mu;L 和 1000 &amp;mu;L 的无菌吸头&amp;nbsp;</td><td>Eclipse</td><td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染料&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>BioLabs</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler C1000 Touch&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>可替换为其他品牌</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td>可替换为其他品牌</td></tr></tbody></table>

由天然接合性质粒介导的水平基因转移检测 e. coli

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

接合转移是促进革兰氏阴性菌水平基因转移的主要机制之一。本研究以两种天然存在的接合质粒为例，描述了研究天然接合质粒动员能力的方法。这些方案依赖于供体菌、受体菌和接合质粒之间可选择标记的差异分布。具体方法包括：1）天然接合质粒的鉴定；2）在固体培养基中定量测定接合频率；以及3）通过聚合酶链式反应（PCR）对转接合子受体中的抗生素抗性基因和质粒复制子类型进行诊断性检测。本文所述的实验方案是在研究水平基因转移的进化生态学背景下建立的，用于筛选环境中细菌所携带的带有抗生素抗性基因的接合质粒。实验中观察到接合质粒在培养条件下的高效转移，凸显了接合机制在促进水平基因转移、特别是抗生素抗性扩散方面的生物学重要性。

由于供体菌株 SW4955 和 SW7037 已完成测序，预计这两个供体菌株具有与其基因组序列中鉴定出的耐药基因谱相对应的耐药表型。质粒 p134797（来自 SW4955）携带赋予对第三代头孢菌素（blaCTX-M-55）、氨基糖苷类（aac(3)-IIa 和 aadA1）、苯酚类（catA2）、四环素类（tet(A)）、甲氧苄啶（dfrA14）以及磺胺类（sul3）耐药的基因；在 SW4955 染色体中未发现抗生素耐药基因。质粒 p101718（来自 SW7037）仅携带一个抗生素耐药基因（blaCMY-2），预计可赋予对第三代头孢菌素（blaCTX-M-55）的耐药性。同样，在 SW7037 染色体中也未发现抗生素耐药基因。
接合交配后，预期可检测到携带上述所有耐药基因的两种接合性质粒的转移。阳性接合检测结果表明，被鉴定为接合子的受体菌应已获得这些接合性质粒。同时预期在接合子中通过PCR检测到用于鉴定接合性质粒的特征性耐药基因的存在。
为了说明此处描述的方法，对两种 E. coli 通过接合转移质粒DNA的能力在环境分离株中进行了测试。实验设置的示意图如下所示 图1两名供者（E. coli SW4955 和 SW7037）以及一个受体（E. coli LMB100）分别进行接合。在接合质粒中发现的基因图谱 E. coli SW4955 (p134797) 和 SW7037 (p101718) 如图所示 图2.
使用羧苄青霉素筛选接合质粒，并利用利福平和链霉素进行反向筛选，这两种抗生素的抗性决定因子位于受体菌的染色体中。采用麦康凯琼脂区分乳糖阳性供体菌（形成较大、粉红色菌落）与受体菌及接合子（均为乳糖阴性，形成较小、淡黄色菌落）（图3）。
<img alt="在琼脂平板上细菌生长的比较；供体SW4955、SW7037和受体LMB100菌落的特写。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：MacConkey琼脂平板上供体与受体菌落不同颜色标记的示意图。 由于供体菌株能够发酵乳糖，在MacConkey琼脂平板上形成的菌落呈粉红色；而受体菌落因不能发酵乳糖（乳糖阴性），呈浅黄色且较小，由此可将两者区分开来。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
检测到接合性质粒p134797的转移，每种抗生素对应质粒中发现的五类不同抗生素抗性基因。
以菌株 SW4955 为例说明接合效率（CE）的计算方法。在菌株 SW4955 的实验中，10-2 稀释度的平板上计数得到 172 个转化子菌落形成单位（CFU）；相应稀释度（10-2）的受体菌计数为 10,300,000 CFU/mL（表 4）。
CE 的计算方法如下：
CE = (174 CFU/mL)/(10,300,000 CFU/mL)
CE = 1.67 × 10-5 接合子/受体菌
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">LMB100</td>
			<td>使用羧苄西林筛选的 SW4955 菌株接合子</td>
			<td rowspan="2">接合效率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释倍数</td>
			<td>菌落形成单位（可计数平板）</td>
			<td>约菌落形成单位/毫升</td>
			<td>菌落形成单位（可计数平板）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>菌苔状生长</td>
			<td>1.03E+09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-1</td>
			<td>菌苔状生长</td>
			<td>1.03E+08</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-2</td>
			<td>菌苔状生长</td>
			<td>10300000</td>
			<td>172</td>
			<td>1.67 x 10-5 接合子/受体菌</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-3</td>
			<td>菌苔状生长</td>
			<td>1030000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-4</td>
			<td>菌苔状生长</td>
			<td>103000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-5</td>
			<td>菌苔状生长</td>
			<td>10300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-6</td>
			<td>菌苔状生长</td>
			<td>1030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-7</td>
			<td>103</td>
			<td>103</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">用于计算接合效率（CE）的数值以粗体标出。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：大肠杆菌SW4955菌株偶联效率（CE）计算示例。
结果如表5所示，以每个受体细胞的接合效率表示。使用菌株SW4955作为供体获得的五个接合效率均处于同一数量级。这些结果表明，无论采用何种筛选方法来鉴定接合子，均可检测到接合质粒的转移能力。
以菌株SW7037作为供体时，接合效率降低了三个数量级；这些结果可用于比较不同供体和质粒类型在相同受体中的接合效率。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="5">接合效率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>菌株</td>
			<td>羧苄青霉素 (100 mg/L)</td>
			<td>庆大霉素 (2 mg/L)</td>
			<td>氯霉素 (25 mg/L)</td>
			<td>四环素 (10 mg/L)</td>
			<td>甲氧苄啶 (20 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW4955</td>
			<td>1.67 x 10-5</td>
			<td>5.67 x 10-5</td>
			<td>2.17 x 10-5</td>
			<td>7.62 x 10-5</td>
			<td>1.36 x 10-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW7037</td>
			<td>2.14 x 10-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：偶联效率 E. coli 供体菌株 SW4955 和 SW7037，取决于 用于筛选的抗生素。
在接合子中，通过PCR检测了两种测试接合质粒及其相应复制子所携带的所有复制子和耐药基因的存在情况。这些诊断性PCR反应所用的条件见表3。
诊断凝胶电泳结果见 图4。这些凝胶证实了在接合子中存在预期的复制子（p1347975中的IncFIC和IncFIB，以及p101718中的IncI1）。同时也证实了预期的抗生素耐药基因的存在，即p1347975中含有blaCTX-M-55组（β-内酰胺类）、aac(3)-II和aadA（氨基糖苷类）、catA2（氯霉素类）、tet(A)（四环素类）、dfrA14（甲氧苄啶类）以及sul3（磺胺类）基因，而p101718中含有blaCMY-2 基因（图4）。
<img alt="凝胶电泳结果；DNA条带模式；1 kb DNA标记；分子分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4诊断性电泳凝胶 供体细胞（菌株 SW4955 和 SW7037）及相应 LMB100 转接合子中接合性质粒 p134797 和 p101718 所携带的抗生素抗性基因和质粒复制子的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳分析。质粒筛选使用羧苄西林。缩写：-：阴性对照（使用菌株 LMB100 的 DNA 作为阴性对照）；D：供体；T：转接合子。预期扩增片段大小： blaCTX-M-55：864 bp； aac(3)-IIa：237 bp； aadA1: 283 bp catA2 225 bp；tet(A)：957 bp； dfrA14：302 bp； sul3：799 bp；IncFIC(FII)：262 bp；IncFIB：683 bp blaCMY-2：1,855 bp；IncI1-I：139 bp。凝胶含1%琼脂糖。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

接合作用通过在两个不同细胞之间转移质粒DNA介导水平基因转移，促进有益基因的传播。本研究描述了一种广泛使用的方法，用于高效检测接合性质粒的转移，该方法基于在接合性质粒、供体和受体中使用差异标记来检测转接合子。

由天然接合性质粒介导的水平基因转移检测 E. coli

接合转移是促进革兰氏阴性细菌水平基因转移的主要机制之一。本研究描述了用于……的方法

大肠杆菌等细菌在接合性质粒中携带抗生素抗性基因。这类细菌可在医院中发现，作为共生菌存在于动物体内，也可存在于水生环境中。天然接合性质粒可在不同细菌谱系之间进行基因的水平转移。我们介绍了用于检测接合性质粒及形成接合效率的金属方法。该技术简单且灵敏，其灵敏性源于使用了针对质粒、供体和受体的标记物。这些标记具有可选择性，意味着它们能够在非常大的群体中识别单个事件。我们提供的方案可用于研究抗生素耐药性的演化以及流行病学监测，即监控耐药基因的传播情况。演示该实验流程的是我实验室的博士研究生 Caison Warner 和来自 CAMS 实验室的本科生 Pepper St.Clair。第一天，将供体菌和受体菌分别从甘油保存液中划线接种至C培养基（即不含抗生素的麦康凯琼脂），于37摄氏度培养过夜。第二天，为每个供体菌和受体菌标记一支14毫升的培养管。分别挑取单个供体菌和受体菌菌落，接种于2毫升MH肉汤（Mueller Hinton Broth）中，在37摄氏度、200 RPM条件下振荡培养18小时。第三天，取过夜培养的菌液，用生理盐水稀释10倍后，在600纳米波长下测定其光密度，测定前勿涡旋振荡。如有需要，可用无菌生理盐水调节光密度至2。标记一个1.5毫升微量离心管为接合管，并注明供体菌和受体菌株。将每个供体和受体的调整后菌悬液各500微升转移至接合管中，通过轻柔颠倒混匀菌悬液。在室温下以500 × g离心接合管10分钟。用移液器小心吸出800微升上清液，避免扰动沉淀，保留200微升在管中。将接合管在37摄氏度下孵育18小时。此外，作为阴性对照，将供体菌的过夜培养物划线接种于B培养基，受体菌接种于A培养基，并在37摄氏度下倒置培养过夜。培养后，在第四天，向接合反应管中加入800 µL生理盐水，通过涡旋振荡重悬菌体。对接合菌液进行系列稀释，取每种稀释液100 µL接种于培养基平板上。平板干燥后，在37摄氏度下孵育18小时，并按照文中所述方法计算每个供体或受体的接合频率。使用简单的煮沸法提取细菌细胞壁中的DNA后，将所需的PCR管标记为“混合样本”，并注明基因名称和样品名称。在标记为“混合样本”的离心管中加入无菌水、PCR预混液、引物和聚合酶。在低温环境中，通过移液器上下吹打至少10次，轻柔混匀。将模板DNA加入对应的PCR管中，并盖紧管盖。将PCR管放入热循环仪中，按照文稿所述程序开始扩增耐药基因和复制子。为确认扩增子，取250毫升锥形瓶加入琼脂糖和TAE缓冲液，配制1%琼脂糖凝胶，用微波炉加热溶解琼脂糖。待琼脂糖溶液冷却至约55摄氏度后，在通风橱内加入6微升SYBR Green染料并混匀。将凝胶倒入用胶带密封的制胶槽中，防止漏液，静置15至25分钟，直至凝胶出现浑浊现象，表明已凝固。去除胶带后，将凝胶放入电泳槽中，并加入TAE缓冲液至完全覆盖凝胶。用移液器吸取5微升6倍DNA上样缓冲液与25微升各反应产物混合，上下吹打至少10次以充分混匀。然后将混合液上样至加样孔中，注意避免产生气泡。将 4 µL 的 1 千碱基对 DNA 标准品加入第一孔后，盖上电泳槽盖，于 120 伏特和 400 毫安条件下电泳 60 分钟。在紫外光下观察凝胶并记录图像。麦康凯琼脂可区分乳糖阳性供体菌（形成较大的粉红色菌落）与受体菌及接合子（均为乳糖阴性，形成较小的浅黄色菌落）。供体菌株SSW4955的五种接合效率均处于同一数量级，表明无论采用何种筛选方法鉴定接合子，均可检测到接合质粒的转移。而供体菌株SSW7037的接合效率低了三倍，这使得能够利用相同的受体菌比较不同供体菌和质粒类型的接合效率。PCR产物的凝胶电泳结果证实了接合子中含有预期的复制子。该实验完全依赖于可选择标记。必须设置对照以确认每次筛选均有效，且需通过比色法或PCR确认接合子。这一大规模检测可移动质粒的方案将极大地增进我们对基因在环境中流动的理解，并有助于研究影响接合转移效率的各种变量。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

大肠杆菌中天然偶联质粒介导的水平基因转移检测

来源： Erdogan, F.,et al., 用于分析细菌接合中转移蛋白序列特异性的接合交配实验。J. Vis. Exp. (2017)本视频演示了使用救援质粒将F质粒从供体菌转移至受体菌大肠杆菌（E.

F质粒转移及大肠杆菌中的双重抗生素筛选

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用于细菌接合转移蛋白序列特异性分析的接合交配实验

我们在此描述三种不同的方案 体外 接合、转导和自然转化的研究...

Staphylococcus aureus中水平基因转移研究的方法学

本文介绍了一种用于检验多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中作用的实验方法。...

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高分辨率细菌接合频率比较

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实验进化方法中质粒介导的抗生素抗性定量分析

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基于纳米孔测序技术流程的长读长质粒测序与组装

本文介绍了在实验室中饲养中间型胚发育甲虫——斑拟 beetles（Dermestes maculatus，D.

中国台湾甲虫 Dermestes maculatus 的饲养及双链RNA介导的基因敲低

通过同源重组生成的基因敲除突变体是基因功能研究的金标准。本文介绍了用于快速构建敲除载体的 OSCAR（一步法构建农杆菌重组就绪质粒）方法。 农杆菌...

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近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

了解检测大肠杆菌中天然偶联质粒介导的水平基因转移方法。该技术利用差异标记高效识别接合事件，为研究抗生素耐药性进化和流行病学监测提供高灵敏度工具。

由天然接合性质粒介导的水平基因转移检测 E. coli

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