由天然接合性质粒介导的水平基因转移检测 E. coli

大肠杆菌等细菌在接合性质粒中携带抗生素抗性基因。这类细菌可在医院中发现，作为共生菌存在于动物体内，也可存在于水生环境中。天然接合性质粒可在不同细菌谱系之间进行基因的水平转移。

我们介绍了用于检测接合性质粒及形成接合效率的金属方法。该技术简单且灵敏，其灵敏性源于使用了针对质粒、供体和受体的标记物。

这些标记具有可选择性，意味着它们能够在非常大的群体中识别单个事件。我们提供的方案可用于研究抗生素耐药性的演化以及流行病学监测，即监控耐药基因的传播情况。演示该实验流程的是我实验室的博士研究生 Caison Warner 和来自 CAMS 实验室的本科生 Pepper St.Clair。

第一天，将供体菌和受体菌分别从甘油保存液中划线接种至C培养基（即不含抗生素的麦康凯琼脂），于37摄氏度培养过夜。第二天，为每个供体菌和受体菌标记一支14毫升的培养管。分别挑取单个供体菌和受体菌菌落，接种于2毫升MH肉汤（Mueller Hinton Broth）中，在37摄氏度、200 RPM条件下振荡培养18小时。

第三天，取过夜培养的菌液，用生理盐水稀释10倍后，在600纳米波长下测定其光密度，测定前勿涡旋振荡。如有需要，可用无菌生理盐水调节光密度至2。标记一个1.5毫升微量离心管为接合管，并注明供体菌和受体菌株。

将每个供体和受体的调整后菌悬液各500微升转移至接合管中，通过轻柔颠倒混匀菌悬液。在室温下以500 × g离心接合管10分钟。用移液器小心吸出800微升上清液，避免扰动沉淀，保留200微升在管中。将接合管在37摄氏度下孵育18小时。

此外，作为阴性对照，将供体菌的过夜培养物划线接种于B培养基，受体菌接种于A培养基，并在37摄氏度下倒置培养过夜。培养后，在第四天，向接合反应管中加入800 µL生理盐水，通过涡旋振荡重悬菌体。对接合菌液进行系列稀释，取每种稀释液100 µL接种于培养基平板上。

平板干燥后，在37摄氏度下孵育18小时，并按照文中所述方法计算每个供体或受体的接合频率。使用简单的煮沸法提取细菌细胞壁中的DNA后，将所需的PCR管标记为“混合样本”，并注明基因名称和样品名称。在标记为“混合样本”的离心管中加入无菌水、PCR预混液、引物和聚合酶。

在低温环境中，通过移液器上下吹打至少10次，轻柔混匀。将模板DNA加入对应的PCR管中，并盖紧管盖。将PCR管放入热循环仪中，按照文稿所述程序开始扩增耐药基因和复制子。

为确认扩增子，取250毫升锥形瓶加入琼脂糖和TAE缓冲液，配制1%琼脂糖凝胶，用微波炉加热溶解琼脂糖。待琼脂糖溶液冷却至约55摄氏度后，在通风橱内加入6微升SYBR Green染料并混匀。将凝胶倒入用胶带密封的制胶槽中，防止漏液，静置15至25分钟，直至凝胶出现浑浊现象，表明已凝固。

去除胶带后，将凝胶放入电泳槽中，并加入TAE缓冲液至完全覆盖凝胶。用移液器吸取5微升6倍DNA上样缓冲液与25微升各反应产物混合，上下吹打至少10次以充分混匀。然后将混合液上样至加样孔中，注意避免产生气泡。

将 4 µL 的 1 千碱基对 DNA 标准品加入第一孔后，盖上电泳槽盖，于 120 伏特和 400 毫安条件下电泳 60 分钟。在紫外光下观察凝胶并记录图像。麦康凯琼脂可区分乳糖阳性供体菌（形成较大的粉红色菌落）与受体菌及接合子（均为乳糖阴性，形成较小的浅黄色菌落）。

供体菌株SSW4955的五种接合效率均处于同一数量级，表明无论采用何种筛选方法鉴定接合子，均可检测到接合质粒的转移。而供体菌株SSW7037的接合效率低了三倍，这使得能够利用相同的受体菌比较不同供体菌和质粒类型的接合效率。PCR产物的凝胶电泳结果证实了接合子中含有预期的复制子。

该实验完全依赖于可选择标记。必须设置对照以确认每次筛选均有效，且需通过比色法或PCR确认接合子。

这一大规模检测可移动质粒的方案将极大地增进我们对基因在环境中流动的理解，并有助于研究影响接合转移效率的各种变量。